TERCERA EDICIÓN Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica

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TERCERA EDICIÓN Pruebas Bioquímicas para la Identiﬁcación de Bacterias de Importancia Clínica Saúl Ruíz

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TERCERA

EDICIÓN

Pruebas Bioqu micas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica

w TERCERA

EDICIÓN

Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica

Jean F. MacFaddin MS, MT(ASCP), SM(AAM)

e d it o r ia l m e d ic a

panamericana BUENOS AIRES - BOGOTÁ - GARATAS - MADRID - MÉXICO - SAO PAUI.l) e-mail: iuVjLSiuedicapanamericana.com w\\»|jínedi. i,- p a namericana.com

Dedicado a mi hermana gemela, Joan M. Feustle

Prefacio D esd e q u e se p u b lic ó la se g u n d a e d ició n de P ru e b a s B io q u ím ic a s p a r a la Id en tifica c ió n d e B a cteria s d e Im p o rta n c ia C lín ica (1980), el ca m p o d e la b ac te rio lo g ía su frió ca m b io s e s p e c ta cu la re s en la clasific ac ió n y en la n o m e n c la tu ra b ac te ria n as; sin em b arg o , lo s m é to d o s b io q u ím ico s p a ra la id e n tifica ció n b ac te ria n a en los lab o ra to rio s clín ico s d e ru tin a p erm a n ec iero n b astan te co n stan tes co n el tran sc u rrir de los años, co n actu a liz ació n e in tro d u c ció n d e p ru eb as b io q u ím ica s nuevas. M ás d e 19 años d esp u és d e la seg u n d a ed ició n , los ca m b io s m ás im p o rtan tes se o b se rv a n en la n o m en clatu ra. L as rela cio n e s del D N A , el an álisis d e secu en cias d el rR N A , las rela cio n e s G + C y o tro s m é to d o s an a lítico s so fisticados p ro p o rc io n a ro n in fo rm ac ió n m ás p ro fu n d a so b re m u c h o s m ic ro o rg an ism o s. E stos ad elan to s p ro d u je ro n la rec lasific ac ió n y a m e n u d o la tran sfe re n cia de e sp ec ies a g én ero s d iferen tes o la n u ev a d e n o m inació n ju n to c o n la id e n tific a ció n de g én ero s nuevos. H ac e u n o s años el g én ero M icro c o cc u s p o se ía nu ev e esp ecies, en la ac tu a lid a d sólo ex isten dos; las otras esp ec ies se tran sfirie ro n a otros g éneros. A sim ism o , el n ú m e ro de esp ec ies se m u ltip lic ó en o rm e m en te en alg u n o s g én ero s; p o r ejem p lo , S ta p h y lo c o c cu s ah o ra p o se e 4 4 especies. H e in c lu id o nu ev e ca p ítu lo s de pru eb as b io q u ím ica s to ta lm e n te nuevos co n p ro ce d im ie n to s m u y utilizad o s: p ru e b a s de b a c itra c in a y su lfam eto x a zo l-trim e to p rim a (S X T ); p ru eb a s d e h i d ró lisis de su strato s in d o x flico s; p ru e b a de (3-lactam asa; p ru e b a d e lecitin asa; p ru e b a d e lipasa; p ru e b a d e se n sib ilid ad a la liso stafin a; p ru e b a d e p o rfirin a -á cid o S -am in o lev u lín ico (A L A ); p ru e b a de h id ró lisis de p irro lid o n il-P -n a ftilam id a (P Y R ), y facto res X y V. N o ca m b ié el fo rm ato , p ero actu alicé ca p ítu lo s an terio res cu an d o co rresp o n d ía, en esp ecial en lo q u e se refiere a la n o m e n cla tu ra actual. C o n el ag re g ad o d e cap ítu lo s n u ev o s, co n serv é lo s p ro ce d im ie n to s e stán d a r m ás antiguos q u e aú n se u tiliz a n en la m a y o r p arte d e los la b o ra to rio s de b a c te rio lo g ía y en las in stitu c io n es d ed ica d as a la en señ an za. L os cu a d ro s de id e n tifica ció n fu ero n d iv id id o s en co co s y b ac ilo s g ram p o sitiv o s y co co s y b ac ilo s g ram n eg ativ o s, y a q u e m u ch as b ac te ria s ex h ib en fo rm a s co co id es y b ac ilares. L o s m ie m b ro s de la fam ilia E n te ro b a cte riace ae se tratan en u n ca p ítu lo separado. M u c h o s e n c u e n tra n ú tiles los d ia g ra m as de flu jo diagn ó stico ; p o r lo tan to , lo s co n serv é p ara aq u ellas p e rso n as a q u ie n es les re su lta n b eneficiosos. L a clasific ac ió n (n o m en c latu ra ) de g én e ro y e sp ec ie se h a efe ctu a d o d e acu erd o co n la p ro p u e sta en los 5 v o lú m e n es d el M a n u a l de B ergey. A g ra d ez co a la C o m p añ ía d e P ro d u c c ió n d e B ergey p o r o rien tarm e p ara ac tu a liz ar to d o s lo s g én ero s y esp ecies. Q u iero a g ra d ece r de m a n e ra esp ec ial al d o c to r D av id Pow er, d e B D B io scie n ce s (antes B ecto n D ick in so n M ic ro b io lo g y S ystem s), p o r su in v alo rab le ay u d a en las b ib lio g ra fías, el m a te rial de p ru e b a y las fo to g rafías. T am bién a S co tt P u year, d e R E M E L L ab o rato rie s, y a M ik e C ox, de A n a e ro b e S y stem s, p o r p ro p o rc io n arm e las fo to g ra fías p ara los cap ítu lo s nuevos. Jea n F. M a cF a d d in

Contenido Prefacio Láminas color

vii 805

SECCIÓN I. PRUEBAS BIOQUÍMICAS INDIVIDUALES 1. 2. 3. 4.

Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) Pruebas de hidrólisis de bilis y esculina Pruebas de solubilidad en bilis Pruebas (reacciones) de CAM P/ CAMP inversa y prueba de inhibición CAMP (producción de fosfolipasa D) 5. Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 6. Pruebas de catalasa y peroxidasa 7. Prueba de citrato 8. Prueba de coagulasa 9. Pruebas de descarboxilasa (lisina-omitina-arginina) y prueba de dihidrolasa (arginina) 10. Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 11. Pruebas de [l-galactosidasa (ONPG y PNPG) 12. Pruebas de licuefacción de la gelatina 13. Prueba de oxidación del gluconato 14. Prueba de hidrólisis del hipurato 15. Prueba de ácido sulfhídrico 16. Prueba de indol 17. Pruebas de hidrólisis de sustratos indoxílicos 18. Pruebas en agar con hierro de Kligler/ triple azúcar y hierro 19. Prueba de (3-lactamasa 20. Prueba de lecitinasa 21. Prueba de leucina aminopeptidasa (leucina arilamidasa) (LAP) 22. Prueba de lipasa 23. Prueba de leche tornasolada 24. Prueba de sensibilidad a la lisostafina 25. Prueba de malonato 26. Prueba de reducción de la leche del azul de metileno para enterococos 27. Prueba de rojo de metilo 28. Prueba de movilidad 29. Pruebas de utilización de hidratos de carbono para Neisseria 30. Pruebas de reducción de nitratos /nitritos 31. Prueba del disco de optoquina 32. Prueba de oxidasa 33. Prueba de oxidación-fermentación 34. Prueba de fenilalanina desaminasa 35. Prueba de fosfatasa 36. Prueba de porfirina- ácido 5-aminolevulínico (ALA) 37. Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-P-naftilamida (PYR) 38. Prueba de hidrólisis del almidón 39. Prueba de ureasa 40. Prueba de Voges-Proskauer 41. Factores X y V

3 8 25 33 54 73 92 98 113 128 151 160 172 177 192 206 217 223 236 254 263 267 275 284 291 296 301 306 312 326 339 344 354 362 368 376 380 385 397 411 422

índice

SECCIÓN II. SISTEMAS DE PRUEBAS MÚLTIPLES 42.

Sistemas de pruebas múltiples

427

SECCIÓN III. ESQUEMAS DE IDENTIFICACIÓN__________________________________________ 43. Bacterias grampositivas 44. Bacterias gramnegativas 45. Familia Enterobacteriaceae gramnegativas y otras bacterias intestinales gramnegativas

451 580 673

SECCIÓN IV. APÉNDICES 1. Resultados fotográficos 2. Unidades de medición del sistema métrico 3. Indicadores de pH 4. Correcciones de pH 5. Estándares nefelométricos de McFarland 6. Preparaciones de reactivos 7. Sinónimos comunes en la terminología de los medios de cultivo 8. Tamaño estándar de los tubos de prueba para bacteriología 9. Conversiones de temperatura 10. Colecciones de cultivos: cultivos de referencia 11. Direcciones de proveedores comerciales 12. Glosario

SECCIÓN V. ÍNDICES ANALÍTICOS 1. General 2. Microorganismos

745 758 759 760 764 766 780 781 782 783 789 801

_____

____ 827 839

^0 •

SECCI ÓN

Pruebas bioquímicas individuales

CAPÍ TULO >

Pruebas de bacitracina/ sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) I.

PRINCIPIO

Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina o a bacitracina y sulfam etoxazol-tri metoprima (SXT).

II.

OBJETIVO

(Véase también cap. 43) A. Diferenciación presuntiva de estreptococos (3-hemolíticos del grupo A de otros estreptococos [i-hemolíticos. B. Ayudar a descartar los estreptococos no A y no B que pueden ser susceptibles a la bacitracina (5). La precisión de la prueba de la bacitracina se mejora por el uso de la sensibilidad a un disco de SXT en combinación con la bacitracina. El agregado de SXT junto con la bacitracina aumenta la sensibilidad y el valor predicüvo de la prueba de la bacitracina. Las sensibilidades de bacitracina/SXT todavía se emplean en los laboratorios donde no se dispone de pruebas confiables para la agrupación serológica. Una prueba más específica para identificar los estreptococos del grupo A es la prueba PYR (hidrólisis de la pirrolidonil-P-naftilamida); es mejor para la producción de la enzima piroglutamil amidasa (véase cap. 38).

III.

BIOQUÍMICA_______________________________________________________________

Bacitracina La bacitracina, un antibiótico aislado por primera vez a partir de Bacillus licheniformis (antes B. subtilis), pertenece a una clase de antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana. La bacitracina es un antibiótico peptídico compuesto por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. C ,H ,

C — CH — C

' CH, Phe His Asp Lys Leu Orn

fenilalanina histidina asparagina lisina leucina ornitina

nh2

ch2

I -

--------CH -

-C O -

■L-Lev

D-Asp D-glu D-Phe-L-His-L-Asp

L-lleu-D-Orn-L-Lys — — L-lleu

Bacitracina A Residuo de isoleucina y de cisterna, condensado para formar un anillo de tiazol (A) en lugar de la unión peptídica habitual de un polipéptido

Pruebas bioquímicas individuales

La bacitracina inhibe la síntesis de la pared celular, una estructura rígida que encierra la célula m icro biana. El esqueleto fundamental consiste en una estructura tridimensional compleja que contiene peptidoglucano, una macromolécula (mucopéptido o glucopéptido o mureína), y otros polímeros (p. ej., polisacáridos, lipoproteínas) que difieren en los distintos tipos de bacterias (7). La rigidez final de la pared celular es impartida por entrecruzamientos de las cadenas peptídicas y la capa del peptidoglucano es mu cho más gruesa en la pared celular de las bacterias grampositivas. La bacitracina inhibe una fase tempra na en la biosíntesis del peptidoglucano; inhibe la desfosforilación de un pirofosfato lipídico, un paso esen cial para la síntesis de la pared bacteriana (10), e inhibe el reciclado de ciertos metabolitos requeridos para mantener la síntesis del peptidoglucano (7). Los peptidoglucanos consisten en filamentos de polisacáridos largos interconectados por cuatro aminopéptidos en los que el tercer aminoácido es variable. La forma de interconexión entre las cadenas pep tídicas difiere entre las especies bacterianas. Existen dos clases de inhibidores de la síntesis de la pared celular: los inhibidores de la síntesis del pepti doglucano (p. ej., bacitracina) y los inhibidores de la síntesis o ensamblado de otros componentes de la pared. La bacitracina es a) bactericida, b) inactiva contra las células en reposo, y c) inactiva contra bacterias que carecen de pared celular. La bacitracina es bactericida durante el crecimiento, ya que las enzimas lí ricas ubicadas en la parte interna de la pared celular abren las cadenas del peptidoglucano para formar “extremos libres”. La pared celular luego se rompe y el citoplasma fluye hacia el exterior (7). La bacitracina es inactiva contra las células en reposo. Las enzimas líticas asociadas con la síntesis" de la pared celular son activas sólo cuando las células están en la etapa de crecimiento, no cuando están en reposo (7); por lo tanto, los inhibidores de la síntesis de la pared celular son inactivos contra las bacte rias en la fase estacionaria (7). La bacitracina A bloquea la fosforilasa que libera uno de los dos fosfatos terminales del lípido trans portador, el cual no puede funcionar entonces como un aceptor del muramilpentapéptido. La bacitracina no es específica, también puede inhibir otras reacciones de la fosforilasa (7).

Trimetoprima (TMP) La TMP (3,4,5-trimetoxibencil pirimidina) inhibe la reductasa del ácido dihidrofólico. Es un análogo estructural de la pirimidina de la fracción pteridina del ácido dihidrofólico que inhibe la enzima reducta sa, lo que en consecuencia interfiere con el metabolismo del ácido fólico, la posterior síntesis de pirimi dina y el metabolismo del fragmento de un carbono en la bacteria (10).

och3

Trimetoprima

La TMP inhibe la enzima bacteriana pero no la enzima de los mamíferos.

Sulfonamidas Las sulfonamidas derivan de la sulfanilamida. nh2

so 2nh

—

Estructura del anillo básico de las sulfonamidas

Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 5 Sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) La SXT inhibe de manera competitiva la modificación bacteriana del ácido p-aminobenzoico en dihidrofolato. La inhibición secuencial del metabolismo del folato impide por último la síntesis del DNA bac teriano (3). Dado que el sulfametoxazol (SX) y la TM P bloquean la vía metabólica del ácido fólico bacteriano en sitios diferentes, juntos producen el bloqueo secuencial, lo que determina un marcado incremento (sinergismo) de la actividad (3, 4). Ácido para-aminobenzoico

Dihidroptaroato sintetasa

- ......... inhibido por el sulfametoxazol

Dihidrofolato

Díhidrofolato reductasa

■> Diglicérido o ceramida

Modelo muy esquematizado del ataque de la fosfolipasa sobre la superficie de una membrana celular asimétrica de un gló bulo rojo humano. Abreviaturas: PLC, fosfolipasa C. (Redibujado en forma abreviada de Zwaal, R. F. A., Roelofsen, B. y Coo ley, C. M. (1973). Localization of red cell membrane constituents. Biochim. Biophys. Acta, 300, 178, con autorización de Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam.)

IV. MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: PLACAS DE AGAR CON SANGRE DE OVEJA (SBA, SBAP)________________________________________ Para cultivar todas las especies de Streptococcus deben utilizarse como medio de cultivo placas de agar con sangre (BA) ya que son microorganismos exigentes que requieren enriquecimientos adicionales pa ra el desarrollo. Debe utilizarse sangre citratada o desfibrinada de oveja o de buey ya que no ocurre reac ción con la sangre de caballo, conejo, cobayo ni humana (18). La presencia de (l-anliloxina en algunos lotes de sangre de oveja inhibe la producción de (3-toxina estafilocócica; para evitar esta posibilidad uti lizar sólo células (71).

V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD (,Nota: Utilizar controles positivos y negativos en form a simultánea. Probar ambas cepas de control de calidad (+ y - ) cada vez que se realice la prueba (4).) A. Prueba CAMP estandarizada Streptococcus agalactiae (+) Streptococcus pyogenes (-)

ATCC 27956 ATCC 19615

B. Identificación de Listeria 1. Con Staphylococcus aureus subesp, aureus a. Staphylococcus aureus subesp. aureus ATCC 12600 b. Listeria monocytogenes (+) ATCC 19112, NCTC 7973 (55). No utilizar ATCC 15313; no produce (3hemolisina y no produce hemólisis en la prueba CAMP (98)

Pruebas bioquímicas individuales Listeria seeligeri (+) C IP 100100 Listeria welshimeri ( - ) C IP 8149 2. Con R. equi a. Rhodococcus equi N C T C 1621 b. Listeria ivanovii (+) A TC C 19119 C. Listeria monocytogenes ( - ) N C T C 7973 (55) C.

VI. PRUEBAS CAMP A. Prueba CAMP estandarizada 1. Observaciones originales por Christie, Atkins, Munch-Petersen (18) y la prueba original ideada por Munch-Petersen, Christie, Simmons (71). 2. Procedimiento estandarizado de Darling (23). 3. Sustrato (3-lisina. a. Cultivo de S. aureus subesp. aureus. b. Cualquier cepa conocida para producir un nivel alto de p-lisina (58) (que exhibe por lo menos una banda de 4 m m o más grande de actividad de P-lisina (oscurecimiento) y una banda de m e nos de 2 mm de hemolisis completa en SBA (23)). 4. Microorganismos de prueba a. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h de especies conocidas de Streptococcus (Todd- Hewitt, SBA). b. Fase temprana de crecimiento. 5. Antes de su uso, las placas y las jarras con vela deben ser precalentadas a 37°C y deben estar secas. 6. Inoculaciones: inoculo denso (41, 110) a. Con una aguja de inoculación o borde de un ansa, estriar Staphylococcus en una línea recta que atraviese el centro de una placa de SBA. b. Estriar el microorganismo o los microorganismos de prueba en una línea recta de 2-3 cm de lar go y perpendicular (es decir, en ángulo recto) al inoculo estafilocócico sin tocar el inoculo

estafilocócico. c. Pueden estriarse cuatro microorganismos de prueba por placa. (1) M arcar los microorganismos de prueba (p. ej., 1, 2, 3, 4) sobre la mitad de abajo (base) de la placa de Petri antes de la inoculación. (2) Estriar dos de estos microorganismos de prueba a cada lado del centro del inoculo estafilo cócico. (Nota: Esta prueba se utiliza con frecuencia junto con las pruebas de bacitracina y trimetoprima-sulfametoxazol (TSM/SXT) en la misma placa de agar con sangre para la identificación presuntiva de es treptococos (59).)

7. Incubación: placas invertidas (tapas hacia abajo) a. Recomendado: sin C 0 2; 35°C, 18-24 h. La incubación en aerobiosis (aire ambiental) aumen ta la especificidad de la prueba debido a que muy pocos estreptococos no pertenecientes al grupo B son positivos en el aire (4). b. Con una jarra con vela (tensión de oxígeno reducida)

Pruebas CAMP/CAMP inversa y de inhibición CAMP (producción de fosfolipasa D) 43 (1) 5-10% de C 0 2 o incubadora de C 0 2. (2) 35°C; 5-6 h; si es negativa, continuar la incubación hasta las 18 h. Algunos estreptococos del grupo A serán CAMP positivos si se incuban en una jarra con vela, en una atmósfera de C 0 2 o en condiciones anaerobias (59). B. Prueba CAMP con especies de L isteria: el mismo procedimiento que para S. agalactiae (estrepto cocos del grupo B). L. monocytogenes sensu lato (en sentido amplio) en la actualidad se separan en cinco especies distin tas; la diferenciación se basa en la hemolisis en la prueba CAMP ya sea con S. aureus subesp. aureus o Rhodococcus equi (antes Corynebacterium equi) más la producción de ácido a partir de D-xilosa, L-ramnosa y a metil-D-manósido (85). Sobre la base de las observaciones realizadas por Fraser (33), el uso de sinergismo hemolítico con R. equi propuesto por otros investigadores (73, 90, 91) se explica por la pre sencia de fosfolipasa C (91) (cuadro 4-2).

Cuadro 4-2. Diferenciación de las especies de Listeria

E sp e cie s L. L. L. L. L.

m on o cyto g e n esa seeligeri (104, 105) iva n o vii0 in n o c u a f weishim eri (27, 86)

PH e m ólisis +a

CAM P co n S. aureus

P a tó g e n a

+b +

CAM P con R. equi

D -Xiiosa

a -m e til-D m a n ó sid o

A A

V V

A A

+ d

_[_ W

L-R am nosa

Datos de las reís. 86 y 98; w, positivo débil. a No todas las cepas de L. monocytogenes exhiben (S-hemólisis; la cepa del tipo ATCC 15313 es no hemolítica (y) en san gre equina, ovina y bovina (98); otras producen una zona estrecha, pero esto varía con las especies de sangre. b ÁTCC 15313, reacción negativa. c L. ivanovii separadas en L. ivanovii y L. ivanovii subesp. londoniensis , separadas por dos hidratos de carbono: L. ivanoviies ribosa positiva (A) y manosamina negativa (-), L ivanovii subesp. londoniensis es ribosa negativa (-) y manosamina positiva (A). dZona amplia o zonas múltiples observadas de manera habitual (98). e Un resultado CAMP positivo con R. equi es un marcador específico para identificar L. ivanovii (87). 1L. innocua puede inducir reacciones falsas positivas cuando desarrolla en agar con sangre y glucosa (79, 93).

Vil. RESULTADOS Véanse figuras 4-1 y 4-2 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII.

INTERPRETACIÓN

A. Reacción CAMP positiva (+) (23) 1. Producción de una característica zona en punta de flecha íí (llama) de hemolisis completa (clara) a. Localizada en el punto de la estría estafilocócica donde convergen y se superponen los produc tos de difusión de los dos microorganismos (factor CAMP y P-lisina) (12, 18, 23, 110) en el área entre el crecimiento de las dos cepas (110). b. La zona de hemolisis sinérgica se extiende en toda la profundidad del agar con sangre. c. La zona clara (hemolisis sinérgica) está rodeada por una zona más grande, oscurecida, donde la p-lisina estafilocócica alteró pero no produjo la lisis de los eritrocitos de oveja (72). 2. S. agalactiae del grupo B presuntivo. B. Reacción CAMP negativa (-) (23) 1. Ausencia del fenómeno en punta de flecha cuando se incuba en la jarra con vela o en condicio nes aerobias. 2. Posible aumento de la hemolisis en la zona de actividad de la P-lisina estafilocócica. a. Fenómeno sinérgico; sin reacción CAMP. b. Bacterias distintas de las especies de Streptococcus del grupo B (p. ej., estreptococos del grupo A).

Pruebas bioquímicas individuales

Cuando se evaluaba la prueba CAMP, Darling (23) incubó los microorganismos en estudio en los tres tipos de condiciones atmosféricas y encontró que todos los estreptococos del grupo B conocidos produ cían las reacciones características en punta de flecha positivas, por lo común dentro de las 5-6 h cuando se incubaban en anaerobiosis o en una jarra para extinción de la vela (tensión de oxígeno reducida) y den tro de las 18 h en aerobiosis. Los estreptococos del grupo A produjeron una reacción positiva en punta de flecha sólo en anaerobiosis si bien exhibieron un aumento de la hemolisis en la zona de actividad de la Plisina estafilocócica tanto en la jarra con vela como en aerobiosis. En condiciones anaerobias, las puntas de flecha del grupo B eran por lo menos dos veces más grandes que las del grupo A. Los grupos C y G fueron negativos en las tres condiciones atmosféricas (cuadro 4-3).

Cuadro 4-3. Condiciones atmosféricas para la prueba CAMP Estreptococos Anaerobiosis }. 5-6 h Jarra con vela J 18 h Aerobiosis

Grupo B 11 1í 11

Grupo A

Grupos C + G

—

T H H

11, reacción CAMP positiva en punta de flecha; t , reacción CAMP positiva en punta de flecha más pequeña; H, hemoli sis aumentada en la zona de actividad de la p-lisina.

Darling (23) recomienda que la expresión “prueba (reacción) CAM P” se reserve para las observacio nes originales de Christie y col. (18) y que la potenciación de la hemolisis en una zona de P-lisina estafi locócica con otras bacterias o sus productos no se informe como “CAMP positiva” sino como “efecto he-

molítico sinérgico”. IX. PRUEBA CAMP INVERSA (REVERSE CAMP TEST: RCT)________________________ A. Esta modificación de la prueba CAMP original (18, 71) utiliza la a-toxina de C. perfringens (41). 1. La P-lisina es reemplazada por la a-toxina (a-lisina, a-hem olisina); alterna con la prueba de Nagler (prueba de detección de a-lecitinasa). 2. Utiliza agar con sangre humana (HBA). B. Objetivo: discriminación presuntiva de C. perfringens (+) de otras especies de Clostridium formadoras de esporas y reductoras de sulfitos (-) ; altamente específica para C. perfringens. C. Bioquímica: fenómeno de hemolisis sinérgica con el factor CAMP; la a-toxina contiene una fracción C de la esfingomielinasa similar a la de S. aureus subesp. aureus y una fgsfolipasa C (lecitinasa) de es pectro más extendido que hidroliza lecitina, esfmgomielina y cefalina (19, 66). D. Procedimiento de Hansen y Elliott (42) 1. Especies de Clostridium reemplazan al S. aureus subesp. aureus y se utiliza un estreptococo del grupo B conocido (S. agalactiae). 2. Inoculación directa de la muestra. 3. Inocular en ángulos rectos 1-2 mm hacia dentro de los estreptococos P-hemolíticos del grupo B en el agar con sangre de oveja (SBA). a. Pueden probarse cuatro cultivos por placa, b. Utilizar controles positivos y negativos conocidos: Clostridium perfringens (+ ) Clostridium bifermentans (lecitinasa positivo) ( - ) Streptococcus agalactiae

ATCC 13124 A TC C 638 N C T C 8181

4. Incubar en anaerobiosis (GasPak), 35°C, 18-24 h; leer bajo luz transmitida (4). E. Interpretación (42) 1. RCI-positiva: patrón en “corbata de lazo” o “flecha inversa” de la hemolisis en la unión de los dos cultivos; la punta de la flecha apunta de la especie Streptococcus hacia C. perfringens (59). Una reacción positiva indica sólo C. perfringens. 2. RCT, ±: zona de p-hemólisis en forma de bala a. Puede deberse a proporciones menos óptimas de enzima en relación con el factor CAM P o pue de deberse a niveles bajos de a-toxina (42). b. C. perfringens, otras especies de Clostridium (42).

Pruebas CAMP/CAMP inversa y de inhibición CAMP (producción de fosfolipasa D) 45 Según Buchanan (14), se requiere hemolisina o lecitinasa (o ambas) “libre” para una reacción CAMP inversa positiva.

X. DETECCIÓN DE FOSFOLIPASA D (PLD) POR INHIBICIÓN DE LA PRUEBA CAMP A. Objetivo: diferenciación de C. pseudotuberculosis (C. ovis) (+) y C. ulcerans (+) de otras especies de Corynebacterium (-) (4). B. Principio: la fosfolipasa D de las corinebacterias, “toxina ovis”, es una esfingomielinasa (61, 62) que inhibe el aumento de la hemolisis observado cuando las hemolisinas de S. aureus subesp. aureus y S. agalactiae interactúan de manera sinérgica (CAMP positiva) (4). La PLD hidroliza las esfingomielinas a A-acilesfingosil fosfatos (101,102). La capacidad de los productos de estas dos especies (C. pseudotuberculosis y C. ulcerans) para bloquear la actividad hem olítica de la P-lisina (fosfolipasa C de S. aureus subesp. aureus) (18, 29, 34, 47) y la de la a-toxina de C. petfringens (99) y sus actividades de PLD es en ambos casos similar (38, 63, 100, 101). C. Microorganismos de prueba (4); cultivos recientes, de 18 a 24 h, en agar con sangre de oveja (SBA). 1. S. aureus subesp. aureus cepa productora de P-toxina. 2. S. agalactiae: cepa CAM P positiva. 3. Control positivo: C. ulcerans; C. ulcerans estándar aún no fue designado para esta prueba (4). 4. Cepa de Corynebacterium desconocida. D. Procedimiento (4) 1. Medio: placa de agar con sangre de oveja (SBA) al 5Sí^mr 2. Inoculo: hisopos de algodón estériles de cada microorganismo. 3. Inoculación: (véase la figura). 4. Incubación: 35°C, 18-24 h. 5. Interpretación (4) a. PLD positiva (+) (1) Inhibición del aumento de la zona de hemolisis formada en la unión de la hemolisina estafilocócica y la hemolisis estreptocócica. Banda estrechada del incremento de la hemolisis (véase figura) (2) C. pseudotuberculosis o C. ulcerans. b. PLD negativa ( - ) : ausencia de estrechamiento de la banda del incremento de la hemolisis; otras especies de Corynebacterium.

Banda estrechada del incremento de la hemolisis S. aureus C. ulcerans (control)

S. agalactiae

Barksdale y col. (2) encontraron que todas las cepas de C. pseudotuberculosisty C. ulcerans producen

PLD y ureasa y que entre las corinebacterias catalasa positivas, pirazinamidasa negativas, ellas solas pro ducen estas dos enzimas; las dos pueden ser distinguidas con facilidad sobre la base de la fermentación del almidón (C. ulcerans es positivo; C. pseudotuberculosis, negativo).

XI. PRUEBAS ALTERNATIVAS A. Prueba CAMP en disco 1. Procedimiento de Wilkinson (110), una modificación de la pmeba CAMP original (18,71), sustituye un cultivo de estafilococos con discos de papel impregnados (es decir, saturados) con P-hemolisina

Pruebas bioquímicas individuales

2. 3.

parcialmente purificada proveniente de S. aureus subesp. aureus. Es necesario mantener un cultivo stock de estafilococos. Se dispone de discos comerciales (REMEL). Conservación: refrigerador o congelador, -20°C (31). a. Los discos no son confiables si se almacenan a 4-8°C, incluso durante un tiempo breve. b. Estable hasta 1 mes a -20°C. Procedimiento a. Colocar el disco a 1-2 mm del extremo de una única estría de Streptococcus. b. Incubar en una jarra para extinción de la vela, 35°C, 18-24 h. Interpretación a. Reacción CAM P positiva: área con forma de media luna por incremento de la lisis entre la es tría del estreptococo y el disco que contiene [3-lisina. b. Reacción CAMP intermedia: las áreas de incremento de la lisis se desarrollan en formas dis tintas de una m edia luna (o punta de flecha); las áreas de lisis son por lo general más pequeñas que las observadas con el resultado CAM P positivo habitual y están bien separadas (32).

B. Prueba CAMP de la mancha 1. Procedimiento de Ratner, Weeks y Stratton (81); una prueba rápida que elimina el subcultivo. 2. Reactivo (3-lisina a. Fuente: cultivo de S. aureus subesp. aureus ATCC 12600 en caldo de Todd-Hewitt (THB); 35°C, 48 h. b. Preparación: centrifugar y decantar de manera aséptica el sobrenadante mediante un filtro bac teriológico de 0,45 ( en un recipiente estéril. c. Conservación: congelado, (70°C; descongelar según necesidad. 3. Procedimiento a. Placas de agar con sangre: tripticasa soja agar (TSA) con sangre de oveja al 5%. b. Con una pipeta Pasteur, colocar una gota de reactivo (3-lisina al lado de la(s) colonia(s) |3-hemolítica(s). c. M antener a temperatura ambiente (22-25°C) (con la tapa hacia arriba), 20-30 min. 4. Reacción CAMP positiva: arco o círculo con incremento de la hemolisis al lado de la(s) colonia(s) donde cayó el reactivo; estreptococos del grupo B. Ratner y col. (81) obtuvieron una sensibilidad de la prueba de la mancha de 99% y una especificidad de 100%. Resultados similares fueron obtenidos por otros investigadores (26, 31, 36, 54, 78).

XII. PRECAUCIONES A. Generales 1. La superficie de las placas de agar debe estar completamente seca; cualquier condensación facili tará la diseminación, el escurrimiento y la mezcla del inoculo (35). 2. Debe utilizarse sangre citratada o desfibrinada de oveja o de buey; no se producirá reacción con sangre de caballo, humana, de conejo o de cobayo (18). 3. Puede utilizarse cualquier tamaño de placa; sin embargo, la profundidad del agar sangre en el cen tro debe ser de cerca de 1,5 mm (23). A medida que aumenta la profundidad, las puntas de flecha de la hemolisis se tom an menos separadas (23). La reacción sólo es positiva si la hemolisis sinérgica en la zona de la P-lisina se extiende en toda la profundidad del agar sangre. 4. Las placas con sangre de oveja y la jarra para extinción de la vela deben ser precalentadas a 37°C antes de su uso (23) para evitar la lisis calor-frío. 5. No se asegura una prueba exacta si los inóculos se cortan (23). Asimismo, después de la inoculación, es necesario evitar la inclinación de las placas hasta que el inoculo se haya absorbido en el agar; por otra parte, los inóculos pueden desparramarse en la placa (35), lo que daría resultados mixtos e inválidos. 6. Evitar la inoculación del medio de pm eba a partir del medio de aislamiento inicial; los cultivos mixtos no dan resultados válidos. 7. Las placas de prueba deben leerse lo más pronto posible después de un período de incubación apro piado; si permanecen a temperatura ambiente (25°C) durante cierto período de tiempo, la interpre tación es difícil debido a la lisis calor-frío de los eritrocitos de oveja (41). 8. El tamaño de la zona depende de la cantidad de producto bacteriano y de su capacidad de difusión en el medio (41).

Pruebas CAMP/CAMP inversa y de inhibición CAMP (producción de fosfolipasa D) 47 9. La P-lisina requiere calcio (Ca) para su actividad y por eso es inactiva en presencia de iones como fosfato, citrato o fluoruro, que secuestran este metal (66).

B. Prueba CAMP estándar con S. aureus subesp. aureus 1. Antes de ser probados para la reacción CAMP, los microorganismos |3-hemolíticos deben ser iden tificados como miembros del género Streptococcus mediante una prueba de catalasa y una colora ción de Gram. Todas las especies de Streptococcus son cocos grampositivos dispuestos en cadenas, pares o en forma aislada, catalasa negativos. Otros cocos grampositivos (p. ej., algunos estafiloco cos) y algunos bacilos gramnegativos (48) pueden dar una reacción CAM P positiva. 2. Esta prueba CAM P se utiliza para ayudar en la identificación de estreptococos del grupo B. No debe confiarse en una única prueba para la identificación presuntiva de los microorganismos hu manos o bovinos del grupo B; una reacción CAMP positiva debe utilizarse en combinación con otras pruebas y criterios (p. ej., morfología de la colonia, origen del material clínico, bacitracina, PYR: (L-pirrolidonil-P-naftilamida). Sin embargo, no es necesario realizar la hidrólisis del hipurato y la prueba CAMP; utilizar sólo una. Una prueba serológica es el único medio de confirmar la identificación del grupo B. La sensibilidad a la bacitracina, a la PYR o a la trimetoprima-sulfametoxazoi (TSM o SXT) y la prueba CAMP, junto con el patrón hemolítico, deberían ser utilizados para identificar los estrep tococos del grupo B (cuadro 4-4). a. Grupo B presuntivo por la pm eba CAMP si Bacitracina resistente (R) (negativo) o PYR negativo o TSM-SXT resistente (R) CAMP positivo P- hemolítico b. Estreptococos de los grupo A o B separados por el patrón hemolítico (grupo B, una zona más pequeña de hemolisis) si Bacitracina sensible (S) (positivo) CAMP positivo P-hemolítico c. Grupo A presuntivo si Bacitracina sensible (S) (positivo) o PYR positivo CAMP positivo P-hemolítico d. Estreptococos p-hemolíticos que no son de los grupos A ni B si Bacitracina resistente (R) (negativo) o PYR negativo CAMP negativo P-Hemolítico

Cuadro 4-4. Identificación de especies de Streptococcus p-hemolítico M icro o rg a n is m o

B a citra cin a

TSM

CAM P

PYR

Grupo A presuntivo Grupo B presuntivo No son de los grupos A ni B No son de los grupos A ni B

S R R S

R R S S

+ -

TSM, trimetoprima-sulfametoxazoi; PYR, hidrólisis de pirrolidonil arilamidasa; S, sensible; R, resistente. Datos de la re ferencia 59.

3. Tanto los estreptococos humanos como los bovinos exhiben hemolisis (zona clara), pero el tipo hu mano muestra zonas de hemolisis más grandes alrededor de las colonias en las placas de agar con sangre después de una incubación de 24 h; las zonas del grupo B son relativamente estrechas (pe queñas) y nebulosas (9). 4. Esta prueba CAMP se utiliza sobre todo para la identificación dentro del género Streptococcus', sin em bargo, el fenómeno hemolítico sinérgico también se encuentra entre algunas especies de otros géneros y se utiliza para diferenciar especies: Pasteurella haemolytica (+) de P. multocida (-) (8,34) en agar con sangre de oveja. Asimismo, algunas cepas hemolíticas de estreptococos de los grupos E, P y U dan una

Pruebas bioquímicas individuales

reacción CAMP positiva (89) como lo hacen los grupos C, F y G (98). Otros microorganismos que son CAMP positivos o se dice que producen una reacción CAMP con p-lisina de S. aureus subesp. aureus incluyen L. monocytogenes (34), L. seeligeri (83, 84), Burkholderia pseiutomallei (34), Corynebacterium renale (34), Mobiluncus mulieris y Mobiluncus curtisii (103) y Propionibacterium (56). Los estudios realizados por Skalka y col. (94) mostraron que la P-lisina purificada de S. aureus subesp. aureus y la exotoxina de C. pseudotuberculosis daban una tisis sinérgica con la 8-hemolisina de S. aureus subesp. aureus y la e-hemolisina de los estafilococos coagulasa negativos. 5. Una variación de la reacción CAMP original condujo a la confusión acerca de cómo debe realizar se la prueba. Darling (23) estandarizó el procedimiento y la interpretación para evitar los resulta dos falsos positivos. En un comienzo, la prueba CAM P fue considerada 100% específica para los estreptococos del grupo B, todas las cepas, si el aislamiento inicial era hemolítico o no hemolítico (18, 71). Los estudios posteriores, dependientes de las condiciones de cultivo y de la evaluación de las zonas líricas, mostraron reacciones positivas en 20-100% de los estreptococos del grupo A y en tina cantidad de cepas C y G. aunque muchas reacciones eran más débiles que las del grupo B (41). Al mismo tiempo, hasta 5% del grupo B dieron resultados negativos (2 3 ,3 0 ,4 9 ,5 4 ,6 4 ,9 5 ). Los estudios posteriores realizados por Bam um (3), Esseveld y col. (30), Biechteler (7), Pulverer (80) y Heeschen y col. (49) mostraron una sensibilidad promedio de 98,4%. En 1976, los estudios realizados por Jokipii y Jokipii (54) mostraron 95% de sensibilidad. 6. U na concentración alta de p-antitoxina en algunos lotes de sangre de oveja o de buey y algunos otros tipos inhibirán la producción de P-toxina estafilocócica (P-lisina) y conducirán a resultados falsos negativos (23); esto se evita si se utilizan sólo eritrocitos (23, 71). 7. Darting (23) utilizó la cepa 681 de S. aureus. Cualquier cepa viable que produce una banda de 4 mm o mayor de actividad de P-lisina (oscurecimiento) y una banda de menos 2 mm de hemolisis completa en SBA es satisfactoria para la prueba CAMP. Sin embargo, puede requerirse una incu bación de 18 h antes de que sea discernible un resultado positivo (23). U na zona estrecha de he molisis com pleta alrededor de la colonia y una zona exterior bastante ancha de oscurecimiento (en negrecida) (eritrocitos parcialmente hemolizados) indican una buena producción de P-lisina con producción mínima de toxinas (41). El tipo de medio utilizado para mantener cultivos stock afecta la producción de P-lisina. El cal do nutritivo no es conveniente porque la hemotisina (lisina) se vuelve inactiva rápidamente, pero los caldos infusión de corazón (HI) e infusión de cerebro y corazón (BHI) rinden títulos altos (43). Haque y Baldwin (44) recomiendan el mantenimiento de S. aureus subesp. aureus en tripticasa soja agar (TSA) en pico de flauta y, antes de usarlo, estriar en SBA y seleccionar una única colonia ais lada para la estría de p-hemolisina en la placa CAMP. La cepa estafilocócica debe estar libre de imi tantes espontáneos capaces de producir otras hemolisinas y de interferir con la reacción CAMP (43). Los tubos en pico de flauta de TSA suprimen la aparición de estos mutantes; el agar protege la mo lécula de hemotisina de la desnaturalización; por lo tanto, la P-hemotisina que rinde el cultivo stock es alta (43). Sin embargo, la propagación continua en TSA reduce por último el rendimiento de Phemolisina y Haque y Baldwin (43) recomiendan mantener el cultivo por liofilización. 8. El inoculo debe ser suficiente como para producir un crecimiento confluente (110); la magnitud y la in tensidad de la tisis dependen del tamaño del inoculo estafilocócico. Si el inóculo es demasiado liviano, de modo que el crecimiento es menos confluente, la reacción tiende a ser muy débil y los microorga nismos de la prueba deben ser comprobados de nuevo con un inoculo estafilocócico más denso (41). 9. Si los inóculos no son perpendiculares entre sí, no ocurrirá la producción de hemolisis en puntas de flecha y se producirán resultados falsos positivos si la cepa desconocida no es un especie de Streptococcus (23) (p. ej., Staphylococcus epidermidis productor de 8-toxina que causa hemolisis sinérgica cuando se inocula de manera perpendicular a Staphylococcus productor de P-toxina (70)). 10. Se obtienen resultados rápidos cuando los inóculos de estreptococos y estafilococos se encuentran en una fase temprana de crecimiento (23). 11. La reacción sólo es positiva si la hemólisis sinérgica en la zona de la P-lisina se extiende en toda la profundidad del agar con sangre. 12. El agente producido por las células estreptocócicas (factor CAMP) debe entrar en contacto con los glóbulos rojos de oveja o de buey antes que con la p-hemotisina estafilocócica (21). 13. No incubar más de 24 h; con la incubación más prolongada las zonas reactivas son tan grandes que es imposible leer las reacciones vecinas (35, 110). 14. Brown y col. (12) recomiendan sustituir la glucosa por maltosa en los medios de cultivo líquidos para estreptococos con objeto de incrementar la producción del factor CAMP.

Pruebas CAMP/CAMP inversa y de inhibición CAMP (producción de fosfolipasa D) 49 15. Según Oberhofer (76), los estreptococos (3-hemolíticos recuperados de localizaciones d istin tas de las fauces y todos los estreptococos no hemolíticos recuperados de sangre o líquido cefalorraquí deo deben ser probados de manera sistemática por la reacción CAM)', ya que no todos los estrep tococos del grupo B son hemolíticos (31, 76, 110). 16. La hemolisis sinérgica se observa con los aislamientos hemolíticos y no hemolíticos de los estrep tococos del grupo B (59). 17. Otros estreptococos, sobre todo los del grupo A, pueden producir lisis similar a la de los eritrocitos de oveja (104), lo que ocasiona reacciones CAMP falsas positivas (23, 30). El factor lírico sinérgico del grupo A corresponde a la estreptolisina O (SO) de los estreptococos del grupo A (104) produci da durante la fase de crecimiento logarítmico y Tapsall y Phillips (104) sugieren que la hemolisis si nérgica del grupo A se debe a la acción de cantidades pequeñas de estreptolisina que no están oxida das y por consiguiente pueden lisar los eritrocitos de oveja frágiles tratádos con (3-lisina. La estreptolisina O es una citolisina capaz de alterar las membranas del eritrocito y también de afectar la permeabilidad de membranas asociadas con organelas subcelulares (97). La actividad ocurre en un estado reducido y la SO se oxida con facilidad (50); el tiol y otros agentes reductores son utilizados para estimular la actividad máxima. La SO producida en cultivos líquidos no está completamente oxidada y alguna actividad está presente incluso en ausencia de agentes reducto res (50). La SO producida por los estreptococos del grupo A en la prueba CAMP tiene actividad suficiente para lisar glóbulos rojos de oveja frágiles (104). Las propiedades de la SO son distintas de las de la proteína CAMP de los estreptococos del gru po B (104). El factor CAM P conduce sólo a una ruptura no enzimática de los eritrocitos ovinos o bovinos vaciados de esfíngomielina, sin efecto sobre los eritrocitos de otras especies o sobre los eritrocitos intactos (6). Las condiciones de anaerobiosis incrementan la actividad de la SO (104). La reacción CAM P falsa positiva debida a los estreptococos del grupo A puede ser eliminada por el uso de inhibidores de la SO que no afectan de manera simultánea la (3-lisina estafilocócica o el factor CAM P del grupo B; esto produce un aumento de la especificidad sin pérdida de la sen sibilidad (104). Para eliminar los resultados falsos positivos, calentar los sobrenadantes del culti vo; esto tom a inactiva la SO termolábil del grupo A, sin inactivación del factor CAM P termoestable de los estreptococos del grupo B (104). C. Identificación de Listeria 1. El patrón hemolítico de L. monocytogenes varía (57, 91, 92); algunas cepas producen hemolisis débil en las placas de agar con sangre que pueden interpretarse con facilidad como un resultado negativo (86). La actividad hemolítica es un criterio fundamental para la diferenciación de las es pecies de Listeria (86); las cepas no hemolíticas (apatógenas) son irrelevantes (87). No todas las cepas de L. monocytogenes exhiben (3-hemólisis; la cepa del tipo ATCC 15313 es no hemolítica (y) en sangre equina, ovina y bovina (98); otras producen una zona estrecha, pero que varía con la fuente de la sangre (especies). La hemolisis de L. monocytogenes aumenta cuando se desarrolla cerca de S. aureus subesp. aureus (13, 40); L. monocytogenes produce fosfolipasa C (57, 60). 2. Los inóculos de Listeria pueden inducir un resultado CAM P falso positivo cuando el desarrollo se produce en agar sangre con glucosa (79, 93). 3. Rodríguez y col. (86) idearon una técnica en microplacas para determinar la actividad hemolítica de especies de Listeria para la tipificación sistemática de cepas de Listeria en lugar de la prueba CAMP. 4. Un resultado positivo de la prueba CAM P con R. equi es un marcador específico para identificar L ivanovii (87). 5. En el M anual de Bergey (88), L monocytogenes CAMP negativa y L. ivanovii CAMP positiva se adoptaron como criterios fundamentales para la identificación de especies hemolíticas de Listeria (82). Sin embargo, otros investigadores (1, 28, 33, 73, 82, 91, 107, 109) encontraron cepas de L monocytogenes que dan una reacción de hemolisis sinérgica CAM P positiva con R. equi. VázquezBoland y col. (107) mostraron que una zona bien definida, con forma circular o de raqueta, de hemólisis completa se desarrolla a partir de una estría de L. monocytogenes en la vecindad de R. equi, que difiere en intensidad de acuerdo con la actividad hem olítica de la cepa. El fenómeno lírico de L. monocytogenes podría distinguirse del de L. ivanovii, el cual presenta de manera característica una forma semicircular o de pala (108). Estos estudios también mostraron que en ciertos casos, en especial cuando se prueban cepas de L. monocytogenes muy hemolíticas y cuando la prueba se rea liza en agar con sangre en vez de utilizar eritrocitos lavados, las reacciones CAMP con R. equi de ambas especies de Listeria son similares y a menudo confusas. Nakazawa y Nemoto (73) sugieren

Pruebas bioquímicas individuales que los resultados discordantes provenientes de diferentes laboratorios podrían deberse al hecho de que las cepas de R. equi pueden diferir en su capacidad de interactuar con L monocytogenes. Vázquez-Boland y col. (108) utilizaron la cepa 5869 CIP (Collection de l ’Institut Pasteur) de R. equi, la que otros investigadores encontraron que daba resultados negativos con L. monocytoge nes (85). También mostraron que cepas diferentes e incluso subcultivos de la m isma cepa de R. equi difieren en su propiedad CAMP, lo cual produce resultados contradictorios. Por esto se reco mienda que los resultados de la prueba CAMP con R. equi como los definidos en la actualidad pa ra la identificación de Listeria (88) se interpreten con cautela (108).

D. Prueba CAMP inversa (RCT) 1. Los estreptococos del grupo B exhiben cierto grado de incremento de la hemolisis con otros clostridios; sin embargo, sólo C. perfringens produce la característica forma de punta de flecha (4). 2. Pueden ocurrir tanto resultados falsos positivos como falsos negativos (59). E. Detección de fosfolipasa D por la prueba de inhibición CAMP Actinomyces pyogenes y Arcanobacterium haemolyticum también son PLD positivos, pirazinamidasa negativos y catalasa negaúvos (4). REFERENCIAS 1. Anonymous. Note de Service du 16/3/1987, DGAL/ SVHA/N87/8041. Ministére de l’Agiculture, France. 2. Barksdale L, Linder R, Sulea IT, Pollice M. PhospholipaseD activity of Corynebacteriumpseudotuber culosis (Corynebacterium ovis) and Carynebacterium ulcerans, a distinctive marker within the genus Corynebacterium. J Clin Microbiol 1981,13(2):335343. 3. Barnum DA. The use of the CAMP test for the rapid identification of Streptococcus agalactiae. Report of the Ontario Veterinary College.l950:120-125. 4. Baron EJ, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnos tic Microbiology, ed 8. Philadelphia: CV Mosby, 1990:313,343,448,466. 5. Bemheimer AW, Linder R, Avigad LS. Nature and mechanism of action of the CAMP protein of group B streptococci. Infect Immun 1979, 23(3):838-844. 6. Bemheimer AW, Linder R, Avigad LS. Stepwise de gradation of membrane sphingomyelin by corynebacterial phospholipases. Infect Immun 1980;29(1): 123 131. 7. BiechtelerW.BeitragzurRoutine-Diagmstikhamolysierender Streptokokken (OBF-Test nach Guthoff, CAMP-test, Antibiogramm). Zentralbl Bakteriol 1964;193(l):48-56. 8. Bouley G. Epreuve de CAMP et distinction rapide entre Pasteurella haemolytica. Ann Inst Pasteur 1965;108(1): 129-131. 9. Braunstein H, Tucker EB, Gibson BC. Identification and significance of Streptococcus agalactiae (Lancefield group B). Am J Clin Pathol 1969;51(2) :207-213. 10. BretscherMS. Phosphatidyl-ethanolamine: Differen tial labelling in intac cells and cell ghoss of human erythrocytes by a membrane impermeable reagent. J Mol Biol 1972;71(3): 523-528. 11. Bretscher MS. Membrane structure: Some general principles. Science 1973;181:622-629. 12. Brown J, Farnsworth R, Wannamaker LW, Johnson DW. CAMP factor of group B streptococci: Produc tion, assay, and neutralization by sera from immunized rabbits and experimentally infected cows. Infect Immun 1974;9(2):377-383. 13. Brzin B, Seeliger HPR. A brief note on the CAMP phenomenon in Listeria. In: Woodbine W, ed. Pro blems of Listeriosis. Leicester, England: Leicester University Press, 1975:34-37.

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Pruebas bioquímicas individuales

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CAPÍTULO

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono I.

PRINCIPIO

Determinar la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un hidrato de carbono es pecífico incorporado en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible.

II.

OBJETIVO

(Véanse caps. 43-45) A. Los patrones de ferm entación por lo general son característicos para grupos bacterianos esp ecí ficos o especies; todos los m iem bros de la fam ilia E nterobacteriaceae son ferm entadores de de glucosa. B. Ayudar en la diferenciación entre géneros: Proteuspenneri (xilosa A (ácido)) de especies de Providen cia (xilosa -). C. Los patrones de utilización de los hidratos de carbono pueden a y u d a r en la diferenciación de las especies. 1. Microorganismos grampositivos a. Brochothrix campestris (ramnosa A) de Brochothrix thermosphacta (ramnosa -). b. Butyrivibrio fibrisolvens (sacarosa A) de Butyrivibrio crossotus (sacarosa -). c. Falcivibrio granáis (glucosa, galactosa, fructosa, maltosa, ribosa, todas A) de Falcivibrio vagi nalis (todas -). d. Listeria grayi (manitol A) de otras especies de Listeria (manitol -). e. Peptostreptococcus lactolyticus (lactosa A) de especies de Peptostreptococcus: P anaerobias, P. asaccharolyticus, P. hydmgenalis, P. indolicus, P. lacrimalis, P. magnus, P micros, P prevotii, P. tetradis y P. vagin*lis (todos lactosa -). f. Sarcina ventriculii (melibiosa A, xilosa - ) de Sarcina maxima (melibiosa - y xilosa A). g. Staphylococcus aureus subesp. aureus (xilosa A), S. arletlae (xilosa A) y S. xylose (xilosa A) de otras especies de Staphylococcus (xilosa -). 2. M icroorganism os gram negativos a. Alcaligenes xylosondans (xilosa A) de A. faecalis, A. latus y A. piechaudii (todos xilosa - ). b. Comámonos acidovorans (manitol A) de C. rerrigena y C. testosteroni (manitol - ) . c. Flavobacterium branchiophilum (celobiosa A) de F. aquatile (celobiosa - ) d. Haemophilus ducreyi (glucosa - ) de otras especies de Haemophilus (glucosa A). e. Kingella kingae (maltosa A) de K. denitrificans (maltosa - ). f. Neisseria lactamica (lactosa A) de otras especies de Neisseria (lactosa - ). 3. E nterob acteriaceae a. Escherichia fergusonii (adonitol A, arabitol A) de otras especies de Escherichia (adonitol - , arabitol - ). b. M organella morganii del biogrupo 2 (glicerol A) de M. morganii del biogrupo 1 (glicerol - ) . c. Pantoea agglomerans (salicina A) de Pantoea dispersa (salicina -). d. Proteus vulgaris (maltosa A) de Proteus mirabilis (maltosa - ) (21). e. Proteus penneri (xilosa A) de P. inconstans, P. myxofaciens y P. rettgeri (todos xilosa - ) .

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 55 III. BIOQUÍMICA Los hidratos de carbono se clasifican en: a) monosacáridos, aldeliídos pollúdroxilados o cetonas; b) polisacáridos u oligosacáridos, productos de la condensación de dos o más monosacáridos (polímeros de monosacáridos); o c) alcoholes polihídricos y cicl*toles, productos de la reducción de monosacáridos (7). Un monosacárido o azúcar simple por lo común contiene entre 1 y 6 átomos de carbono: la eritrosa es un azúcar de 4 carbonos (tetrosa, C4H80 4); la ribosa, la ribulosa, la xilosa y la arabinosa son azúcares de 5 carbonos (pentosas, C5H 10O 5); y la glucosa (dextrosa), la fructosa (levulosa), la galactosa y la mañosa son azúcares de 6 carbonos (hexosas, C6H 120 6) (9, 12). Entre las pentosas, la xilosa, la ribosa y la arabinosa son aldosas, mientras que la ribulosa es una cetosa (24). De los compuestos de hexosas, la glucosa, la ga lactosa y la mañosa son aldosas; la fructosa es un compuesto cetosa (24). Los disacáridos (C 12H220 11) son polisacáridos (oligosacáridos) compuestos por dos unidades de mo nosacáridos, glucosa más otro monosacárido. Sacarosa ----- > Glucosa + fructosa Maltosa ----- > 2 Unidades de glucosa Lactosa ----- » Glucosa + galactosa

Glucósido es un término general que denota un disacárido, sin tener en cuenta el azúcar presente (13). El trisacárido rafinosa (C18H 320 16) contiene tres monosacáridos: glucosa, fructosa y galactosa. Un ejemplo de un polisacárido es la inulina, que está compuesta por muchos polímeros del monosa cárido fructosa. Los alcoholes que se denominan en conjunto “azúcares” (9) son: adonitol, dulcitol, manitol y sorbi tol. Todos son alcoholes polihídricos, que son productos de la reducción de un monosacárido (7). Glucosa

reducc'°rl > Sorbitol (alcohol hexahidroxilado)

El inositol es un sustrato orgánico que no pertenece a los hidratos de carbono (9). Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son demasiado complejos para penetrar en una célula bac teriana para su degradación. Si pueden ser metabolizados por una especie bacteriana particular, primero son catabolizados a monosacáridos menos complejos por enzimas exocelulares (permeasas) para que pue dan ser incorporados al interior de la célula.

Cuadro 5-1. Clasificación de los hidratos de carbono utilizados con más frecuencia (9) Monosacáridos (azúcares simples) Tetrosa (4C), C4H80 4 Eritrosa Pentosas (5C), C5H10O5 Arabinosa Desoxirribosa Ribosa Ribulosa Xilosa Metilpentosa Ramnosa (isodulcitol) Hexosas (6C), C6H120 6 Galactosa Glucosa (dextrosa) Fructosa (levulosa) Mañosa Sorbosa Disacáridos (glucósidos), C12H2;;0 11 Amigdalina Celobiosa Lactosa (glucosa + galactosa) Maltosa (glucosa + glucosa) Melibiosa Datos de la referencia 9.

Salicina Sacarosa (sucrosa) (glucosa + fructosa) Trehalosa Trisacáridos, C18H320 16 Melecitosa Rafinosa (glucosa + galactosa + fructosa) Polisacáridos, (C6H10O5)n Celulosa Dextrinas Glucógeno Inulina Pectinas Almidón, soluble Alcoholes Adonitol Dulcitol Eritritol Glicerol Manitol Sorbitol Sustrato no hidrocarbonado Inositol

Pruebas bioquímicas individuales

La fermentación es un proceso metabólico anaerobio de oxidación-reducción, en el cual un sustra to orgánico actúa como el aceptor final de hidrógeno (aceptor de electrones) en lugar de oxígeno (31). La fermentación de sustratos orgánicos como los hidratos de carbono da por resultado productos finales reducidos y oxidados (31). Los productos finales provenientes de las fermentaciones de hidratos de car bono dependen de varios factores: a) el microorganismo que lleva a cabo el proceso de fermentación, b) el sustrato a ser fermentado, y c) a veces, factores ambientales como la temperatura y la acidez (31). Los hidratos de carbono y alcoholes, en conjunto denominados “azúcares” (9), rinden pocos productos fina les de fermentación: dos gases, hidrógeno y dióxido de carbono; unos pocos ácidos; unos pocos alcoho les y una cetona (22). Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa en anaerobiosis; otras oxidan la glucosa. Algunas pue den utilizar ambos mecanismos para su metabolismo, mientras que otras no pueden utilizar la glucosa por ningún mecanismo. No todos los monosacáridos son degradados por todas las especies bacterianas; sus patrones de fermentación difieren, lo que ayuda a la identificación en grupos, géneros o especies. Las bac terias también difieren en las vías metabólicas utililizadas para fermentar el mismo sustrato (25), lo que da por resultado distintos productos finales. La manera y la magnitud por las cuales un sustrato es catabolizado dependen de las especies bacterianas y de las condiciones de cultivo. El proceso de fermentación más común produce como producto final ácido láctico; sin embargo, ocu rren otras vías de fermentación, que difieren con respecto al sustrato metabolizado o al producto final pro ducido (31). Se pueden utilizar pruebas de hidratos de carbono para revelar los patrones de fermentación de una especie bacteriana particular por la observación de: a) la ausencia de glucósidos y/o b) la ausen cia de monosacáridos en disacáridos, trisacáridos y polisacáridos más complejos (9), las cuales demues tran que la glucosa fue metabolizada. Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono por lo común son anaerobias facultativas (16). En el proceso de fermentación, un hidrato de carbono se degrada y fracciona en dos triosas (16) (moléculas de carbono), que con posterioridad se degradan a una cantidad de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos (6). Los productos finales varían con cada especie bacteriana, lo que depende del sistema enzimático presen te en la especie y de las condiciones ambientales. El criterio importante es que antes de su degradación, la glucosa es fosforilada a un compuesto glucosa 6-fosfato (6). La fermentación requiere un compuesto orgánico como aceptor final de electrones. La principal vía fermentativa de degradación de la glucosa es la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), aunque la degradación puede ocurrir por vía o en combinación con el shunt (desviación) de la pentosa (vía de Warburg-Dickins, shunt de monofosfato de hexosa (HMP)) o vía de Entner-Doudoroff (ED)) (6). Sin embargo, las tres vías requieren la fosforilación inicial de la glucosa antes de que pueda ocurrir la degradación. 1 molécula de glucosa

glucosa 6-fosfato Vía de Embden-Meyerhof fructosa 6-fosfato fructosa 1,6-dlfosfato

ácido 6-fosfoglucónico

2 moles de gliceraldehído 3-fosfato 2 moles de ácido pirúvico

Shunt de la pentosa

Vía de E ntner-D oudoroff

ribulosa 5-fosfato

ácido 2 ceto~3-desoxi-6-fosfoglucónico

gliceraldehído 3-fosfato ácido pirúvico

ácido pirúvico

Vía de Em bden-M eyerhof

+ etanol

2 moles de ácido pirúvico

Tres vías de fermentación fosforilada (5)

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 57 H idrato de carbono (Disacárldo, trisacárido, polisacárido)

c6h, 2o6 Glucosa

I C H 3C O C O O H (intermediario principal) Ácido pirúvico

CH3COCH2COOH Ácido acetoacético

C H 3C O C H 3

--------

---------- ► CH3 CH2 CH2COOH

C 0 2 + Acetona

I C H 3C H O H C H 3 Alcohol isopropílico

Ácido butírico

ch3chohch2cooh Ácido p-hidroxibutírico

ch3ch2ch2ch2oh Alcohol butílico

(Redibujado de Pelczar, M. J. y Reid, R. D. M icro b io lo g y, 2nd ed., 1965, p. 139, con autorización de Mc Graw-Hill Book Co., New York.)

El ácido pirúvico (CH3COCOOH) es el intermediario principal en la degradación de la glucosa y el catabolismo del ácido pirúvico involucra muchos mecanismos diferentes que forman una variedad de pro ductos finales característicos de las fermentaciones bacterianas (6). Los monosacáridos son catabolizados como resultado de la oxidación a ácido pirúvico a través de una secuencia de pasos metabólicos m e diados por enzimas específicas. Las bacterias pueden utilizar vías diferentes para formar ácido pirúvico y más de una vía puede ocurrir de manera simultánea en el mismo microorganismo (28). Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acéti co y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico (etanol), d) etanol, e) acetilmetilcarbinol (acetoína) y C 0 2, f) ácido succínico a ácido propiónico y C 0 2, g) C 0 2 y acetona a alcohol isopropílico (isopropanol) y h) ácido butírico a alcohol butílico (butanol) (6, 25). Las bacterias producen clases diversas de patrones de fermen tación, de acuerdo con los productos finales formados característicos. Según la mayoría de los autores, los grupos más importantes de bacterias exhiben uno de los cinco tipos principales de patrones de fermentación.

Pruebas bioquímicas individuales

Fermentación alcohólica Glucosa

-------- >

2 etanol + C 0 2

Las bacterias alcohólicas degradan la glucosa a ácido pirúvico por la vía metabólica de Embden-Meyerhof-Parnas (6).

Fermentación del ácido láctico Las bacterias que producen ácido láctico pueden ser divididas en dos subgrupos: fermentadoras hom*olácticas y heterolácticas. En el caso del ácido hom*oláctico o ácido láctico simple (22), las bacterias degradan la glucosa por la vía de EM P casi exclusivamente a ácido láctico (6, 22, 25, 28), sólo con ras tros de otros productos finales (28). Las fermentadoras heterolácticas a veces se denominan fermenta doras mixtas del ácido láctico (7, 31). Estos microorganismos pueden catabolizar la glucosa por una de las tres vías de degradación (EMP, shunt de la pentosa o proceso de Entner-Doudoroff (6)) para dar los productos finales característicos: ácido láctico más ácido acético y ácidos fórmicos, etanol y C 0 2 (6,22, 25) y a veces glicerol (22). Una única especie bacteriana puede exhibir tanto la fermentación hom*oláctica como la heteroláctica. Los factores de control son el pH y el sustrato presente para la actividad bacteriana (6). acetaldehído Ácido pirúvico

— »- ácido acético

ácido succínico — ». ácido propiónico + C 0 2

Fermentación del ácido propiónico Los productos finales principales del ácido pirúvico son el ácido propiónico (propionato) y C 0 2 por la vía del ácido succínico, aunque puede producirse ácido acético (22, 25). Los microorganismos anaero bios llevan a cabo la fermentación propiónica (31).

Fermentaciones del grupo coliforme Los integrantes del grupo coliforme a menudo se denominan fermentadores mixtos de ácidos (28, 31), fermentadores del ácido fórmico (28) o bacterias colónicas-disentéricas-tifoideas (grupo CDT) (22, 25, 31). La fermentación mixta de ácidos es característica de los miembros de la familia Enterobacteriaceae y estos microorganismos degradan la glucosa en una diversidad de productos finales. El grupo coliforme puede subdividirse en dos categorías: a) los microorganismos que rinden diversos pro ductos mixtos de ácidos y b) los que elaboran butilenglicol como principal producto final. El tipo o las combi naciones y cantidades del producto final producidas dependen del género o de las especies que se prueban (25). Los productos de los microorganismos que elaboran varios ácidos incluyen los siguientes: ácidos fór mico, acético, láctico y succínico; etanol; y C 0 2 e H2; pero no butilenglicol (butanodiol) (6, 25, 28). El alcohol se forma por la fermentación alcohólica; el ácido láctico, el ácido acético y el C 0 2 se forman por la fermentación láctica a través de la dismutación del ácido pirúvico (26). En la dismutación, una molé cula de ácido pirúvico es reducida para dar ácido láctico y la otra molécula es oxidada y se forma ácido acético y CO^ (6). Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae, Escherichia coli exhibe este ti po de fermentación (6). 2 moléculas de ácido pirúvico

-------- >

ácido acético + ácido láctico + C 0 2

El segundo grupo está compuesto por microorganismos cuyo principal producto final es el butilengli col (22, 28). Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae, los grupos Klebsiella-Enterobacter muestran este tipo de fermentación.

Fermentación del alcohol butílico (butanol) La fermentación del butanol es llevada a cabo por las bacterias anaerobias como Clostridium (6, 28). Los diversos productos finales formados son ácido acético, ácido fórmico, etanol, ácido butírico, butanol,

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 59 acetona, isopropanol y una gran cantidad de C 0 2 y H2 (22, 25, 28, 31). La combinación y las cantidades de los productos finales formados dependen del género y de las especies bacterianos (25). Algunos m i croorganismos producen sobre todo ácidos butírico y acético, C 0 2 y H2; otros producen butilenglicol, ace tona, butanol e isopropanol (22). Sin embargo, no se forma ácido láctico.

IV.

MEDIOS BASE LÍQUIDOS ESTÁNDAR

M edios 1. Con rojo fenol como indicador de pH (4, 11) a. C aldo (1) Ingredientes, pH 7,4 + 0,2. Peptona (proteosa o digerido pancreático de caseína) Extracto de came, optativo Clomro de sodio, NaCl Rojo fenol Agua desionizada

10 g 1g 5g 0,018 g 1.000 mL

(2) Rojo fenol como indicador de pH (a) Acido: color amarillo, pH 6,8. (b) Alcalino: color rosado rojo, pH 8,4. (c) M edio sin inocular: color naranja roji*zo; pH 7,4. (3) Método de preparación (a) Pesar con precisión la cantidad indicada en el rótulo del envase. Los productos de dife rentes marcas comerciales pueden ser algo distintos. (b) Rehidratar con agua destilada o desionizada. (c) Calentar suavemente la solución. b. Con agar: medio base líquido con rojo fenol semisólido a sólido. (1) Ingredientes, pH 7,5 ± 0,2. Medio líquido con hidratos de carbono y rojo fenol Agar, sólo semisólido, 4-6% sólido sólo, 15%

1.000 mL 4-6g 15 g

(2) Método de preparación (a) Colocar el frasco que contiene la mezcla de agar base-hidratos de carbono sobre un agi tador magnético con platina caliente. (b) M antener a baja temperatura. (c) Agregar una barra magnética al frasco y mantener el medio en movimiento constante mientras se fracciona en los tubos (4,0-5,0 mL/tubo). (3) U n medio base con hidrato de carbono semisólido elimina el uso de tubos de Durham para la detección de gas.

c. Con suero (1) Objetivo: enriquecimiento para estimular el crecimiento de especies de Neisseria para los estudios de fermentación. (2) A 1 L de base estéril, agregar en forma aséptica líquido ascítico estéril al 10%, 10 g/L de base (18) (véase cap. 29, Pruebas de utilización de hidratos de carbono para Neisseria). 2. Con indicador de p H modificado de Andrade (1, 9). a. El indicador de pH modificado reemplaza el rojo fenol. b. Recomendado cuando los hidratos de carbono son sometidos a una incubación prolongada; so bre todo utilizado para bacilos gramnegativos aerobios (p. ej., entéricos). c. Soluciones stock de hidróxido de sodio (NaOH). (1) NaOH (10 N o 40%) (a) Ingredientes NaOH, exento de carbonato, R. G. (reactivo de calidad) Agua destilada (b)

Método de preparación

40 g 100 mL

Pruebas bioquímicas individuales 1. Pesar con rapidez el NAOH y disolver en menos de 100 mL de agua destilada en un vaso de precipitación. Precaución: este reactivo es altamente higroscópico. 2. Colocar el vaso en un baño con circulación de agua fría para controlar la temperatura. 3. Enfriar y transferir la solución de NaOH a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua destilada. 4. Conservar en una botella para reactivos de vidrio recubierta con parafina o polietileno y rotular de manera correcta. 5. Precaución: el hidróxido de sodio es sumamente cáustico; evitar la exposición de la piel ya que pueden ocurrir quemaduras dolorosas. (2) NaOH (1 N o 4% ) (a) Ingredientes NAOH 10 N Agua destilada, llevar a

10 mL 100 mL

(b) Método de preparación: utilizar una pipeta (tipo pro o bulbo) para transferir 10 mL de NaOH 10 N a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua destilada. d. Indicador de Andrade, solución de trabajo al 1,0% (1) Ingredientes, pH 7,1-7,2 ± 0,2 Fucsina ácida Agua destilada NAOH, 1 N

0,5 g 100 mL 15 -18mL

(2)

Método de preparación (9) (a) Disolver la fucsina ácida en agua destilada. (b) Agregar 15,0 mL de NaOH 1 N (4%). (c) M ezclar y mantener a temperatura ambiente (25°C) durante 24 h (toda la noche) con agi tación frecuente. El color rojo debe cambiar al bronceado. Decantar el sobrenadante y descartar el sedimento (33). 1. Si el cambio de coloración es insuficiente, agregar 1 mL adicional de NaOH (4%). 2. M ezclar y dejar en posición uu adicional de 24 h. 3. Puede ser necesario agregar más álcali para obtener el color amarillo paja reque rido. a. Evitar el agregado de un exceso de NaOH. b. Agregar gota a gota hasta que se logra el color deseado, Medio completo Caldo base sin rojo fenol, estéril, enfriado (45-50°C) Solución del indicador de Andrade, 1%

1.000 mL 10 mL

(1) Ajustar a pH 7,1-7,2 con NaOH 1 N (9). (2) Agregar el hidrato de carbono deseado. f. Reacciones de color de Andrade: las mismas que las del indicador de pH rojo neutro (9). (1) Acido: color rosado rojo, pH 5. (2) Alcalino: amarillo a incoloro, pH 12-14. (3) No inoculado: color rosa muy leve, pH 7,1-7,2.

Hidratos de carbono 1.

Selección a. Puede utilizarse una variedad de hidratos de carbono de acuerdo con las dificultades encontra das en la identificación de un microorganismo particular. b. Por lo general deben utilizarse 8-10 azúcares; los utilizados con mayor frecuencia son: adonitol arabinosa celobiosa dulcitol fructosa (azúcar invertido) galactosa

glucosa inositol inulina lactosa manitol melibiosa rafmosa

ramnosa sacarosa salicina sorbitol trehalosa xilosa

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 61 c.

agregar los hidratos de carbono individuales deseados a alícuotas de caldo base preparado; con centración final (1) Safirina, 0,5% (2) Todos los otros, 1% 2. Métodos para el agregado de hidratos de carbono al caldo base a. Método 1: agregar directamente al medio base en la concentración deseada antes de la este rilización. (1) 0,5%: 5 g/L de base. (2) 1,0%: 10 g/L de base. b. Método 2: soluciones de azúcares. (1) Preparar una concentración del azúcar deseado al 5 o 10% en agua destilada. (2) Agregar la solución de azúcar estéril a la base estéril para dar una concentración final de 0,5 o 1% (3); agregar 100 mL de una solución al 0,5% o 1% a un frasco graduado de 1 L y llevar a 1.000 mL con el caldo base con rojo fenol y mezclar completamente. c. Método 3: se dispone en el comercio de discos diferenciales con hidratos de carbono en la for ma de discos de papel estables, estériles, impregnados con concentraciones estandarizadas de hidratos de carbono fermentables. Ad, adonitol Ar, arabinosa D, dextrosa (glucosa) Du, dulcitol Ga, galactosa I, inositol In, inulina

L, lactosa Le, levulosa (fructosa) M, maltosa Mn, manitol Ma, mañosa Me, melibiosa Ra, rafinosa

R(h), ramnosa Su, sacarosa Sa, safirina So, sorbitol Tr, trehalosa X, xilosa

(1) Utilizado en medios sin hidratos de carbono: opciones (a) Caldo: caldo con rojo fenol. (b) Semisólido: agar con rojo fenol, medio de agar base con tripticasa o agar con tripticasa y cistina (CTA). (2) Agregar los discos después de haber esterilizado el medio en autoclave. (a) Los discos se presentan en frascos ampolla, estériles. (b) Extraer los discos de modo aséptico con una pinza estéril (flameada en etanol al 95%); mantener la esterilidad de la tapa y los contenidos. Un indicador de pH y un hidrato de carbono específico pueden utilizarse para determinar si una bacteria degrada el hidra to de carbono a diversos productos finales mediante la observación de un cambio de color visible en el medio. indicador de pH + CHO

bacteria

---------------> C 0 2, H2, aldehidos + cambio de color glucólisis, etc.

Las pruebas de ferm entación de hidratos de carbono pueden utilizarse para determ inar qué produc tos finales se han form ado pero no las vías m etabólicas utilizadas (22). Asimismo, el medio contiene otros constituyentes para el crecim iento que pueden degradarse para dar diversos productos finales si milares a los producidos por la degradación de los hidratos de carbono mientras que el m icroorganis mo está utilizando alguno de los carbonos producidos por la degradación del hidrato de carbono para producir nuevas células (22). El indicador de pH utilizado con más frecuencia para demostrar la fermentación del hidrato de carbo no es el rojo fenol, ya que la mayoría de los productos finales del metabolismo de los hidratos de carbo no son ácidos orgánicos. Con el rojo fenol, el cambio de color ocurre cerca del pH original del medio (pH ácido 6,8; medio pH 7,4). La peptona en el medio también es degradada por las especies bacterianas y produce sustancias al calinas. El ácido producido por la fermentación de un hidrato de carbono se observa por un cambio de pH sólo cuando se produce más ácido por la degradación del hidrato de carbono que sustancias alcali nas provenientes de la degradación de la peptona (9). La observación de un cam bio de color que deno ta acidez está influenciada por dos factores: a) el indicador de pH utilizado y b) las propiedades buffer del medio (9).

Pruebas bioquímicas individuales

C. Método de esterilización 1. Caldo base solo con rojo fenol: esterilización en autoclave a 121°C, 15 Ib, 15 min. 2. Caldo base con rojo fenol con hidratos de carbono agregados directamente a. Esterilizar en autoclave a 116-118°C, 10-12 Ib, 15 min. (1) Ciertos hidratos de carbono pueden resistir la esterilización en autoclave con poco o ningún deterioro. (2) Esterilizar en autoclave durante 15 min no es aconsejable para la arabinosa, la lactosa, la maltosa, la sacarosa, la salicina, la trehalosa y la xilosa. b. Esterilizar en autoclave a 121°C, 15 Ib, 3 m in. (1) Utilizar cuando el tiempo del elemento es crítico. (2) Los controles deben ser probados antes de su uso con fines diagnósticos para verificar el posible deterioro (véase V. Microorganismos utilizados para el control de calidad). 3. Caldo base con indicador de pH de Andrade a. Esterilizar en autoclave a 115°C, 15 Ib, 20 m in. b. El medio presenta color rosa cuando está caliente; el color desaparece cuando se enfria (9). 4. Soluciones de hidratos de carbono: filtración por membrana (Millipore) con membranas de 0,45 |i de tamaño de poro. Método recomendado. Si las soluciones de hidratos de carbono estériles o los discos estériles se agregan al medio base esteri lizado, enfriar el caldo esterilizado en un baño de agua a 42-50°C antes de agregar los hidratos de carbono. D. Fraccionamiento: tubos con tapa a rosca (13 x 100 mm). 1. Agar (sólido/semisólido): 8 mL/tubo; enfriar en posición vertical. 2. Caldo a. Con hidratos de carbono agregados: 4-5 mL/tubo. b. Con discos: 2 inL/tubo. c. Sólo a los tubos de glucosa, agregar un tubo de Durham invertido (el fondo hacia arriba, posi ción invertida) a los tubos antes de esterilizar en la autoclave. d. Todos los medios: enfriar antes de su uso y conservar en refrigerador (4-10°C). El vencimien to es aproximadamente a las 6-8 semanas. E. Inoculación 1. Desarrollo de un cultivo puro de 18 a 24 h (agar con hierro de Kligler (KIA) u otro medio conve niente). 2. Inoculo denso a. U na batería de hidratos de carbono puede inocularse con un único inoculo. b. Métodos de inoculación de los medios líquidos o sólidos con hidratos de carbono. (1) Hisopo (a) Rotar el hisopo sobre el desarrollo en KIA u otro cultivo conveniente. El hisopo puede humedecerse primero con solución fisiológica estéril o caldo estéril si el cultivo pro viene de un medio sólido. (b) Rotar el hisopo de manera aséptica contra la parte lateral de cada tubo con hidrato de carbono justo por encima del nivel líquido. (c) Inclinar cada tubo con hidrato de carbono para recoger el inoculo. (d) A gitar cada tubo con suavidad. Es necesario no hum edecer con el líquido la tapa (cierre metálico). (2) Inoculación con aguja o ansa (a) Rotar la aguja o el ansa sobre el desarrollo en KIA u otro cultivo conveniente. Utilizar un ansa de inoculación para un cultivo en medio líquido. (b) Introducir de m anera aséptica la aguja o el ansa en cada tubo con hidrato de carbono. (c) A gitar cada tubo con suavidad. Es necesario no hum edecer con el líquido la tapa (cierre metálico). (3) General, para cualquier método de inoculación (a) Por lo común resulta suficiente un único inóculo para sembrar 8-10 tubos con hidratos de carbono. (b) Cuando se inocula una batería no hay necesidad de flamear entre las inoculaciones. Cuan do se utiliza una aguja o un ansa para inocular una batería con un único inóculo, de modo que una cantidad demasiado pequeña de azúcar es transferida de un tubo a otro, ningún tu bo llega a contener una mezcla de hidratos de carbono que interfiera con los resultados.

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 6a (c) Cuando se inocula una batería, no es necesario observar realmente un inoculo apreciable en cada tubo. Un solo inoculo inicial denso de un cultivo contiene millones de bacterias y cada tubo recibirá una cantidad suficiente de bacterias para detectar el metabolismo. (d) Cuando se prueba una gran batería de hidratos de carbono (p. ej., 15-20 azúcares), pue de ser necesario utilizar 2-3 inóculos de cultivos separados. En este caso, flamear siem pre la aguja o el ansa antes de reintroducir en el cultivo de crecimiento. Si se utilizan hi sopos, en cada reintroducción debe utilizarse un nuevo hisopo. Estas precauciones evitan la contaminación del cultivo de crecimiento, ya que puede ser necesario utilizarlo para otras pruebas o para subcultivos. c. M edios semisólidos que contienen discos de hidratos de carbono: Utilizar un inoculo denso. Cuando la aguja se introduce en el agar (por punción), el disco se empuja al lado del agar y al go sobre él, pero debe permanecer bastante cerca de la superficie. F. Incubación: en aerobiosis o anaerobiosis de acuerdo con el m icroorganism o que se sospecha, en estufa a 35°C. 1. Agar o caldo con hidratos de carbono: 18-24 h. Puede ser necesaria una incubación de hasta 30 días para confirmar un resultado negativo. 2. Agar semisólido con discos con hidratos de carbono: la lectura se realiza después de 4-6 h y de nuevo después de 18-24 h para detectar cualquier posible reversión de la reacción inicial. V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD______________ A. Glucosa (dextrosa) Controles positivos (A/F): Escherichia coli (AG ) Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae (AG ) Proteus vulgaris (AG ) Shigella flexnexi (A) Controles negativos (-): Alcaligenes faecalis

A TCC 25922 A TCC 13883 ATCC 6380 ATCC 12022 ATCC 8750

N o in o culado

B. Lactosa Controles positivos (A/F): Escherichia coli Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae Controles negativos (-): Proteus vulgaris Alcaligenes faecalis

ATCC 25922 ATCC 13883 ATCC 6380 ATCC 8750

N o in o culado

VI. RESULTADOS

Véanse figuras 5-1 y 5-2 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. Vil. INTERPRETACIÓN A.

Medio líquido con hidratos de carbono y rojo fenol 1.

Positivo (A/F) a. Acido: color amarillo, pH 6,8. b. Producción de gas variable (1) PdSitivo para el gas (G, ® ) . (a) Aerógeno: C 0 2 + H2 presentes. (b) Burbujas de gas presentes en el tubo de Durham insertado o medio completamente des plazado por el gas que deja una porción incolora en el tubo de Durham. (c) Una única burbuja en el tubo de Durham es significativa; registrar como producción de gas. (d) Registrar como producción de ácido y gas (AG, ® ). (2) Negativo para el gas

Pruebas bioquímicas individuales (a) Anaerógeno. (b) Ausencia de burbujas de gas y el medio en los tubos de Durham insertados permanece amarillo. (c) Registrar como producción de ácido solamente). 2. Tardío: color anaranjado. Si es inseguro, comparar con un tubo no inoculado y reincubar. 3. Negativo (-). a. Color rosa roji*zo. b. Peptonas utilizadas con la resultante alcalinidad, pH 8,4.

B. Medios de cultivo sólidos o semisólidos para hidratos de carbono con rojo fenol 1. Con hidratos de carbono agregados al medio a. Positivo (A/F) (1) Ácido: color amarillo, pH 6,8. (2) Producción de gas variable (a) Positivo para el gas (G, ® ) 1. Aerógeno: C 0 2 + H2 presentes. 2. Detección del gas por una diversidad de maneras de acuerdo con la cantidad de gas producida. a. Burbujas de gas en todo el medio. b. U na leve indentación del medio en la parte lateral del tubo. c. El gas puede levantar el medio del fondo del tubo, lo que deja un espacio vacío. Si se produce una gran cantidad de gas, el medio puede ser empujado hacia el cierre del tubo o tapa. d. Rotura del medio. e. Una única burbuja en el medio es significativa; registrar como producción de gas. f Registrar como producción de ácido y gas (AG, (A)). (b) Negativo para el gas: anaerógeno 1. Ausencia de burbujas de gas y ausencia de rotura del medio. 2. Registrar sólo como producción de ácido (A). b. Tardío: color anaranjado. Si es dudoso, comparar con un tubo no inoculado y reincubar. c. Negativo (-) (1) Color roji*zo rosado. (2) Alcalinidad, pH 8,4; uso de peptonas en el medio. 2. Con discos con hidratos de carbono a. El fondo del tubo actúa como control. b. Las reacciones comienzan cerca del disco, con la formación de gas en la superficie, alrededor del disco, a lo largo de la línea de inoculación o en cualquiera de estas localizaciones. c. La movilidad (o su ausencia) puede determinarse de manera simultánea. d. Utilización de los hidratos de carbono con producción de gas o sin ella: la misma interpretación que en el medio semisólido con el agregado de hidratos de carbono (véase antes).

C. Medio líquido con hidratos de carbono e indicador de pH de Andrade (9) 1. Positivo (A/F). a. Ácido: color rosado rojo, pH 5,0. b. Producción de gas variable (véanse las reacciones para el medio líquido con hidratos de carbo no y rojo fenol). 2. Negativo (-): alcalino, amarillo a incoloro. VIII.

MEDIOS PARA LA FERMENTACIÓN ALTERNATIVA DE HIDRATOS DE CARBONO PARA MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS

Anaerobios; selecciones 1. Caldo con peptona y extracto de levadura (PY) con hidratos de carbono (medios para fer mentación con peptona y extracto de levadura) a. Ingredientes del medio • (1) Solución de sal VPI (14); conservar en refrigerador (4-10°C).

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 65 Cloruro de calcio, anhidro, CaCl2 ■2H20 Sulfato de magnesio, anhidro, MgS04 • 7H20 Fosfato dipotásico, K2HP04 Fosfato monopotásico, KH2P04 Cloruro de sodio, NaCl Bicarbonato de sodio, NaHCOj Agua desionizada (2)

0,2 g 0,2 g 1g 1g 2g 10 g 1.000 mL

Solución de vitam ina K y hem ina; conservar en refrigerador (4-10°C) en un recipiente cerrado protegido de la luz. Hemina, C34H320 4N4FeCl Vitamina K¡, (fitomenadiona) Hidróxido de sodio, NaOH Etanol, 95%

0,5 g 0,05 g 0,4 g 10 mL

(3) Solución de resazurina: 11 m g/44 m L de agua desionizada (2) o un com primido de resazurina com ercial (Difco)/44 m L de agua; indicador de Eh (indicador de oxidación-reduc ción). Conservar a tem peratura am biente (22-25°C). (a) Estado reducido: incoloro. (b) Estado oxidado: rosa. (4) Medio completo (2), pH 7 ± 0,2. Caseína/peptona de came Extracto de levadura L-Cisteína HCl H20 Solución de resazurina Solución de sal VPI Solución de vitamina Kj-hemina (optativo) Agua desionizada

20g 10g 0,5g 4mL 40mL 10mL 1.000 mL

{Nota: Se requieren factores de crecimiento (extracto de levadura, solución de vitamina K,-hcinina) para muchos anaerobios. La cisterna reduce y mantiene un Ehbajo.) b.

Hidratos de carbono (1) 5 g/L de caldo PY adonitol amigdalina arabinosa dextrina (2)

eritrosa glucógeno melecitosa melibiosa

ribosa trehalosa

inulina lactosa maltosa manitol mañosa rafinosa

ramnosa sacarosa salicina sorbitol xilosa

10 g/L de caldo PY celobiosa dulcitol fructosa galactosa glucosa inositol

(3) 8 mL/L de caldo PY: glicerol. c. Fraccionamiento: tubos PRAS con tapa a rosca: 7 mL/tubo (15 x 90 mm); almacenar en el re frigerador (4-10°C). El vencimiento es aproximadamente a las 6-8 semanas con los hidratos de carbono. d. Esterilización en autoclave: 121°C, 15 Ib, 15 min. e. Fermentación (A/F): pH 5,6 o menos, incoloro. 2. Medio tioglicolato (THIO) sin indicador, sin dextrosa (medio de fermentación de tioglicolato) a. Ingredientes, pH 7,2 ± 0,2.

Pruebas bioquímicas individuales Peptona de caseína L-Cistina

20 g 0,4 g

(Puede sustituirse la 1-cistina por 1-cisteína en la misma concentración.) Cloruro de sodio, NaCl Fosfato dipotásico, K2HP04 Tioglicolato de sodio, HSCH2COONa Sulfito de sodio, Na2S 03 Rojo fenol

2.5 g 1.5 g 0,6 g 0,2 g 0,018 g

o Azul del metileno Agar Agua desionizada Un único hidrato de carbono o discos con hidrato de carbono (como se desee), 0,5-1,0%

0,002 g 0,5 g 1.000 mL

5 -10 g

H tioglicolato (HSCH ,CH-(NH2iCOOH) de sodio y la cistina (HOOCCH(NH2)CH2SSCH2CH(NH2) COOH) o la cisterna (HSCH2CH2-(NH2)COOH) son agentes reductores. Reaccionan con el oxígeno molecular del am biente y lo eliminan e impiden la acumulación de peróxidos (p. ej., H20 2), los que pueden ser letales para al gunos microorganismos. Los grupos sulfhidrilos (-SH) en los compuestos inactivan el arsénico, el mercurio y otros metales pesados y por lo tanto mantienen un potencial redox (Eh) bajo y aseguran la anacrobiosis (32). El agar ayuda a iniciar el crecimiento anaeróbico y el crecimiento a partir de un inoculo pequeño. Tam bién elimina la necesidad de sellar el medio, ya que retarda la dispersión de C 0 2 y la difusión de 0 2 y re duce las sustancias. L a concentración baja reduce las corrientes de convección dentro del medio para in crementar la anaerobiosis en la porción inferior del tubo con medio. El azul de metileno es un indicador de oxidación-reducción; a medida que aumenta la oxidación, se ab sorbe más oxígeno del que puede eliminar el agente reductor y el medio cambia de claro al color azul-verde. b. Fraccionamiento: tubos con tapa a rosca; 10 m i./tubo (16 x 125 mm). c. Esterilización en autoclave: 118-121°C, 12-15 Ib, 15 min, enfriar en posición vertical y apre tar las tapas. d. Almacenamiento (1) Sin sellar: a temperatura ambiente (22- 25°C) en la oscuridad. (2) Sellado: refrigerador, 4-10°C. (3) Vencimiento: aproximadamente a los 6 meses a menos que más de un tercio de la parte su perior de la columna esté oxidada. Precaución: controlar la porción superior de cada tubo antes de la inoculación. Si más de un tercio de la columna está oxidado, indicado por un co lor rosa o azul-verde que depende del indicador de pH utilizado, desechar el tubo. Si un tercio o menos es de color rosa o azul-verde, hervirlo en un baño de agua (100°C) sin la ta pa, sin agitación, durante 10 m in para eliminar el oxígeno absorbido. Enfriar a temperatu ra ambiente antes del uso. No hervir (recalentar) más de una vez; la ebullición frecuente facilita el desarrollo de productos tóxicos. e. Inoculación: directa (p. ej., hisopo). No es necesario prerreducir el medio antes del uso para el cultivo anaerobio (12). f. Incubación: 35°C, 48 h o más. g. Fermentación (A/F) n rojo fenol: color amarillo, pH 6,8. Con azul de metileno: estado reducido, incoloro. No inoculado (cualquier indicador): beige claro. 3. Caldo para la fermentación de hidratos de carbono (medio base CHO) (10,11, 33) a. Medio base, pH 7 ± 0,2. Peptona de caseína 15 g Extracto de levadura 7g 0,25 g 1-Cistina 2,5 g Cloruro de sodio, NaCl Acido ascórbico 0,1 g Tioglicolato de sodio 0,5 g Azul de bromotimol (BTB) 0,01 g 0,75 g Agar 900 mL Agua desionizada

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 67 (Nota: El extracto de levadura y el ácido ascórbico incrementan el crecimiento de los anaerobios sensibles al oxígeno y de los de difícil desarrollo (11). La cistina y el tioglicolato reducen y mantienen un Eh bajo.) b. Aditivos (1) Hidratos de carbono: soluciones de los hidratos de carbono deseados al 6%, esterilizadas por filtración; 100 mL agregados en forma estéril, medio base enfriado (50°C); concentra ción final, 6%. (2) Solución de almidón: 2,5%; agregar 100 mL al medio base enfriado. c. Fraccionamiento: 7 mL/tubo con tapa a rosca (15 x 90 mm o 15 x 125) (2, 10). d. M edios prerreducidos en una atmósfera anaeróbica (cámara) con las tapas flojas y conservar con las tapas ajustadas en el refrigerador (4-10°C). e. Inoculación: inocular en profundidad con el ansa bacteriológica. f. Incubación: en anaerobiosis, 35°C, 48 h o más. g. Indicador de pH: azul de bromotimol (BTB). (1) Ácido: amarillo, pH 6. (2) Alcalino: azul Prusia oscuro, pH 7,6. (3) Medio no inoculado: verde, pH 7 (neutro). h. Fermentación (F/A): amarillo.

Microorganismos para el control de calidad de los medios anaerobios a.

Glucosa (dextrosa) (A/F) Controles positivos: Bade roides fragilis Clostridium perfringens Clostridium bifermentans Escherichia coli Controles negativos: Bacteroides melaninogenicus Clostridium cochlearium

ATCC 25285 ATCC 12919 ATCC 638 ATCC 25922 ATCC 25611 ATCC 17787

N o in o culado

Lactosa (A/F) Controles positivos: Bacteroides fragilis Bacteroides melaninogenicus Clostridium perfringens Controles negativos: Bacteroides vulgatus Clostridium bifermentans

ATCC 25285 ATCC 25611 ATCC 12919 ATCC 8482 ATCC 638

N o in o culado

Caldo para la fermentación de hidratos de carbono para estreptococos (34) 1. Objetivo: probar la fermentación de especies de Streptococcus con requerimientos especiales de cultivo. 2. Medio base, pH 7,4 ± 0,2. C ald o in fu sió n de carne y corazón P ú rp u ra de bro m o creso l (1,6% e n etanol al 95% ) A g u a d esio n izad a

25 g 1 mL 900 m L

3. Hidratos de carbono; los utilizados con más frecuencia, sobre todo para los estreptococos orales. a. Selección: inulina, lactosa, manitol, rafinosa, sorbitol, trehalosa. b. Esterilizados por filtración, 10 g/100 mL de agua desionizada agregados al medio base; con centración final, 1%. 4. Indicador de pH: púrpura de bromocresol. a. Ácido: amarillo, pH 5,2. b. Alcalino: púrpura, pH 6,8. c. Medio no inoculado: púrpura oscuro, pH 7,4. 5. Fraccionamiento: 3 mL/tubo con tapa a rosca (13 x 100 mm). 6. Esterilización en autoclave: 121°C, 15 Ib, 10 min. 7. Microorganismos para el control de calidad. a. Streptococcus mutans ATCC 25175: positivo (A) para los seis azúcares mencionados antes en VIII.B.3.a.

Pruebas bioquímicas individuales

b. Streptococcus sanguis ATCC 10556: inulina V (variable), lactosa +, manitol rafinosa V, sor bitol trehalosa V. 8. Incubación: 35°C, hasta 7 días. 9. Fermentación A/F; ácido, amarillo. El medio contiene grandes cantidades de proteínas requeridas por los estreptococos para el crecimien to óptimo. Los estreptococos no producen cantidades significativas de subproductos alcalinos provenien tes de la degradación de las proteínas y no ocurre la neutralización de los ácidos; sin embargo, no debe utilizarse con las bacterias gramnegativas. C. Caldo para la fermentación de hidratos de carbono p a ra estafilococos y bacilos entéricos gram-

negativos 1. Caldo base púrpura (PBB); pH 6,8 (2, 16, 19). Digerido pancreático de gelatina, USP Cloruro de sodio, NaCl Púrpura de bromocresol Agua desionizada

10 g 5g 0,02 g 1.000 mL

2. Hidratos de carbono, esterilizados por filtración, agregados al medio base a una concentración fi nal de 1%, o discos con hidratos de carbono. 3. Indicador de pH: púrpura de bromocresol (véase VIII.B.4). 4. Fraccionamiento: 15-20 mL/placa (placa de Petri) (100 x 20 mm). 5. Inoculación a. Dividir la placa en cuatro cuadrantes. b. Inoculo liviano; con la aguja de inoculación realizar dos estrías de 0,5 a 1 cm en un cuadrante, dos estrías para un único aislamiento a probar. 6. Control de calidad: fermentación de la glucosa (A/F) Escherichia cotí Staphylococcus aureus subesp. aureus Neisseria meningitidis

ATCC 25922 AG ATCC 25923 A ATCC 13090 A

7. Incubación: en aerobiosis (sin C 0 2), 35° C, 24-72 h (puede requerir hasta 7 días). a. U na reacción ácida fuerte puede detectarse a las 12-24 h (2). b. U na producción ácida moderada por lo general dentro de 48-72 h (20). 8. Interpretación: cam bio de calor de púrpura a am arillo alrededor de las colonias bacterianas (crecim iento) (2). a. Positivo (A/F): color amarillo moderado a fuertemente ácido que se extiende fuera de las es trías de cultivo en el medio circundante dentro de las 72 h. b. D ébil (±): color amarillo diferente bajo las estrías pero que no se extiende dentro de las 72 h. c. Negativo (-): sin producción ácida o color amarillo muy pálido bajo las estrías.

IX. PRECAUCIONES A. Generales 1. Los hidratos de carbono son denominados en conjunto como “azúcares”. Sin embargo, muchos en realidad son alcoholes polihídricos (9). El nombre de un azúcar verdadero por lo general ter m ina en “osa”, mientras los alcoholes term inan en “ol”; así, la lactosa y la m altosa son ejemplos de azúcares y el ducitol y el manitol son alcoholes. Existen excepciones como el azúcar salicina (un glucósido). 2. La concentración de hidratos de carbono incorporados en el medio base con rojo fenol es por lo común de 1%, con excepción de la salicina (0,5%). Se pueden utilizar concentraciones de 0,5% para todos los hidratos de carbono; sin embargo, se recomiendan las concentraciones de 1% ya que reducen la posibilidad de reversión (9). 3. Orr y Taylor (23) concluyeron que algunos tipos de peptonas no son apropiados para la prepara ción del medio con hidratos de carbono. En sus estudios, S.flexneri del tipo 6. biotipos Newcastle y Manchester, no produjeron ácido ni gas en ciertos lotes de peptona (23). El constituyente bási co es la peptona de caseína, la que debe estar exenta de cualquier hidrato de carbono que pueda fermentarse (26). Si no se dispone de un medio deshidratado preparado comcrcialmente, deben

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 69

4. 5.

6. 7.

realizarse controles sobre los lotes de peptona para determinar su conveniencia para el medio con hidratos de carbono realizado de m anera artesanal. Cook y Knox (8) recomiendan que el medio con hidratos de carbonos no contenga nitrato, el que puede interferir con la producción de gas. Herrmann (13) recomienda evitar el agregado de extracto de levadura, suero o líquido ascítico al medio con hidratos de carbono. Sin embargo, el agregado de líquido ascítico se recomienda para determinar el perfil de fermentación de especies de Neisseria (3). El agregado de extracto de leva dura es optativo; Difeo lo incorpora y BBL no lo hace, no obstante ambos medios de cultivo brin dan resultados idénticos. El medio con hidratos de carbono, cuando se calienta o se retira de la autoclave, posee un color anaranjado suave. Esto cambia al naranja-rojo cuando se enfría. Se debe tener cuidado cuando se inteipretan las pruebas de los hidratos de carbono, ya que el color que denota la fermentación varía de acuerdo con el indicador de pH utilizado en el medio (cuadro 5-2).

Cuadro 5-2. Indicadores de pH para los medios de cultivo con hidratos de carbono Indicador de pH

Ácido (fermentación)

Alcalino (negativo)

De Andrade Púrpura de bromocresol (BCP) Azul de bromotimol (BTB) Rojo fenol

Rosado rojo Amarillo Amarillo Amarillo

Amarillo, incoloro Púrpura Azul de Prusia oscuro Rosado rojo

8. La incorporación de algunos hidratos de carbono en el medio base puede producir una condición ácida. Si esto ocurre, es necesario agregar NaOH 0,1 N gota a gota hasta que se obtiene el color naranja-rojo deseado (10). Evitar el exceso de agregado de NaOH y obtener un color rojo oscuro (10); estos medios pueden ser demasiado alcalinos para que ocurra la verdadera fermentación den tro del período de incubación habitual. 9. Al probar una gran batería de hidratos de carbono (p. ej., 15-20 azúcares), puede ser necesario uti lizar 2-3 inóculos de cultivo separados. En este caso, flamear siempre la aguja o el ansa antes de reentrar en el cultivo de crecimiento. Si se utiliza un hisopo, se necesita uno nuevo para cada reen trada al cultivo de crecimiento. Estas precauciones evitan cualquier posibilidad de contaminación del cultivo de crecimiento, el cual puede ser necesario para pruebas adicionales o para subcultivos. 10. Todos los hidratos de carbono deben rotularse de manera apropiada inmediatamente después de la preparación. Todos los hidratos de carbono parecen iguales y deben prepararse en una gradilla en un orden determinado, lo que depende del protocolo del laboratorio. Un microbiólogo por lo común no rotula cada tubo con hidrato de carbono, pero sigue un cierto orden de m anera unifor me en un laboratorio de bacteriología. Sin embargo, si uno está en la duda sobre el orden, rotular cada tubo con hidrato de carbono utilizado como fue colocado en la gradilla. Si la identidad de un azúcar particular no es cierta cuando se leen los resultados, es necesario repetir la prueba. 11. Las fermentaciones de los hidratos de carbono a m enudo se registran como positivas (+) o negati vas (-). Es preferible registrar la fermentación como acidez, identificada por una letra A A ± por lo común significa una reacción tardía (color naranja) y debe ser reincubada. Si también se obser va gas, se registra la fermentación como AG o ® , @ denota tanto la acidez como la producción de gas. La fermentación también puede registrarse mediante la letra F. 12. El medio con hidrato de carbono presenta una leve alcalinidad (pH 7,4). Algunos hidratos de carbono se degradan en azúcares más simples cuando se los somete al calentamiento con un pH alcalino (3). La glucosa en presencia de fosfatos se destruye en forma gradual por la esterilización en autoclave (29). La esterilización en autoclave a 15 Ib de presión hidroliza la maltosa y la glucosa y la destruc ción gradual de la glucosa produce acidez (29). McDade y Weaver (21) recomiendan utilizar un me dio con contenido reducido de fosfato (0,08% KH2P 0 4) con rojo fenol como indicador de pH a una concentración de 0,0072%, el que da un pH de 7,5-7,6. Estos autores recomiendan utilizar estas con centraciones para probar a los miembros de la familia Enterobacteriaceae, un medio más rico para pro bar las especies de Streptococcus y uno sin buffer (a un pH bajo, 7,3) para las especies de Neisseria. 13. La acidez visible (fermentación) se alcanza a diferentes lecturas de pH, que dependen del pH del indicador utilizado. El azul de bromotimol (BTB) muestra la producción ácida cuando el pH cae a 6 o menos, mientras que el púrpura de bromocresol (BCP) no cambia el color hasta que el pH cae a cerca de 5 (9). El indicador de Andrade es rosa a un pH aproximado de 5,5 (9).

Pruebas bioquímicas individuales

14. Muchos anaerobios decoloran los indicadores; para evitar esta posibilidad, puede agregarse el in dicador después de completar la incubación (9). 15. La producción de gas puede provenir de la degradación de las proteínas y en consecuencia no in dica la utilización del hidrato de carbono (9) 16. Los ácidos producidos por los microorganismos no termentadores son considerablemente más dé biles que la mezcla de ácidos derivados de las bacterias termentadoras; así, el pH del medio de fer mentación en el que está creciendo un microorganismo no term entador puede no tom arse tan ba jo como para convertir el pH del indicador (19). El indicio inicial es una falta de ácido producida en KIA o en el medio de agar con azúcar triple y hierro (TSI) con un alcalino (rojo) en superficie/alcalino (rojo) en profundidad (19) 17. Los microbiólogos que utilizan equipos comerciales preenvasados y no realizan la inoculación del KIA o del TSI pueden no saber si deben seleccionar un sistema fermentativo u oxidativo (19). Se recomien da evaluar todos los aislamientos desconocidos de bacilos gramnegativos de oxidación/fermentación por la inoculación en KIA o TSI (19). B. Medio líquido: Cuando se utiliza un medio líquido con hidrato de carbono, el tubo de Durham por lo común se coloca en una posición invertida sólo en el tubo con glucosa. Si un microorganismo es ca paz de producir gas a partir de la glucosa, también se producirá gas en todos los otros hidratos de car bono utilizados. Sin embargo, si se sabe que el microorganismo probado no fermenta la glucosa, es aconsejable agregar tubos de Durham a algunos otros tubos con hidratos de carbono probados en la batería. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae son termentadores de la glucosa por de finición; en consecuencia, sólo es necesario probar la producción de gas en el tubo con glucosa por medio de la inserción de un tubo de Durham. A menudo un microbiólogo, en especial cuando trabaja con un miembro de la familia Enterobac teriaceae, no observa ninguna producción de gas en KIA o TSI. Esto no siempre significa que el m i croorganismo no produce gas. Probar siempre la producción de gas cuando se utilizan los hidratos de carbono. Cualquier signo de gas, incluso una única burbuja pequeña, es evidencia de la producción de gas. A menudo se produce tanto gas que el medio en el tubo de Durham es reemplazado por comple to por el gas, lo que da un aspecto de vacío. Antes de que los hidratos de carbono sean esterilizados en la autoclave, colocar el tubo de Durham en los tubos de glucosa, en otro hidrato de carbono o en ambos en una posición invertida. No inten tar que el medio penetre en el tubo de Durham; por lo común, el tubo flota encima del medio; sin em bargo, cuando se esteriliza, el medio penetra en el tubo de Durham invertido. Si el tubo de Durham no está invertido, no puede determinarse la producción de gas. C. Medio semisólido 1. Cuando se utiliza el medio semisólido con hidrato de carbono, se requiere sembrar en profundidad el medio con una aguja de inoculación en el centro del tubo hasta cerca de 0,5 cm del fondo del tubo. Sem brar con suavidad y no utilizar un ansa bacteriológica. La siembra burda o con el ansa bacteriológica puede romper el medio en forma mecánica y puede dar un aspecto de falsa producción de gas. 2. No se requiere el tubo de Durham con el medio semisólido de hidratos de carbono porque la produc ción de gas se denota porque el medio se resquebraja, por la presencia de burbujas de gas o por la se paración del medio de los lados o del fondo del tubo. Si se produce una gran cantidad de gas (p. ej., como se observa con los grupos Klebsiella-Enterobacter), el medio puede ser totalmente empujado hacia la tapa (cierre) del tubo. Si esto ocurre, manejar los cultivos con precaución cuando se realizan los subcultivos para evitar la contaminación del operador o la contaminación del cultivo. 3. Después de la esterilización en autoclave, el medio semisólido con hidrato de carbono debe en friarse en posición vertical.

D. Con indicador de pH de Andrade 1. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, el medio caliente es rosa; el color desa parece cuando se enfría (9). 2. Los medios con indicador de Andrade se esterilizan a 115°C durante 20 min (9). 3. El medio no es rico desde el punto de vista nutritivo; no es conveniente para probar bacterias ae robias con requerimientos especiales de cultivo (p. ej., estreptococos); es utilizado para las bacte rias entéricas. 4. La cantidad de NaOH utilizada depende del contenido de colorante de los diferentes lotes de fuc sina ácida (33). 5. El indicador de Andrade mejora algo con el tiempo después de su elaboración y debe prepararse 6 meses antes de ser utilizado (33).

Pruebas de fermentación de hidratos de carbono 71 E. Con suero: el suero no calentado contiene una enzima capaz de hidrolizar la maltosa a glucosa. Cuan do se em plea suero para enriquecer un medio con maltosa, debería calentarse el suero durante 1 h a 60°C para inactivar la enzima antes de agregarlo al medio. F. Medio de fermentación para estreptococos: no usar para los estudios de fermentación de bacterias gramnegativas y otros microorganismos que forman productos alcalinos a partir de la degradación de las proteínas. Estos productos neutralizan la producción de ácido y enmascaran los resultados positiv o^ resu ltad o falso negativo). G. Medio de fermentación para estafilococos: no incubar en tensión reducida de C 0 2. H. Medio de tioglicolato 1. No calentar los tubos más de una vez para eliminar el oxígeno absorbido; la ebullición frecuente da origen al desarrollo de productos tóxicos. Sin embargo, se recomienda que todos los medios THIO se hiervan una vez antes de su uso para aumentar la tasa de recuperación. 2. No agitar los tubos ni invertirlos cuando se hierven. 3. Los medios deben estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de su inoculación. 4. Almacenar todos los medios en la oscuridad; la luz tiene un efecto deletéreo sobre el indicador resazurina. 5. El medio THIO líquido (Brewer) (5) nu debe utilizarse para las pruebas de fermentación porque contiene una gran cantidad de extracto de levadura, la que a su vez tiene un alto contenido en hi dratos de carbono.

I. Caldo PY con hidratos de carbono 1. Los pH de la arabinosa, de la ribosa y de la xilosa pueden disminuir durante la incubación, aun cuando los hidratos de carbono no son fermentados. Por consiguiente, deben realizarse correccio nes en la interpretación de los resultados; informar como ácido cuando el pH disminuye por deba jo de 5,7 (27). 2. No utilizar el medio si es rosa. El indicador de Eh es rosa en el estado oxidado; el oxígeno se in trodujo en el tubo.

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27. 28. 29. 30. 31. 32. 33.

ducts and Laboratory Procedures, ed 6. co*ckeysville, MD: BBL Microbiology Systems, 1988:220. Scott TJ. Microbiological Media, A Manual of Pro ducts and Procedures. Fiskeville, RI: Scott Labora tories, 1981:616. Smith DT, Conant NF, Willett HP. Zinsser’s Micro biology, ed 14. New York: Appleton Century-Crofts, 1968:112-113. Smith ML. CLXXIII. The effect of heat on sugar solutions used for culture media. Biochem J 1932; 26:1467-1472. Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG, eds. Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, vol 2. Baltimore: Williams & Wilkins, 1986:1049. Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA. The Mi crobial World, ed 2 Englewood Cliffs, NJ: Prenti ce-Hall, 1963:252, 259, 262-263. The Merck Index, ed 7 Rahway, NJ: Merck and Company, 1960:161, 762. Washington JA. Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, ed 2. New York: Springer-Verlag, 1985:774, 801-802.

CAPÍ TULO

Pruebas de catalasa y peroxidasa I. PRINCIPIO___________________________________________________________________ Probar la presencia de las enzimas catalasa o peroxidasa o de ambas.

II. OBJETIVO___________________________________________________________________ (Véanse también caps. 43-45) A. Prueba de la catalasa; H 20 2 al 3% , 1. Principalmente utilizada para diferenciar entre los géneros a. Streptococcus ( -) de Micrococcus (+) o de Staphylococcus (V+) o de ambos. b. Bacillus (+) de Clostridium (V- ) ^ c. Listeria monocytogenes (+), especies de Kurthia (+), Corynebacterium (+) de otros microorga nismos que pueden ser similares desde el punto de vista morfológico: Erysipelothrix (-), espe cies de Lactobacillus (V- ), especies de Enterococcus ( -) y Streptococcus del grupo B ( -) (51). El antes denominado Corynebacterium pyogenes (catalasa - ) en la actualidad está reclasificado en el género Arcanobacterium como A. pyogenes (82). d. Kingella denitrificans (-), Neisseria elongata subesp. elongata (—) y N. elongata subesp. nitroreducens (-) de otras especies de Neisseria ( posición beta (P)

posición alfa (a)

D-2-Desoxirribosa 2-Desoxi-|3-D-ribofuranosa p-D-Desoxirribosa (29)

0 = P — OH

OH Ácido fosfórico (fosfato)

El “esqueleto” de los ácidos nucleicos son las unidades alternadas de azúcar- fosfato y, a partir de la molécula de azúcar, diversas aminas nitrogenadas heterocíclicas (bases) se proyectan en secuencias repe tidas (35,74). Existen cuatro aminas de dos tipos: dos bases de purina, adenina y guanina, y dos bases de pirimidina, tim ina y citosina.

130

Pruebas bioquímicas individuales

Pirimidinas (32)

Estructura general

C ito sin a (C ) (2 -o xi-4 -a m in o pirim idina)

Tim in a (T) (2,4 -d io x i-5-m e tilo pirim idina)

Purinas (32)

H Estructura general

A d e n in a (A) (6-am inopurina)

G u a n in a (G ) (2-am in o-6 -oxip urin a)

En los polinucleótidos, los residuos de nucleótido se mantienen juntos por uniones fosfodiéster entre el carbono 3 ’ de un residuo de desoxirribosa y el carbono 5 ’ del residuo de desoxirribosa adyacente (31). La desoxirribosa se une a los carbonos 9 ' y 3 ’ de las purinas y pirimidinas, respectivamente, con una unión (3-glucosídica (12).

, R e sid u o de b ase (B) r (purina adenin a; unión 9 j

Unión (5-g luco síd ica

(36) „ R e sid u o de b ase (B) ' (pirim idina citosina; unión 3 ’) R e sid u o de ácid o fosfórico (P) (fosfato) (unión 3 ’ y 5 ’)

— P — O — H2C

R e sid u o de a zú c a r (S)

O•

-► U nion es fosfodiéster

"O — P — O — etc.

O Existen dos tipos generales de DNA; en el tejido animal y en las levaduras predominan adenina y ti mina, y en las bacterias y en algunos virus de insectos hay un exceso de guanina y citosina (12). Algunas bacterias como Escherichia coli poseen proporciones equimolares de las cuatro bases principales (12). El DNA es una hélice doble con dos cadenas enrolladas de un esqueleto dé complejos azúcar y fosfa to con bases localizadas entre las cadenas para formar una estructura al modo de una escalera (19, 35).

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 131 Las combinaciones de bases purina-pirimidina en una cadena están unidas a las de la otra cadena por puen tes hidrógeno (19, 35,74); una tintina (T) en una cadena se aparea con la adenina (A) exactamente opues ta a ella en la segunda cadena, y la guanina (G) de una cadena se aparea con la citosina (C) de la otra ca dena (71), lo que produce una equivalencia m olar de las bases (19, 30, 35). Las unidades monoméricas del DNA (adenilato, guanilato, citidilato y timidilato; A, G, C, T) consti tuyen una sola hebra de DNA mantenida junta en forma polimérica por puentes fosfodiéster 3’,5’ (30). Las purinas y pirimidinas unidas por puentes hidrógeno se encuentran en pares definidos. Tres puentes de hidrógeno mantienen a la G con la C; A y T están unidas por dos puentes de hidrógeno; en consecuen cia, G:C es el más fuerte de los dos pares (30). Sin embargo, en general, los puentes de hidrógeno son muy débiles y se rompen con facilidad (35). El DNA existe en la naturaleza como una molécula de doble cadena (30). Las dos hebras son antipa ralelas; una hebra se extiende en la dirección 5’ a 3’, la otra en el sentido 3’ a 5 ’ (30). Esto otorga la po laridad de polímero del DNA; un extremo tiene un 5 ’-hidroxilo o fosfato terminal; el otro una molécula 3’-fosfato o hidroxilo (30). Sin embargo, en las bacterias los dos extremos de la molécula de DNA están unidas para crear un círculo cerrado sin elementos terminales; la polaridad no se destruye, pero todos los grupos hidroxilos y fosforilos libres 3’ y 5 ‘ son eliminados (30). El DNA puede ser hidrolizado en forma enzimática a fosfato inorgánico y nucleótidos (12, 31). Los nucleótidos y nucleósidos principales del DNA (9, 12, 83) se muestran en el cuadro 10-1. (etc.)

(etc.)

O CH,

0 1

HO— P = 0

0 = P — OH

0 1

5X (5' a 3')

(5' a 3')

0 1

HO— P = 0

0 = P — OH

I O CH,

0 1 (etc.)

(Redibujado de Holum, J. R. E le m e n ts o f G e n e ra l a n d B io lo g ic a l C hem istry, 4th ed., 1975, p. 512, con autorización de John W iley and Sons, Inc., Nueva York.)

132

Pruebas bioquímicas individuales

Citidina (Redibujado de Harper, H. A., Rodwell, V. W. y Mayes, P. A. R e vie w o f P h y s io lo g ica l C hem istry, 16th ed., 1977, p. 134, con autorización de Lange Medical Publications, Los Altos, California.)

DNA

E n zim a

H20

N ucleótidos

(complejo base-azúcarfosfato) (B-S-P)

^H^Q13

Nucle° sidos

(complejo base-azúcar) (B-S)

+ P/ Fósforo inorgánico (fosfato)

Cuadro 10-1. P rin cip a le s n u cle ó tid o s y n u cle ósid o s d e l D NA B ase

D e s o x irrib o n u cie ó tid o s (B -S -P )

D e s o x irrib o n u cle ó sid o s (B -S )

Adenina (A)

Adenosina-5’-fosfato (AMP, 5’-AMP) (adenosina-5’-monofosfato) (ácido (5') desoxiadenílico) (desoxiadenosina-5’-fosfato) Guanosina-5’-fosfato (GMR 5’-GMP) (guanosina-5’-monofosfato) (ácido (5’) desoxiguanilico) (desoxiguanosina- 5’-fosfato) Citidina-5’-fosfato (CMR 5’-CMP) (citosina-5’-monofosfato) (ácido (5’) desoxicitidílico) (desoxicitidina-5’-fosfato) Timidina-5’-fosfato (TMP, 5’-TMP) (timidina-5’-monofosfato) (ácido (5’) desoxitimidílico) (desoxitimidina-5’-fosfato)

Adenosina

Guanina (G)

Citosina (C)

Timina (T)

Guanosina

Citidina

Timidina

Enzimas DNasas Las enzimas nucleasas capaces de degradar los ácidos nucleicos son clasificadas como: a) endonucleasas, que clivan un puente fosfodiéster interno, produciendo 3’-hidroxilo y 5’-fosforilo o 5 ’-hidroxilo y 3’-fosforilo terminales, o b) exonucleasas, que hidrolizan (clivan) un nucleótido sólo cuando está pre sente en el extremo de una molécula (30). Algunas nucleasas clivan ambas hebras; otras sólo una (30).

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 133 Las propiedades físicas y químicas del DNA difieren de las de los oligonucleótidos o mononucleótidos, y estas diferencias se usan para detectar la hidrólisis del DNA por la DNasa (9). La DNasa puede catali zar la despolimerización del DNA (es decir, rompe la unión de polímeros para formar unidades monoméricas más pequeñas de ácido nucleico DNA) (70). La DNasa es una endonucleasa extracelular (30) que es específica para la hidrólisis (degradación) del DNA (9, 30). La mayoría de las DNasas bacterianas requieren cationes divalentes para su actividad (70, 94), los cuales por lo general son proporcionados por las peptonas en el medio de crecimiento o de prue ba (9). Los límites del pH para la actividad de la enzima varían entre 5,5 y 8,5 (70, 94) y el pH óptimo es de 7,2. Varias DNasas pueden diferenciarse entre sí por las características antigénicas (65, 95) o por las diferencias en la respuesta a inhibidores específicos (6, 13, 45). En la hidrólisis, alrededor de la cuarta parte de los puentes fosfodiéster e hidrógeno de los nucleótidos in ternos que mantienen secuencias complementarias de nucleótidos de DNA son fragmentados, lo que produce una mezcla de oligonucleótidos (cadenas de varios desoxirribonucleótidos). Los oligonucleótidos poseen un 3’-hidroxilo o 3’-fosforita terminal y/o un 5’-tóstbrilo o 5’-hidroxilo terminal (31). La degradación parcial (des polimerización) por la acción de la DNasa, el calentamiento o los pH extremos desnaturalizan el DNA, con los correspondientes cambios en las propiedades físicas; éstas incluyen disminución de la viscosidad en la solu ción de DNA y aumento de la absorción de la luz ultravioleta a 260 mu (31, 96). El efecto de la DNasa es la formación de desoxirribonucleótidos con porcentajes más altos de purinas que el sustrato de DNA (31). Las DNasas están presentes en los extractos de una variedad de microorganismos (79); sin embargo, las DNasas extracelulares se informan en unas pocas especies bacterianas como S. aureus subesp. aureus (16), estreptococos del grupo A (94), Corynebacterium diphtheriae (66), Serrana marcescens (20, 42), Pseudomonas aeruginosa (42), especies de Bacillus (42) y especies de Vibrio (63).

DNasa estafilocócica Tanto S. aureus subesp. aureus como S. epidermidis producen DNasa extracelular (1 ,7 7 ,1 0 0 ); sin em bargo, S. aureus subesp. aureus posee más actividad de DNasa (96, 100) y la prueba de DNasa depende de una discriminación cuantitativa (100). La prueba de DNasa se utiliza principalmente para determinar a los estafilococos patógenos potenciales (23, 26, 96) (p. ej., S. aureus subesp. aureus). La DNasa de S. aureus subesp. aureus, ribonucleato (desoxirribonucleato) 3’-núcleotidohidrolasa (de soxirribonucleasa) (100), difiere de otras DNasas en que requiere calcio (Ca2+) como un catión activador (es decir, cofactor) (24,5 2 ,9 6 ), posee un pH óptimo más alto (8,6-9,0) (96), degrada el DNA ampliamen te (96), presenta una m arcada termoestabilidad y su actividad se correlaciona en alguna m edida con la de la coagulasa (8, 18, 96).

ba:,e

base'

( 32 )

134

Pruebas bioquímicas individuales

La hidrólisis del DNA por la nucleasa microcócica produce sobre todo fragmentos de mononucleótidos y dinucleótidos (70) por el clivaje específico de los puentes entre el carbono-5’ del residuo azúcarfosfato (S-P) unido en el otro extremo al carbono-3’ de un residuo S-P adyacente (31); sus productos ter minales son grupos 3 ’-fosfato (24,70). Los oligonucleótidos que contienen residuos de ácido adenflico o fimidílico son fragmentados de manera preferencial (70) y la DNasa es más activa sobre el DNA desna turalizado que sobre el DNA nativo (70). Ciertos estafilococos saprofíticos relacionados pueden producir DNasa (p. ej., S. epidermidis) (69); sin embargo, la termoestabilidad de la nucleasa producida por todas las cepas de S. aureus subesp. aureus pare ce ser una propiedad constante y singular (5, 52, 55,76, 86, 90, 98 99) y no se informó ninguna DNasa de otra fuente que posea esta característica (52). Lachica y col. (55) encontraron que la producción de nucleasa termoestable parece ser tan precisa como la producción de coagulasa para ser considerada un indicador de S. aureus subesp. aureus; ninguna cepa de S. epidermidis mostró actividad de nucleasa termoestable (99). La DNasa de S. aureus subesp. aureus puede resistir la ebullición (100°C) durante 15 min (16).

DNasa de Serratia La prueba de DNasa muestra ser una ayuda potencial para la identificación de especies de Serrada, sobre todo en cepas no pigmentadas, las que se aíslan con más frecuencia (14, 21, 22,36). Estas cepas no pigmentadas son similares desde el punto de vista bioquímico y morfológico a otros miembros de la fa m ilia Enterobacteriaceae, en particular especies de Kiebsiella-Enterobacter. Rothberg y Swartz (79) y Elston y Elston (22) mostraron que la actividad de DNasa está ausente en las especies de Kiebsiella-En terobacter. Todas las especies de Serratia producen DNasa excepto S. fondeóla (43). La DNasa extracelular de Serrada es una fosfodiesterasa inespecífica (20, 63,79) y los productos principa les déla hidrólisis son dinucleótidos, trinucleótidos y tetranucleótidos cuyo grupo terminal es 5’-fosfato (70). La DNasa es sobre todo endonucleolítica y menos de 2% de los productos de degradación son mononucleótidos; la DNasa puede degradar sustratos de DNA nativo y desnaturalizado, tanto DNA de cadena única como doble, en proporciones similares (70) La producción de la enzima aumenta durante el crecimiento celular (fase logarít mica), alcanza su máximo justo después de la fase estacionaria y declina luego de manera constante (70). La nucleasa de S. marcescens requiere iones magnesio (M g2+) o manganeso (M n3+) para su activación; los límites de pH se encuentran entre 7,0 y 10,0, con un óptimo de 8,5. Es termolábil; el calentamiento a 44°C o superior reduce la actividad enzimática y toda la actividad se detiene después de calentar durante 40 min (70). Las concentraciones de iones de calcio o de sodio (p. ej., CaCl2 o NaCl) por encima de 10* 4 M inhiben la DNasa de Serratia el EDTA 0,1 M la inactiva por completo (70) Las diferencias entre las DNasas de S. aureus subesp. aureus y de S. marcescens (70) se muestran en el cuadro 10-2.

Cuadro 10-2. Diferencias entre las DNasas de S. aureus subesp. aureus y de Serratia marcescens S. a u re u s subesp. a u re u s

S. m a r:e s c e n s

Ca2+ 8,6-9,0

Mg2+ o M n ^ 7,0-10,0 8,5 Termolábil (sensible al calor) Nativo y desnaturalizado; de cadena única o doble Dinucleótidos, trinucleótidos y tetranucleótidos 5’-fosfato

Iones requeridos para la activación Límites de pH pH óptimo Calentamiento, 44BC o mayor Tipo de sustrato de DNA preferido

Termoestable (resistente al calor) Desnaturalizado

Principales productos formados

Mononucleótidos y dinucleótidos

Productos terminales

3’-fosfato

Datos de la referencia 70.

DNasa estreptococia Las DNasas extracelulares estreptocócicas (42, 83) A, B, C y D son enzimas distintas desde el punto de vista serológico que degradan el mismo sustrato (DNA) (83). La nucleasa B estimula la producción de anticuerpos que son un índice útil de infección estreptocócica. Todos los estreptococos del grupo A pro ducen DNasa así como los de algunos otros grupos de Lancefield (94). L a DNasa de los estreptococos del grupo A da productos con una longitud de cadena de 3 a 10 unidades de desoxirribonucleótidos junto con mononucleótidos (94)*. Las DNasas estreptocócicas requieren iones magnesio (Mg2+) para su activación

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 135 (83). Las nucleasas extracelulares son producidas principalmente por las mismas especies que producen proteasas del tipo de las gelatinasas (3).

IV.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: PRUEBA DE DNASA EN AGAR (DTA) ESTÁNDAR

A. Procedimiento de la prueba de ácido-DNasa de Jeffries, Holtman y Guse (42); prueba de precipitación. B. Ingredientes, pH 7,3 ± 0,2 Ácido desoxirribonucleico (DNA), 0,2% 2g Digerido pancreático de caseína, USP 15 g Digerido pálmico de harina de soja, USP 5g Cloruro de sodio, NaCl 5g Agar, 1,5% 15 g 1.000 mL Agua desionizada C. DNA: Sigma Chemical Co. (87) (véase Apéndice 11)‘.“ D. Productos comerciales (3) (véase Apéndice 11). 1. Agar termal. 2. Agar termonucleasa; REMEL. E. Método de preparación 1. Pesar con precisión las cantidades según las indicaciones del rótulo del envase. Los diversos pro ductos comerciales pueden presentar leves diferencias. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar con suavidad la solución para evitar la formación de hebras de proteína insoluble (48). F. Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. G. Colocar los frascos del medio esterilizado en un baño de agua a 50°C para disminuir la temperatura, pero sin que se solidifique el medio. 1. De manera periódica durante el enfriamiento, extraer los frascos del baño de agua y colocar con tra el antebrazo. 2. Si está frío al tacto, el medio está a la temperatura correcta para verter. 3. Nunca coloque un termómetro no estéril dentro del frasco para verificar la temperatura. H. Verter en placas de Petri plásticas (o de vidrio) descartables preesterilizadas (15 x 100 mm). 1. Abrir el envase de placas comerciales de manera cuidadosa por un extremo y conservar las bolsas para el posterior almacenamiento. 2. Flamear las bocas de los frascos y verter alrededor de 12-15 mi.'placa. 3. Si aparecen burbujas de aire en las placas vertidas, pasar la llama del mechero de Bunsen rápida mente sobre el agar antes de que solidifique. 4. Dejar que solidifique el agar en una posición vertical con las tapas ligeramente entreabiertas para evitar el exceso de humedad. I. Incubación; control de esterilidad 1. Posición invertida (la tapa en el fondo); 35°C, 18-24 h. 2. Descartar todas las placas que muestren alguna contaminación o áreas mal mezcladas del medio. J. Conservación 1. Refrigeración, 4-10°C. 2. Posición invertida. 3. Es preferible guardar en las bolsas para minimizar la pérdida d e ^ u a (las bolsas originales reser vadas de IV.H .l, antes). K. Inoculación (18, 42, 79) 1. Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h; caldo infusión de cerebro y corazón (BHI), agar in fusión de corazón (HLA) en pico de flauta, placas de agar con sangre de oveja (SBA), agar con hie rro de Kligler (KIA) u otro cultivo apropiado. 2. Se pueden sembrar de 4 a 8 microorganismos de prueba en una única placa. 3. Dos métodos, ambos utilizan una aguja de inoculación. a. Inoculaciones en estría (es decir, línea) (1) Inoculo denso (63). (2) Por lo menos 2,50-3,75 cm de largo. (3) Del borde al centro de la placa. b. Inoculaciones en mancha (1) Inóculo denso.

136

Pruebas bioquímicas individuales

(2) Diámetro de 0,3 a 0,6 cm. L. Incubación (1 8,42,79): 35°C; 18-24 h o un período y una temperatura convenientes para los m icroor ganismos a ser probados. 1. Continuar la incubación hasta 36 h, si es necesario, para obtener un buen crecimiento. 2. Incubar por lo menos 24 h antes de informar un resultado negativo. M. Agregar directamente el reactivo H C11 N a la placa incubada antes de intentar la interpretación; per mitir que las placas permanezcan verticales (la tapa hacia arriba) para evitar el derrame del reactivo, ya que tarda unos pocos minutos para absorberse en el medio. La composición del medio de cultivo, la cantidad de aireación, el pH, la temperatura y el período de incubación son factores importantes en la actividad de DNasa cuando se cultivan y prueban micrococos (96). Weckman y Catlin (96) encontraron que el BHI producía los niveles más altos de actividad de DNa sa en los micrococos, mientras que las actividades en los cultivos en caldo con tripticasa soja (TSB), cal do de fosfato triptosa o infusión de corazón (HI) se incrementaron con el suplemento con extracto de le vadura. La actividad aumenta aún más cuando se agitan los cultivos (aireado) a temperatura ambiente durante 40-72 h. Jeffries y col. (42) mostraron que los microorganismos son más exigentes para la pro ducción de la enzima con el pH que con la temperatura. Zierdt y Golde (100) recomiendan agregar m a rin a y tiamina (5 |ig/m L) a las placas de la DTA estándares, las que aumentan de manera notable la can tidad de reacciones positivas. En el caso de los microorganismos más exigentes para su desarrollo, puede agregarse sangre al medio de DTA (p. ej., estreptococos). En el caso de la DTA preparada desde el principio, se dispone de sustrato DNA comercial en diversos grados de pureza: el de mayor calidad y más polimerizado deriva del timo de ternero (Sigma Chemical Co.), el de calidad intermedia no es altamente polimerizado y el DNA crudo proviene del esperma de aren que (100) (véase Apéndice 11). Zierdt y Golde (100) mostraron que el DNA purificado dio 100% de reac ciones positivas con zonas más grandes con cepas estafilocócicas atípicas y que el DNA crudo fue dema siado insensible para la producción de nucleasa. Cuanto más baja la pureza del DNA utilizado, se tom a menos sensible la prueba para la producción de nucleasa. Sin embargo, Zierdt y Golde (100) encontraron que el DNA de más baja calidad permitió diferenciar mejor entre S. aureus subesp. aureus y S. epidermidis porque la pequeña cantidad de DNasa producida por S. epidermidis no se detecta, y de allí, la produc ción de DNasa indica S. aureus subesp. aureus. La vida útil de conservación de la solución de DNA es de 3 meses a -10°C si los tubos están cerrados de manera hermética (2 8 ^ a

V. AGREGADOS ALTERNATIVOS AL MEDIO DE DTA A. Manitol 1. Incorporación de manitol al 1% e indicador de pH antes de la esterilización (15). 2. Indicador de pH: azul de bromotimol o rojo fenol. a. Alcalino: rojo (rojo fenol); azul de Prusia (azul de bromotimol). b. Ácido: amarillo; rojo fenol y azul de bromotimol. 3. Permite observar la utilización del manitol, indicada por zonas amarillas alrededor de las colonias. 4. El posterior agregado de ácido puede usarse entonces para detectar la producción de DNasa en la misma placa. (Nota: Varios sistemas de colorantes indicadores se incorporan directamente al medio, lo que elimina la necesidad de usar un reactivo (p. ej., HC1 1 N) para demostrar las bacterias productoras de DNasa específica (84).) Las ventajas de los medios de DTA-TBO y de DTA-MG radican en que las colonias pueden exami narse a simple vista en la placa, sin el uso de un reactivo adicional; por consiguiente, si el crecimiento de la colonia es insuficiente en un período de incubación normal o existen zonas cuestionables de actividad de DNasa, los placas pueden ser reincubadas y reexaminadas y las colonias pueden ser subcultivadas, si es necesario, ya que los microorganismos aún son viables (84). B. Modificaciones de la prueba de DNasa en medio con agar-azul de toluidina O (DTA-TBO, TBO-

DTA, DTB) 1. Procedimientos de Waller, Hodel y Ñutí (91); modificación de los procedimientos de Schreier (80) y Jeffries y col. (42).

Pruebas de desoxirribonudeasa (DNasa) y lermonucleasa (TNasa) 137 (Nota: Existen dos procedimientos; es importante conocer que la concentración de TBO varía de acuer do con el procedimiento utilizado.) a. Anegación del TBO (1) Según los estudios realizados por Waller y col. (91), la técnica de anegación produce mu chas más zonas delineadas de actividad de DNasa que la prueba de DNasa por precipitación del DNA con H C 11,0 N. (2) Concentración final de TBO: 0,05% (91). (3) Crecimiento anegado de colonias con 5,6 mL de solución TBO. (4) Dejar en posición 3-5 min y decantar. (5) Leer con intervalos de 5 min hasta los 30 min. b. Incorporación de TBO en el medio de prueba para DNasa (1) La incorporación de TBO en la DTA demuestra la producción de DNasa con más claridad que la prueba de DNasa por precipitación del DNA con HC1 (91). (2) Agregar TBO al medio de DTA antes de la esterilización. (3) Concentración final óptima de TBO, 0,005%; límites aceptables 0,0025-0,0075% (91) 2. Procedimiento de Lior y Patel (60) para especies de Campylobacter, recomendado como un reemplazo para la DTA-MG utilizada en el esquema de biotipificación de Lior (59) para las campilobacterias. a. Buffer Tris (1) 0,05 M; pH 9,0. (2) Preparado de acuerdo con las directivas del fabricante de TRIZMA-9,0; Sigma Chemical Co. (Véase Apéndice 11). b. Medio DNA Cloruro de calcio, 0,01 M Cloruro de sodio, NaCl Agar, 6,5% Buffer Tris (véase antes)

0,3 g 1 mL 10 g 6,5 g 1.000 mL

c. Calentar hasta la ebullición (100°C) 25 min o hasta que el agar y el DNA estén disueltos por completo. d. Enfriar a 50°C. e. Agregar 2,5 mL de una solución al 3% de TBO en agua destilada (coloración certificada; Fisher Scientific Co.); pH final, 8,7. f. M ezclar bien y distribuir; no se requiere esterilización. (1) Frascos o botellas para conservación; estable hasta 3 meses a temperatura ambiente (2225°C). (2) Alícuotas de 25 mL/placa de Petri (90 mm). g. Incubación 24-48 h; mejores resultados a 43°C, 48 h. El TBO permite el crecimiento y la producción de DNasa por bacterias grampositivas y gramnega-

tivas; proporciona mejor delincación de la actividad de DNasa (91). 3.

Procedimiento de Soto-Hernández, Nunley, Holtsclaw-Berk y Berk (85) a. Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento primario rápido de M. catarrhalis (+) (antes B. catarrhalis) de las especies de Neisseria ( -) en cultivos mixtos; suprime el creci miento de otra flora del tractbTespiratorio superior. Utilizado en el cultivo de esputo sistemáti co cuando el extendido con la coloración de Gram demuestra la presencia de células inflama torias y diplococos gramnegativos. b. Medio; agar de prueba para DNasa, 42 g/L, pH 7,26 ± 0,2, al cual se agrega: Vancomicina Trimetoprima Anfotericina B

10 pg/mL 8 pg/mL 2 pg/mL

c. Inoculación: inoculo denso; hasta 8 inóculos/placa. d. Incubación: 35°C, C 0 2 al 5%, 48 h. e. Colonias anegadas (cubiertas) con 1 gota de solución TBO tamponada al 0,04%.

138

Pruebas bioquímicas individuales (1) TBO, Fisher; contenido real de colorante del 57%; factor de conversión (CF) 100 dividido por el contenido real utilizado para preparar la concentración de solución. (2) Buffer Tris-clorhidrato, 0,20 M, pH 7,8. (3) Filtrar la mezcla con un filtro con un tamaño de poro de 0,2 |i. f. Resultados dentro de los 15 min (1) Positivo (+) (a) El colorante alrededor de la colonia forma un halo magenta, estable durante 2-4 h. (b) Indica interacción del colorante tanto con el agar como con el DNA hidrolizado. (2) Negativo (-) (a) El medio permanece de un color azul real oscuro. (b) Una gota de TBO tamponado en un área de la placa donde no hay ninguna colonia pro porciona un color de contraste.

El TBO es un colorante (80) que exhibe metacrom asia, una propiedad en la que el colorante no ti ñe con su color verdadero debido a complejos formados con algunas sustancias que cam bian el espec tro de absorción del colorante original (17, 68). La coloración verdadera u ortocrom ática del TBO es el azul real; la coloración m etacrom ática es el rosa-rojo-violeta (58). Cuando el TBO form a un com plejo con el DNA no hidrolizado, se produce un color azul real; sin embargo, cuando el DNA es hidro lizado y el TBO se com bina con oligonucleótidos o m ononucleótidos que cambian la estructura del co lorante, el espectro de absorción resultante cam bia a una longitud de onda de luz diferente, que da un color rosa brillante que es el patrón m etacrom ático o de coloración del TBO (9, 68, 91). El TBO pue de inhibir las bacterias grampositivas y los estafilococos pueden no crecer en este medio (9). Las preparaciones del colorante TBO comerciales contienen cantidades reales del colorante que va rían de 60 a 95% (91). El contenido de colorante, como figura en los rótulos comerciales, debe corregir se de modo tal que las soluciones del colorante y los medios de cultivo contengan el porcentaje deseado de colorante en lugar del porcentaje proporcionado por el fabricante (91). Un factor de conversión debe ser incluido para considerar el contenido verdadero de colorante: CF (factor de conversión) = 100 -t % de colorante en la preparación comercial. Polvo requerido (en g) -t 100 mL de colorante en agua o agar = % de colorante requerido x CF C.

Prueba de DNasa en agar con verde de metilo (DTA-MG) 1. Procedimiento de Smith, Hanco*ck y Rhoden (84) con modificación de Jeffries y col. (42). 2. Solución stock a. Colorante verde de metilo (MG) (Fisher, Difeo; véase Apéndice 11). b. Preparar una concentración al 0,5% en agua destilada o desmineralizada; 0,5 g/100 mL. c. Extraer en forma repetida con volúmenes iguales de cloroformo. (1) Por lo común 6-7 extracciones. (2) Continuar hasta que la capa de cloroformo sea incolora. d. Esterilizar por filtración. e. Conservar en botellas de vidrio para reactivos a 4°C. 3. Solución de trabajo a. Agregar 1 mL de solución de colorante stock M G a cada 100 mL de medio de DTA disuelto estéril; 10 mL/L. b. Concentración óptima final del colorante, 0,005%. 4. Favorece el crecimiento tanto de bacterias grampositivas como gramnegativas.

El M G requiere un sustrato de DNA altamente polimerizado (54). Se combina con el DNA polimerizado para formar un complejo estable, verde, a pH 7,5 (48-50). A medida que progresa la hidrólisis a pH 7,5, el MG se libera; cuando no se combina a este pH, el MG se aclara y se toma incoloro (48,50). El "iclaramiento no es instantáneo; insume 4-6 h (48,50). Según Smith y col. (83), la incorporación de MG en el medio de DTA ofre ce un medio mejorado, altamente sensible, que puede utilizarse para el aislamiento primario de S. aureus subesp. aureus y de S. pyogenes del grupo A, así como para los miembros de la familia Enterobacteriaceae.

VI. REACTIVO EMPLEADO: ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCI) 1 N (42, 74)_________________

A. Método de preparación, concentración 1 N (N/l) (42) 1. A un frasco graduado de 1 L, agregar alrededor de 250 mL de agua destilada o desmineralizada.

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 139 2. No pipetear el HC1 concentrado con la boca. Utilizar una pipeta con bulbo (Propipeta). A gre gar 90 mL de HC1 concentrado al frasco, permitiendo que el ácido se escurra con lentitud por la parte lateral del frasco inclinado con suave y lenta agitación con movimientos envolventes para mezclar bien. 3. Desechar la pipeta en un recipiente apropiado. 4. Llevar el volumen a 1 L con agua destilada o desmineralizada. 5. El HC1 concentrado es sum am ente cáustico y cualquier salpicadura puede causar quem adu ras. Si se produce algún contacto con la piel, lavar el área de inmediato con abundante agua corriente fría. 6. Conservar en frasco de vidrio con tapón en alícuotas pequeñas; por ejemplo, 100 mL. B. Método de uso 1. Procedimiento de Jeffries, Holtman y Guse (42). 2. Anegar las placas de la DTA incubadas con H C 11 N. C. Química de acción del reactivo: en un resultado de la prueba positivo, los oligonucleótidos liberados por la hidrólisis se disuelven en el ácido; el tamaño de la zona clara se relaciona con la cantidad de en zima exocelular producida (42). Adyacente a la zona clara siempre se observa una zona blanca nubla da (nebulosa) debido a la reacción del HC1 con las sales de DNA-en el medio (23). El DNA no hidrolizado es insoluble en el ácido, y el ácido precipita las sales en el medio, lo que lo tom a nebuloso (42).

Vil. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Prueba de DNasa en agar 1. Positivo (+) Staphylococcus aureus subesp. aureus Streptococcus pyogenes 2. Negativo (-) Staphylococcus epidermidis

ATCC 25923 ATCC 19615

ATCC 12228

B. DTA-TBO/DTA-MG 1. Positivo (+) Serrada marcescens

ATCC 13880

2. Negativo (-) Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

VIII.

ATCC 33495

RESULTADOS Véanse figuras 10-1 a 10-4 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color.

IX.

INTERPRETACIÓN

A. Medio de ácido-DTA estándar (42) 1. Positivo (+) a. Zona de aclaramiento inmediato alrededor de la colonia bacteriana (inoculo en estría o en man cha). b. Adyacente a la zona clara una zona blanca, nublada; sales precipitadas en el medio. c. Hidrolizado de DNA (despolimerizado). d. El tamaño de la zona se relaciona con la cantidad de DNasa producida. 2. Negativo (-) a. Ausencia de aclaramiento alrededor de las colonias. b. Precipitado nebuloso alrededor de la colonia y a lo largo del medio (23) debido a las sales pre cipitadas en el medio. c. DNA no hidrolizado.

B. Medio de ácido manitol-DTA estándar 1.

Utilización del manitol

140

Pruebas bioquímicas individuales

a. Fermentación (F): zonas amarillas alrededor de las colonias; producción de ácido. b. Ausencia de fermentación (NF): el medio permanece sin cambios; color naranja roji*zo. 2. Hidrólisis del DNA (+): igual que en el procedimiento de ácido estándar (véase Sección VIII. A, antes). C. DTA-TBO (9, 10, 17, 80) 1. Positivo (+) a. Zona de color rosa brillante alrededor de la estría (o mancha) de la siembra; fondo azul real. b. Producción de DNasa. 2. Negativo (-) a. Sin cambio en el color del medio. b. El medio permanece igual que el medio no inoculado, azul real claro. D. DTA-M G (10, 84) 1. Positivo (+) a. Zona clara nítida alrededor de la estría (o mancha) de la siembra en el agar verde. b. Zonas claras observadas mejor contra un fondo blanco. 2. Negativo (-) a. Sin cambio en el color del medio. b. El medio permanece igual que el medio no inoculado, color verde.

PRUEBAS DETERMONUCLEASA

(Nota: La actividad de TNasa se utiliza para la detección rápida de S. aureus subesp. aureus en los ali mentos (25, 44, 56, 73) y en los hemocultivos (5, 25, 62, 66, 75, 76).)

Prueba de TNasa para hemocultivos (62, 75) 1. Procedimiento de Madison y Baselski (62). ' 2. Objetivo: diferenciación rápida de S. aureus subesp. aureus (+) de especies de la familia Micrococcaceae en hemocultivos. 3. Controles: deben provenir de botellas para hemocultivos que contengan sangre y una cepa positi va conocida de S. aureus subesp. aureus y una cepa de estafilococo negativa conocida (p. ej., S. epidermidis). Los controles y las muestras se procesan en forma simultánea. Las botellas de prue ba control pueden ser utilizadas hasta 1 semana y conservadas a temperatura ambiente (22-25°C). 4. Muestras: sólo las botellas que muestran cocos grampositivos dispuestos en forma de racimos en la coloración de Gram directa. 5. Procedimiento a. De m anera aséptica, con una pipeta capilar estéril, sacar 2-3 mL del caldo con sangre, incluso los glóbulos rojos (GR) y colocar en un tubo con tapa a rosca estéril. b. Colocar en un baño de agua hirviente (100°C), 15 min. c. Enfriar a temperatura ambiente (22-25°C). 6. Medio: placa de DTA-TBO (15 x 100 mm) a. Con la pipeta capilar estéril, realizar 12 orificios/placa; diámetro de 6 mm. b. Con la pipeta estéril, agregar 2-3 gotas de caldo enfriado a cada orificio. Las placas pueden usarse en días sucesivos siempre que se utilicen un control positivo y uno negativo. 7. Controles de calidad: los mismos que para el procedim iento de la prueba en agar para ácidoDNasa. 8. Interpretación a. Positivo (+) (1) Zona rosa de aclaramiento en el borde del orificio con un anillo azul más oscuro en la peri feria más externa de la zona. (2) Actividad de TNasa; S. aureus subesp. aureus presuntivo. (3) Informe: “indica S. aureus subesp. aureus”. b. Negativo (-) (1) Medio sin cambio; ausencia de actividad de TNasa. (2) Informe: “cocos grampositivos dispuestos en racimos; sin S. aureus subesp. aureus”

Madison y Baselski (62) mostraron que la actividad de TNasa de S. aureus subesp. aureus debe ser de tectable en los hemocultivos cuando la coloración de Gram muestra cocos grampositivos dispuestos en

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 141 racimos. La identificación en las botellas para hemocultivos en aerobiosis y anaerobiosis ocurrió tan pronto como a las 12 h posteriores de la recepción de las muestras en el laboratorio (62). Los estudios y confir maciones (5 ,6 6 ,7 6 , 82) mostraron 100% de concordancia entre la determinación de TNasa directa en los hemocultivos y las pruebas de coagulasa en tubo posteriores por los procedimientos estándar. S. epiderm idis es el estafilococo coagulasa negativo encontrado con más frecuencia en los hem o cultivos (64, 81); esta especie no se ha identificado com o una de las que puede dar un resultado de TN asa positivo (27).

B. Prueba de termonucleasa simplificada (STN) 1. Procedimiento de Lachica para alimentos (51). 2. M edio en placas para el aislamiento selectivo de S. aureus subesp. aureus; varias opciones. a. M edio de Baird-Parker. b. Agar con telurito, polimixina y yema de huevo. c. Agar con telurito y glicina. d. Agar con yema de huevo y azida sódica. 3. Medio en placa selectivo con desarrollo de colonias precalentadas. a. Estufa a 60°C, 2 h. b. Inactiva las nucleasas producidas por bacterias que no pertenecen a S. aureus. 4. Recubrir las placas precalentadas con 10 mL del medio de DTA-TBO disuelto e incubarlas a 35°C, 3 h. 5. S. aureus subesp. aureus: halos de color rosa brillante alrededor de las colonias; el diámetro del halo vana entre las cepas.

C. Técnica en portaobjeto de difusión en agar metacromático (MAD) 1. Procedimiento de selección de Lachica, Hoeprich y Franti (54). 2. Ensayo cuantitativo para la TNasa estafilocócica en sistemas heterogéneos; por ejemplo, caldo y leche. 3. Reactivo M AD (solución de enzima) a. A gar tamponado (pH 9) con bN A , TBO (indicador) y agar con hierro No. 2. b. Preparado como fue descrito por Lachica y col. (53), en inmunoplacas plásticas (2,5 x 7,5 cm). c. Sumamente estable; los portaobjetos pueden secarse y conservarse. 4. Procedimiento a. Pipetear 3,0 mL de reactivo disuelto sobre la inmunoplaca; profundidad 1,6 mm. b. Dejar solidificar y hacer orificios de 2-3 mm de diámetro; hasta 10-20 orificios equidistantes por placa c. Llenar los orificios con suspensiones de caldo de cultivo de una noche (p. ej., BHI) de los esta filococos a ser probados, colocar en vapor a 100°C, 15 min, 2-3 ansadas. d. Cubrir para minimizar la desecación (secado). e. Incubación: 35°C, 3 h. 5. Reacción positiva a. Halo rosa (zona de hidrólisis) alrededor de los orificios; producción de DNasa. b. Determinación cuantitativa por medición del diámetro de la zona. El diámetro de la zona se re laciona y es afectado de manera significativa por la concentración de reactivo y por el tiempo y la temperatura de incubación Las concentraciones tan bajas como 0,05 (tg/mL y tan altas co mo 2,0 jxg/mL pueden determinarse después de 3 h a 35°C (54). Las ventajas de la técnica MAD son que no se requiere DNA altamente polimerizado y que pueden obtenerse resultados cuantitativos reproducibles con sistemas no puros, opacos, que contienen concentra ciones altas de proteínas (54).

D. Cubiertas de agar desoxirribonucleato con naranja de acridina (ADA) 1. Procedimiento de Lachica y Deibel (52) 2. M ezcla de cubierta ADA; dos opciones (véase Apéndice 11 para los productos comerciales), a. Ingredientes, pH 9 ± 0,2 Naranja de acridina (Eastman Organic Chemicals) Desoxinucleato de sodio (Sigma Chemical Co.) Fosfato dipotásico, K2HP04 Agar (1%) Agua desionizada

1 mg 15 mg 0,5 g lg 100 mL

142

Pruebas bioquímicas individuales

b. Solución stock de naranja de acridina (AO) al 0,4% (Matheson, Coleman y Bell o Eastman Or ganic Chemicals); 1 mL de solución stock por cada 100 m L del medio de DTA (69). c. Esterilizar en autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min y enfriar a 50°C. d. Estable 4 semanas en botellas con tapa a rosca; mejores resultados cuando se somete a varios ciclos de fundición. 3. Dos procedimientos a. Cubierta de colonia (semisólida) (1) Detecta sólo actividad de DNasa. (2) M edio de crecimiento (a) Placas de DTA; véase medio ácido estándar de Jeffries y col. (42), sección IV. (b) Estriar para el aislamiento. (3) Antes de la incubación, anegar la placa con 8-10 mL de mezcla ADA. b. Cubierta de discos con caldo (1) Detecta la actividad de DNasa de varios microorganismos y la resistencia de TNasa de Staphylococcus. (2) Medio de crecimiento: cultivo en caldo BHI durante la noche. (3) Prueba de agar base: medio de DTA fortificado con 1,5% de triptona, 0,5% de fosfato dipo tásico (K2H P 0 4) y 2% de agar. (4) Comprobación (a) Agregar 1 gota de cada cultivo en caldo a ser probado en un disco de papel (1,27 cm de diámetro). (b) Si la prueba confirma estafilococos, calentar el caldo restante hasta la ebullición ( 100°C) en un baño de agua durante 15 min. 1. Enfriar y agregar 1 gota de cada cultivo a otro grupo de discos en placas de Petri, ro tuladas de m anera adecuada. 2. Determinar la resistencia al calor de la DNasa estafilocócica. (c) Colocar los discos sobre la superficie de agar base fortificado y cubrir con 10 mL de mezcla ADA; comprobación de la actividad de DNasa. 4. Incubación; cualquier procedimiento a. 35°C; en posición vertical (tapas hacia arriba). b. 1-5 h; o a la temperatura favorable para la actividad de DNasa de los microorganismos de prue ba (controles). Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus subesp. aureus Bacillus subtilis

ATCC 13880, 3-4 h ATCC 10145, 3-4 h ATCC 25924, 2-4 h ATCC 6051, 2-5 h

5. Observar las placas en un cuarto oscuro bajo luz ultravioleta. 6. Interpretación (cuadro 10-3).

Cuadro 10-3. Resultados de ADA de S. aureus subesp. aureus y Serratia marcescens Staphylococcus aureus subesp. aureus Serratia m arcescens

N o ca le n ta d o

C a le n ta d o

+ +

a. Cubiertas de la colonia o caldo de cultivo no calentado (disco) (1) Positivo (+) (a) Halos claros no fluorescentes alrededor de las colonias o de los discos. (b) Microorganismos productores de DNasa. (2) Negativo (-) (a) Fluorescencia; color verde luminoso en el medio. (b) DNA intacto; ausencia de DNasa. b. Cubierta del caldo de cultivo calentado (disco) (1) Positivo (+) (a) Halos claros no fluorescentes alrededor de los discos; S. aureus subesp. aureus produc tor de DNasa.

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 143 (b) S. aureus productor de DNasa resistente al calor; se ha informado que la DNasa de nin guna otra fuente posee esta característica (16). (2) Negativo (-): microorganismos no productores de DNasa o productores de DN asa termo-

lábil. Ambos procedimientos evitan el agregado directo de la mezcla de ADA al medio de crecimiento, lo cual elimina la posibilidad de efectos mutagénicos o de episomas (52). Los episomas son una clase de elementos genéticos bacterianos que existen como segmentos cromosómicos o como fragmentos extracromosómicos que se reproducen de manera autónoma; contienen DNA (11) y pueden ser eliminados por tratamiento con colorantes de acridina (88). El naranja de acridina (Trad) (naranja básico), un colorante básico que imparte un color naranja-ama rillento con fluorescencia verde, se utiliza como un fluorocromo para los ácidos nucleicos (58). El naran ja de acridina reacciona fuertemente con los ácidos nucleicos; en concentración baja, prevalece el catión fluorescente verde monovalente (58). La fluorescencia es la absorción de una longitud de onda y la em i sión de otra (71).

XI. PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS PARA LA PRUEBA A. Método rápido de difusión en orificios en el agar 1. Procedimiento de Hanninen (29). 2. Objetivo: detección de la producción de DNasa por C. jeju n i, C. coli, C. lari (antes C. laridis (44)) y H. pylori (antes C. pylori). 3. Suspensión celular de microorganismos de prueba a. Suspensión densa en buffer Tris, pH 7,3. Las campilobacterias son malas productoras de D N a sa (29). b. M edios de cultivo de crecimiento; opciones (1) C. jejuni y C. coli: placas de agar con sangre para Brucella. (2) H. pylori: infusión de cerebro y corazón (BHI). 4. Pretratamiento con polimixina B a. Un antibiótico policatiónico que mejora la sensibilidad cuando se agrega a una suspensión de microorganismos de prueba antes de la inoculación en los orificios de prueba en el agar. b. Incrementa la pérdida de DNasa por los límites celulares. 5. Medio: DTA. 6. Inoculo a. 50 (J.L (2 mg/mL) agregados a 0,5 mL de una suspensión bacteriana d en sa en buffer Tris. M an tener a 4°C, 15 min. b. Dos orificios/microorganismo de prueba; con pretratamiento y sin él. 7. Controles a. Dos especies conocidas de Campylobacter, una positiva y otra negativa. b. Un orificio sólo con buffer Tris y polimixina B. 8. Incubación: en aerobiosis, 35°C examinar a las 4, 8, 20 y 40 h. 9. Resultados a. Positivo (+): zona rosa intenso con los bordes definidos alrededor de los orificios. b. Negativo (-): zonas incoloras o ligeramente rosadas, angostas, con bordes irregulares. Según Hanninen (29), el método de difusión de agar es más confiable para la detección de DNasa con cepas de H. pylori que no desarrollan bien en el medio de DTA. El pretratamiento con polimixina B acortó el tiempo de detección para resultados visibles en 8 h con C. jejuni y C. coli (29). Los resultados se confir maron después de 20-24 h cuando las zonas rosas eran más grandes que las de las células no tratadas; sin embargo, el pretratamiento no aumentó el ancho de las zonas rosas con H. pylori (29), lo que sugiere la pre sencia de DNasas asociada a las células y extracelular en C. jejuni y C. coli. H. pylori posee sólo DNasa ex tracelular, ya que el pretratamiento con polimixina no incrementa el ancho de las zonas rosas.

B. Prueba de nucleasa estafilocócica por ensayo turbidimétrico 1. Procedimiento de Erickson y Deibel (24). 2. M odificación del procedimiento espectrofotométrico de Houck por estimación turbidimétrica de RNA y DNasa (37, 38).

144

Pruebas bioquímicas individuales

3. Ensayo en tubo de DNasa y diferenciación entre actividad de nucleasa termolábil y termoestable. 4. El caldo de cultivo de que contiene DNA es desnaturalizado con el calor y la turbidez formada con la acidificación que es leída con un espectrofotómetro; se relaciona de manera directa con la can tidad de ácido nucleico no hidrolizado presente. 5. Ensayo basado en la relación entre la turbidez y la cantidad de DNA presente capaz de ser precipitado. 6. La disminución de la turbidez indica lúdrólisis del DNA.

Determinación indirecta rápida de la actividad de DNasa

1. Procedimiento de Wolf, Horwitz, Mandeville, Vaquez y von der Muehll (97). 2. Sustitutos 5-bromo-4-cloro-3-indoil-timidina-3-fosfato para el sustrato DNA. a. El sustrato sustituido posee puentes fosfato similares a los del DNA, los que son fraccionados por la DNasa. b. Localiza endonucleasa fosfodiesterasas. c. Sustrato fragmentado en el sitio de unión del anillo indolil a la timidina-3-fosfato. d. Solución de prueba (1) M uy costosa. (2) 2 mL de buffer acetato de sodio, pH 5,2, 0,1 M en 2 mg de sustrato de indolil fosfato. 3. Inoculación e incubación: 35°C; reacción dentro de las 4 h; intensificada después de 18-24 h. 4. Positivo (+). azul-verde-índigo en toda la solución incubada y en el desarrollo bacteriano en el fon do del tubo de prueba. 5. Reacción indigogénica (97).

Indolil fosfato (incoloro)

Indolil - 2 moléculas

Indolil

Ácido fosfórico

Azul verde-índigo Insoluble depositado en el sitio de la enzima

D. Prueba de DNasa acidométrica 1. Incluida en el sistema API Quad Ferm + Strip (véase Apéndice 11). 2. Identificación de Neisseria; método de degradación de hidratos de carbono en 2 h (39). E. Agar DNA de Lombard-Dowell (39); cuadrante en Presumpto Quadrant Plate #2 (43).

XII.

PRECAUCIONES

A. Generales 1. La mayoría de las DNasas bacterianas requiere cationes divalentes para su actividad. 2. Los procedimientos cuantitativos para demostrar la actividad de DNasa son laboriosos, complica dos y, en algunos casos, afectados por la pureza de la enzima y las preparaciones del sustrato (94). 3. La detección de nucleasas es muy sensible a la temperatura ambiente (22-25°C) (3).

B. Identificación de S. aureus subesp. aureus 1.

La actividad de DNasa se utiliza sobre todo para determinar o confirmar las cepas patógenas po tenciales de S. aureus subesp. aureus (23, 26, 41, 96) y para diferenciar S. aureus subesp. aureus de S. epidermidis. La correlación entre la producción de coagulasa y de DNasa de S. aureus su besp. aureus varía entre los investigadores (8, 18, 23, 41, 69, 96, 99, 100). leffries (41) mostró

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 145 91,3%(de correlación entre la producción de coagulasa y de DNasa; más discordancia provino de la producción de DNasa por cepas coagulasa negativas junto con unas pocas cepas que eran coa gulasa positivas, pero DNasa negativas. M orton y Colín (69) encontraron que 98% de los cultivos de S. aureus subesp. aureus coagulasa positivos y 13,5% de S. epidermidis coagulasa negativo pro dujeron DNasa; estos resultados también fueron obtenidos por Zarzaur y Belle (99). S. aureus su besp. aureus puede perder su capacidad de coagular el plasma a través de mutaciones pero aún ser patógeno (23). M orton y Cohn (69) mostraron que la producción de DNasa se correlaciona mejor con la producción de coagulasa que con la fermentación del manitol. La prueba de DNasa no puede ser confiable como el único criterio para la identificación de S. au reus subesp. aureus (40, 99), pero cuando las cepas dan reacciones de coagulación dudosas (1+ o 2+ en la prueba de coagulasa) un resultado de DN asa positivo confirma S. aureus subesp. aureus (99). M orton y Cohn (69) establecieron que la coagulasa y la DNasa pueden ser útiles para iden tificar S. aureus subesp. aureus, pero estas propiedades no deben tomarse como indicación de patogenicidad ni como su ausencia, es decir, falta de patogenicidad. No existe ninguna prueba in vitro confiable para determinar la potencial patogenicidad de los estafilococos para el hombre. La confianza total en la producción de DNasa para detectar S. aureus subesp. aureus coagulasa posi tivo puede dar como resultado el hecho de pasar por alto algunos estafilococos (84, 100). La com probación de la DNasa debe ser una prueba complementaria para ayudar a identificar S. aureus su besp. aureus positivos que no dan una prueba de coagulasa definida (4+) (76, 86). La clasificación de especies de Staphylococcus patógenas depende de las características de la colonia, la pigmentación, la prueba de catalasa y ambas pruebas de coagulasa, en portaobjeto y en tubo (40). Algunos S. epidermidis producen DNasa como lo hace S. pyogenes y en ocasiones otros estreptococos (3-hemolíticos (94). 2. Las inoculaciones en mancha son necesarias debido a que algunas cepas de S. aureus subesp. au reus no desarrollan bien en los medios de cultivo y el crecimiento no es necesario para la detec ción de la actividad de DNasa (43). C. Identificación de especies de Serratia La prueba de D N asa perm ite identificar especies de Serratia, sobre todo las cepas no pigmentadas (22) de los miembros estrecham ente relacionados no pigm entados del grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia (K-E-S) de la fam ilia Enterobacteriaceae (7, 79). La mayoría de las especies de Serra tia aisladas son no pigm entadas (14, 21, 36), lo cual crea dificultad para la diferenciación bioquí mica y m orfológica con otros miembros de la división K-E-S. Elston y Elston (22) recom iendan la DNasa como una prueba diferencial en la bacteriología de los microorganismos entéricos. Sin em bargo, dado que el sistema de enzimas de Hafnia alvei cam bia de m anera característica en muchos casos cuando se em plean temperaturas de incubación de 25°C y 37°C, los placas deben incubarse a ambas tem peraturas durante 24 h (91). M artin y Ewing (64) recomiendan precaución y no confiar sólo en los resultados de la prueba de D N asa al identificar los miembros de la fam ilia Enterobacte riaceae y otras bacterias gramnegativas. Todas las especies de Serratia excepto S. fonticola son D N a sa positivas (51). D. Otros microorganismos positivos o variables para la producción de DNasa son E sp ecies de Achromobacter (22, 42) Aeromonas hydrophilia (51) E sp ecies de Bacillus (22, 42, 51) Bordetella bronchiseptica (7) Clostridium septicum (22) Corynebacterium diphtheriae (67) Escherichia cotí (22) Pasteurella pestis (22) Proteus mirabilis (7) Proteus vulgaris (7) Pseudomonas aeruginosa (22, 42, 87) E sp ecies de Streptococcus (42, 92) E sp ecies de Vibrio (63)

E. Procedimiento de la prueba ácido-DTA estándar 1. La prueba de agar para DNasa, debido a su prolongada incubación (18-24 h), desencadena una reacción positiva a partir de cantidades relativamente pequeñas de nucleasa y, al mismo tiempo, existe una posibilidad de degradación del DNA a causa de otras enzimas distintas de la DNasa o de productos metabólicos como los ácidos orgánicos (100).

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2. La técnica de anegación del HC1 está limitada por la interferencia con proteínas (54). 3. El medio semisintético de Jeffries y col. (42) no favorece el desarrollo de muchos microorganis mos con requerimientos especiales de cultivo; a menudo los resultados con los micrococos son po co satisfactorios. 4. Se recomiendan inóculos densos y estos inóculos no favorecen el desarrollo de colonias bien ais ladas (42). 5. El reactivo HC1 es bactericida para colonias aisladas o para un desarrollo más intenso, más con fluente. Una vez que se aplica HC1, la prueba debe leerse y no puede continuarse la reincubación (42).

6 . No pipetear el HC1 concentrado con la boca. Utilizar una jeringa o pipeta con bulbo (Propi peta). Agregar el ácido concentrado al frasco graduado, mientras el ácido escurre despacio por las caras laterales del frasco con una agitación suave con movimientos envolventes para mezclar bien. Nunca agregar el agua directamente a un ácido; siempre agregar el ácido al agua debido a que el HC1 concentrado es sumamente cáustico y cualquier salpicadura puede causar quemaduras. Si el ácido contacta con la piel, lavar el área inmediatamente con agua corriente fría. 7. Jeffries y col. (42) encontraron que la prueba estándar con HC1 que contiene suero en una concen tración de 2 mL/100 mL o más alta se tom a turbia con el agregado del HC1, lo que obstaculiza la visualización de la zona de hidrólisis del ácido nucleico. 8. Al preparar el medio de DTA, mezclar con suavidad para evitar la formación de hebras de proteí na insolubles; el DNA tiende a precipitar como fibras (48). 9. El procedimiento ácido-DTA estándar es poco satisfactorio para probar las cepas de Pseudomo nas productoras de piocianina; la piocianina extracelular es de color rojo-castaño cuando se acidi fica; las áreas de crecimiento se superponen y pueden obstaculizar las zonas claras que indican la producción de DNasa (87). En este caso, realizar la prueba de D N asaen medio de DTA-TBO (87). F. DTA-TBO y DTA-MG 1. Muchas cepas bovinas, cepas de referencia y cepas tipo de especies de Staphylococcus descritas y reconocidas en un período reciente no desarrollan en el medio de DTA-MG o DTA-TBO. No se recomiendan los colorantes TBO y MG para la detección de estafilococos de origen bovino o pa ra el uso con muchas especies de estafilococos definidas hace poco tiempo (57). 2. La reacción de los cambios de color metacromáticos es estable durante 2-4 h, después de lo cual el colorante difunde con lentitud en el agar y se pierden los bordes bien demarcados. 3. Debe prestarse estricta atención al contenido de colorante de los polvos de colorante de TBO dis ponibles en el comercio; las concentraciones de TBO deben reflejar las concentraciones reales del colorante. Los cálculos deben incluir un factor de conversión que considere el verdadero conteni do de colorante de los polvos comerciales (91). Dos factores, además de la concentración del co lorante, afectan los resultados del procedimiento de anegación del TBO (91): a) el tiempo en que el colorante está en contacto con el agar y b) el tiempo entre la decantación de la solución del co lorante y la lectura del resultado de la actividad de DNasa. U na solución de TBO al 0,05% es su perior a una solución de TBO al 0,01% (80) como agente de anegación para la detección de la ac tividad de DNasa de colonias crecidas en el agar para DNasa (91). 4. Smith y col. (84) recomiendan realizar pruebas bioquímicas apropiadas para confirmar la identidad de todos los estafilococos y estreptococos productores de DNasa seleccionados de la DTA-MG. 5. En raras ocasiones, si en alguna, la DTA-MG no identifica S. pyogenes del grupo A productor de DNAsa (84, 94), pero puede dar un resultado falso positivo ocasional (84); algunas cepas de otros gmpos de estreptococos de Lancefield también pueden producir DNasa (94). 6. Una reacción de la DTA-MG positiva indicada por una zona clara alrededor de las colonias sobre un agar verde se observa mejor sosteniendo la placa contra un fondo blanco con luz indirecta (59, 84). 7. El medio de DTA-MG es difícil de preparar desde el punto de vista técnico y Black y col. (7) m os traron que la producción de DNasa se muestra con menos claridad que con los procedimientos de DTA-HC1 o de DTA-TBO. 8. De todos los métodos para la actividad de DNasa, sólo los que utilizan MG son aplicables a siste mas impuros (54). 9. Lior (59) mostró que el aumento de la concentración de M G en el medio de 0,005 al 0,006% pro porciona un m ejor contraste y zonas reducidas cuestionables, estrechas, nebulosas, que son difíci les de interpretar. 10. Mediante la observación del tamaño de la colonia y de la zona de actividad de la DNasa y con la realización de una coloración de Gram, puede efectuarse una identificación presuntiva muy

Pruebas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 147 precisa; los microorganismos entéricos gramnegativos no se confunden con facilidad con los esta filococos o con los estreptococos del grupo A debido a las diferencias en el tamaño y en la consis tencia de las colonias (84). 11. Los métodos del M G requieren el sustrato DNA con alto grado de pureza (50). 12. Según Lior (59), el M G es tóxico por lo menos para algunas cepas de Campylobacter. G. DTA con naranja de acridina 1. Debe tenerse cuidado ya que ciertos medios de cultivo (p. ej., medio de DTA-AO) pueden inhibir la actividad de nucleasa o su producción (52). 2. No utilizar tapas sobre las placas durante la fase de calentamiento del medio de DTA-AO; pueden ocurrir resultados poco satisfactorios debido a la pérdida de agua o a la condensación excesiva que puede distorsionar la superficie del agar (52). 3. El procedimiento de DTA-AO por plaqueo de superficie debe ser utilizado para estudios cuantita tivos en lugar de placas vertidas; el plaqueo de superficie brinda una reacción más intensa (52). 4. Puede ocurrir una contaminación cruzada durante la cobertura del medio de DTA-AO; los aisla mientos deben ser puros antes de proceder a la cobertura con ADA (52). H. Técnica de difusión en agar metacromático (MAD): con el procedimiento de MAD (54), la concen tración, la temperatura y el tiempo afectan de manera significativa los ensayos estafilocócicos; estos tres factores debe estandarizarse.

I. TNasa 1. La estabilidad térm ica (resistencia al calor) es singular para la nucleasa de S. aureus subesp. au reus (55); es característica de todas las cepas de S. aureus subesp. aureus (76, 86, 98, 99). Zarzaur y Belle (99) recomiendan realizar la prueba de TNasa en todos los aislamientos clínicos que m ues tran coagulación 2+ o 1+ en la prueba de coagulasa para confirmar e identificar todas las cepas de S. aureus subesp. aureus productoras débiles o dudosas de coagulasa. Diversos investigadores (5, 86, 99) demostraron que la nucleasa producida por S. aureus subesp. aureus es termoestable de manera característica y uniforme, mientras que las nucleasas produci das por los estafilococos coagulasa negativos son termolábiles cuando se comprueban por el m é todo de Lachica y col. (53). 2. El medio de Vogel y Johnson y el medio Staphylococcus 110 no pueden utilizarse en la prueba de STN; en el medio 110 se produce TNasa, pero se inhibe la actividad (51). 3. Algunas cepas de S. epidermidis, S. simulans y S. carnosus pueden demostrar actividad débil de TNasa (2). 4. Las especies de Fjiterococcus pueden producir TNasa (72). 5. La diferenciación de campilobacterias termofílicas en especies y en biotipos proporciona valiosos marcadores para las investigaciones epidemiológicas (59). J. Método de difusión en orificios en el agar: el método de difusión en agar es más confiable para la detección de DNasa de cepas de H. pylori que no crecen bien en el medio de prueba de DNasa (29).

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150

Pruebas bioquímicas individuales

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CAPI TULO

Pruebas de p-galactosidasa (ONPG y PNPG) I. PRINCIPIO Demostrar la presencia o la ausencia de la enzima P-galactosidasa mediante el uso del compuesto or gánico o-nitrofenil-P-D-galactopiranósido (ONPG) o p-nitrofenil-P-D-galactósido (PNPG).

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43-45) A. O N PG 1. Diferenciar rápidamente microorganismos fermentadores lentos de la lactosa de los microorganis mos lactosa negativos: ayuda a distinguir algunas cepas de especies de Citrobacter (+) y de Sal monella bongori (+), Salmonella choleraesuis subesp. arizonae (+) y S. choleraesuis subesp. diazonae (+) de la mayoría de las otras especies de Salmonella (V- ) (15). 2. Ayudar en la diferenciación de las especies Burkholderia cepacia (antes Pseudomonas cepacia) (V) y Stenotrophom*onas maltophilia (antes Xanthom*onas maltophilia) y Pseudomonas maltophilia (+) (13, 28) de otras especies de Pseudomonas (-) (1). 3. Ayudar en la diferenciación de la especie Neisseria lactamica (+) de otras especies de Neisseria con requerimientos especiales de cultivo ( -) (2). La prueba ONPG en Neisseria debe restringirse a identificar sólo especies que desarrollan en medios selectivos; p. ej., N. gonorrhoeae, N. m enin gitidis y N. lactamica (1). 4. Diferenciar Klebsiella pneumoniae subesp. rhinoscleromatis (—) de Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae (+) y de Klebsiella pneumoniae subesp. ozaenae (V). 5. Diferenciar Corynebacterium bovis (+) de otras especies de Corynebacterium (-) (14). 6. Diferenciar Nocardia (+), Nocardiopsis (+) y Streptomyces (+) de otros Actinomyces aerobios (-) (2). 7. Diferenciar Flavimonas oryzihabitans (antes Pseudomonas oryzihabitans - taxonomía incierta) (-) (1, 13) de Chryseomonas luteola (antes Pseudomonas luteola) (+) (12, 13). 8. Diferenciar entre cuatro microorganismos entéricos productores de H2S: Budvicia aquatica (+) de Leminorella grimontii (-), Leminojella richardii ( -) y Pragiafontium (-). 9. Diferenciar bacilos gramnegativos, oxidasa positivos, fermentadores, Chromobacterium violaceum ( -) dz Aeromonas hydrophilia (+), Plesiomonas shigelloides (+) y Vibrio cholerae (+). 10.Diferenciar Capnocytophaga gingivalis (+) de C. canimorsus (—), C.*cynodegmi (—), C. ochracea {-) y C. sputigena (-). 11. Diferenciar Deincoccus radiopugnans (+) de la mayoría de los más frecuentemente aislados D. pro teolyticus (—), D. radiodurans (—) y D. radiophilus (—). 12. Diferenciar Shigella sonnei (+) de otras especies de Shigella (-). B. PN PG : diferenciar entre ciertas especies de M ycobacterium (véase Sección IX.C)

III. BIOQUÍMICA Las enzimas bacterianas se clasifican como constitutivas o adaptables. Una enzima adaptable, o indu cida, sólo es producida por una bacteria cuando su sustrato específico está presente; una enzima constitutiva

152

Pruebas bioquímicas individuales

se produce en ausencia o en presencia del sustrato (4, 17). El proceso de síntesis de la enzima mediado por el sustrato se llama inducción de la enzima y el compuesto que desencadena la síntesis de la enzima se llama inductor (10). La p-galactosidasa es una enzima inducida que actúa específicamente sobre galactósidos simples (5). La formación de una enzima inducida está controlada genéticamente; sin embar go, una enzima inducida puede disminuir en las células después de varias generaciones si se elimina el inductor (11). Asimismo, una mutación genética puede hacer que una enzima inducida pase a ser consti tutiva; el mecanismo de formación es el mismo (11). Cohen y M onod (6) informaron que, en mutantes, la (3-galactosa inhibe la formación de P-galactosidasa constitutiva. Un glucósido es un compuesto de acetal ( rch: 297-306. 31. M acL ean PD , L iebow A A , R osenberg A A . A h a e m o ly tic c o ry n eb a cte ria re sem b lin g Corynebacterium ovis an d Corynebaterium pyogenes in m an. J Infect D is 1946;79:69-90. 32. N ash P, K renz M M . C ulture m edia. In: B alow s A, H au sler W J Jr, H errm ann K L , e t al., eds. M anual o f C linical M icrobiology, ed 5. W ashington, D C : A m e rican S o c iety d o r M icrobiology, 1985:1226-1288. 3 ) J O b e r h o f e r T R . M anual o f Practical M ed ical M ic ro b iology and P arasitology. N ew York: Jo h n W iley & Sons, 1985:166-169. 34. O b e rh o ferT R . M anual o f N o n ferm en tin g G ram N eg a tiv e B a c te ria . N ew York: Jo h n W iley & S o n s, 1985:45, 53. 35. Pickett M J, G reenw ood JR. Identification o f oxidase positive,glucose-negative,m otile speciesofnonferm entative bacilli. J C lin M icrobiol 1986;23(5):920-923. 36. P ickett M J, G reenw ood JR , H arvey SM . Tests for de tecting d eg radation o f gelatin: C o m p ariso n o f five m ethods. J C lin M icrobiol 1991;29(10): 2322-2325. 37. P itt TL, D ey D. A m ethod fo r the d etection o f gelatin a se p ro d u c tio n by b a c te ria . J A p p l B a c te rio l 1970;33:687-691. 38. P orres JM , H arris D. R ap id gelatin liq u efactio n test. A m J C lin P athol 1974;62(3):428-430. 39. R ed d y C A , C ornell CP, F rag a A M . T ransfer o f torynebacterium pyogenes (G lage) E b erso n to th e g e nu s Actinomyces pyogenes (G lage) com b. nov. Int J S y st B acteriol 1982;32(4):419-429. 40. S m ith H L Jr, G oodner K. D etectio n o f bacterial gelatinases b y g elatin ag ar plate m ethods. J B acteriol 1958;76(6):662-665. 41. S neath P H A , M air N S, Sharpe M E , H o lt JG , eds. B e rg ey ’s M an u al o f S ystem atic B acteriology, vol 2. B altim ore, W illiam s & W ilkins, 1986:1268. 42. S o ttn e k F O , B ro w n JM , W eaver R E , C a rro ll GF. R eco g n itio n o f Oerskovia species in the clin ical la boratory: C h aracterization o f 35 isolates. Int J S yst B acteriol 1977;27:263-270. 43. S tanier RY, P alleroni N J, D o u d o ro ff M . T h e aero bic p seudom onads: A taxonom ic study. J G en M i crobiol 1966:43(2): 159-271. 44. S y ed SA . A new m edium fo r the d etection o f gela tin -h y d ro ly zin g activity o f hum an d ental plaq u e flo ra. J C lin M icro b io l 1976;3(2):200-202. 45. W ashington JA. L ab oratory P rocedures in C linical M ic ro b io lo g y , ed 2. N e w York: S p rin g erV erlag , 1985:355-356. 46. W h aley D N , D o w ellV R Jr, W anderlinder L M , L om b ard G L . G elatin agar m edium fo r detectin g gelatin ase p ro d u ctio n by anaerobic b acteria. J C lin M i crobiol 1982;16(2):224-229.

CAPI TULO

Prueba de oxidación del gluconato Al. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo para oxidar gluconato (ácido glucónico), su única fuen te de carbono, al compuesto reducidor 2-cetogluconato, que a su vez reduce el sulfato de cobre.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 44 y 45) A. Para ayudar a la diferenciación entre géneros: Pseudomonas aeruginosa (+) de Alcaligenes faecalis (-). B . Principalmente para ayudar en la diferenciación de especies de pseudomonadales fluorescentes de otros bacilos no fermentadores (NFB): P. aeruginosa (+),P.fluorescens (V, variable, normalmente +), P. putida (V, normalmente +), P. aureofaciens (V) y P. chlororaphis (+). A menudo incluido en la balería de pruebas para identificar NFB oxidasa positivos.

Ill . BIOQUÍMICA_______________________________________________________________ El sustrato, gluconato de potasio, es una sal de potasio del ácido glucónico. La oxidación del gluco nato fue usada originalmente por Haynes (5) para diferenciar pseudomonadales, pero en la actualidad se conocen otros microorganismos, principalmente Enterobacteriaceae, que poseen esta capacidad. El glu conato es uno de los productos de oxidación formado a partir de la glucosa por microorganismos aero bios que metabolizan hidratos de carbono por la vía de Entner-Doudoroff. Las bacterias metabolizan hidratos de carbono por fermentación u oxidación. En la fermentación, el catabolismo de la glucosa involucra una fosforilación inicial y luego un fraccionamiento en dos m olécu las de triosa. Sin embargo, cuando la glucosa se metaboliza oxidativamente a ácido glucónico, no hay ninguna fosforilación inicial y sólo los microorganismos capaces de efectuar el metabolismo oxidativo del gluconato de potasio pueden usarlo como su única fuente de carbono (6, 10, 11). Estos microorganis mos oxidativos son aerobios obligados. Sebek y Randles (11) atribuyen la falta de fosforilación en la fa se inicial de la oxidación a la incapacidad del trifosfato de adenosina (ATP) para penetrar en la célula bac teriana. jCHO|------------ Grupo aldehido H—C—OH H O -C -H HO — C — OH i H—C—OH CH2OH Glucosa

oxidación sin fosforilación

ICQOH|------------ Grupo carboxilo H—,C— OH 2I HO— C— H 3I H -C -O H H -C -O H c h 2oh

Ácido glucónico (gluconato)

Prueba de oxidación del gluconato 173 En la oxidación, la glucosa no es dividida en dos triosas; el grupo aldehido se oxida directamente a un grupo carboxilo y forma ácido glucónico. Los azúcares de aldosa, como la glucosa y la galactosa, son al dehidos polihídricos en los que cada molécula contiene un grupo aldehido (CHO o H -C = 0 ). 0 Cuando sólo los grupos aldehido se oxidan a grupos carboxilo -COOH or (jQgj . la serie de compuestos derivada se denomina “ácidos aldónicos”, uno de los cuales es el ácido glucónico (9,13). El ácido glucónico puede degradarse adicionalmente a ácido 2-cetoglucónico (2-cetogluconato), intermedia rio clave en la pmeba del gluconato, que puede acumularse o seguir metabolizándose lentamente (11). Desde el punto de vista estructural, el ácido 2-cetoglucónico difiere del ácido glucónico por un carbonilo en el C2 (3).

Metabolismo oxidativo de la glucosa (2, 6, 10) Glucosa

Acido glucónico (gluconato)

1. . . Ácido 2-cetoglucónico (2-cetogluconato)

Fosforilación Ácido 2-ceto-6-fosfoglucónico (2-ceto-6-fosfogluconato)

1 Ingresa a las vías metabólicas

1 2

moles de ácido pirúvico

El ácido glucónico y el gluconato no son compuestos reductores, pero algunas bacterias pueden oxi dar el gluconato por la vía metabólica oxidativa a intermediarios como 2-cetogluconato, que tiene pro piedades reductoras (5, 10).

IV. A.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

_________________

Caldo gluconato peptona 1. M odificación del medio de Haynes (5, 12) 2. Ingredientes, pH 7,0 ± 0,2 P ep to n a de caseín a 1,5 g E x tracto de levadura l g F o sfato d ipotásico, K 2H P 0 4 l g G lu co n ato de potasio, K C 6H u 0 7 40 g A g u a d e sio n izad a • 1.000 m L E l glu co nato de po tasio puede ser reem p lazad o p o r 37,25 g de gluconato de sodio (4).

3. Método de preparación a. Calentar suavemente hasta la disolución. b. Filtrar (Millipore). c. Distribuir aproximadamente 2 mL por tubo con tapa a rosca (o tapa a presión) (13 x 100 mm). 4. Método de esterilización: autoclave; 115°C, 15 Ib, 15 min. 5. Aspecto del medio terminado no inoculado: líquido claro, amarillento, en tubos. 6. Enfriar antes de usar y guardar refrigerado (4-10°C); vencimiento aproximadamente a las 6-8 se manas a 2-8°C. 7. Inoculación a. Inoculo abundante (1). b. Desarrollo proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h: agar con hierro de Kligler (KIA)/agar con azúcar triple y hierro (TSI). 8. Incubación: 35°C; 48 h (4, 5). 9. Agregar reactivo de Benedict o un comprimido de Clinitest directamente al tubo incubado, antes de la lectura. La sal de potasio del gluconato se usa de rutina porque da una solución clara y es fácilmente obteni ble (5). Se usa una solución al 4% (ps/ps) porque al final de las 48 h de incubación esta cantidad perm i te a P. aeruginosa acumular por lo menos 50% del 2-cetogluconato de potasio (5).

174 B.

Pruebas bioquímicas individuales Comprimidos Key para sustrato de la prueba de gluconato

1. Fabricante: Key Scientific Products. 2. Procedimiento: seguir las instrucciones del fabricante.

V. A.

REACTIVOS EMPLEADOS: DOS OPCIONES Solución cualitativa de Benedict 1.

Ingredientes (4) S ulfato de cobre, C u S 0 4 • 5 H 20 C arb o n ato de sodio, anhidro, Na^CCF, C itrato de sodio, C 3H 4O H (C O O )3N a 3 A g u a d e sio n izad a

1,73 g 10 g 17,3 g 100 m L

2. Método de preparación (4) a. Solución 1: disolver el citrato y el carbonato de sodio en 60 mL de agua desionizada. b. Solución 2: disolver el sulfato de cobre en 20 mL de agua destilada. c. Agregar la solución 2 a la solución 1 con agitación constante. d. Ajustar el volumen a 100 mL con agua desionizada. 3. Conservación: conservar en un lugar cálido; este reactivo es muy susceptible de cristalización cuan do se enfría (4). 4. Química de acción del reactivo: el hidrato de carbono intermediario 2-cetogluconato, si está pre sente, reduce el hidróxido cúprico soluble (sulfato de cobre), cuando se calienta, a óxido cuproso insoluble, que precipita (9). Cu

^O H ''O H

+ 2-Cetogluconato

Hidróxido cúprico 2 Cu(O H), (color azul)

ca lo r reducción

Agente reductor

Cu2l + 2HzO + O

Óxido cuproso (precipitado de color amarillo a naranja-roji*zo) (olor característico a repollo podrido) (5)

B. Comprimidos de Clinitest 1. Fabricante: Ames. 2. Agregar medio comprimido de Clinitest directamente al tubo de gluconato incubado. 3. Conservación: los comprimidos de Clinitest son estables indefinidamente cuando se guardan sin abrir a temperatura ambiente; sin embargo, son higroscópicos y muy sensibles a la humedad. Tam bién se destruyen a temperaturas superiores a 49° C (120°F). Deben descartarse los comprimidos que muestren cualquier cambio de color al azul oscuro. Puesto que su estabilidad varía, cada se mana debe hacerse un control de calidad y descartarse si muestran una reacción negativa o débil con un microorganismo positivo conocido. 4. Química de acción del reactivo (7): el comprimido de Clinitest contiene sulfato de cobre, carbona to de sodio, una pequeña cantidad de ácido cítrico e hidróxido de sodio (NaOH). El carbonato de sodio y el ácido cítrico producen efervescencia para acelerar la disolución del comprimido, mien tras que el hidróxido de sodio mantiene la alcalinidad necesaria para la reducción. El sistema de auto-calentamiento es generado por el hidróxido de sodio y por la reacción entre el hidróxido de sodio y el ácido cítrico. 2 Cu++ + 2-Cetoqluconato---- — *-Cu201 + compuesto oxidado NaOH reducción

Iones cúpricos (color azul)

Agente reductor

Óxido cuproso (precipitado amarillo a naranja-roji*zo)

Prueba de oxidación del gluconato

175

VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD Cada reactivo debe probarse con cultivos positivos y negativos conocidos antes de ponerse en uso. A. Positivos (+) Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Citrobacter freundii

ATCC 13883 ATCC 10145 ATCC 8090

B. Negativos (-) Escherichia cotí No inoculado

ATCC 11775

Vil. INTERPRETACIÓN CON CADA REACTIVO A. Agregar la solución de Benedict o un comprimido de Clinitest directamente a los tubos incubados antes de realizar la interpretación.

1. Solución de Benedict a. Agregar 1 mL directamente a cada tubo de gluconato. b. M ezclar bien y poner en un baño de agua hirviendo (100°C), 10 min. 2. Comprimido de Clinitest: agregar medio comprimido a cada tubo; esperar 5 seg después de sus pender la ebullición, luego agitar el tubo suavemente antes de leer el color (7). B. Positivo (+) 1. Precipitado de color amarillo-anaranjado a naranja-roji*zo. El color producido depende de la can tidad de sustancia reductora acumulada; a mayor cantidad, el color es más anaranjado a naranjaroji*zo. Sin embargo, cualquier actividad reductora, con colores que van del verde suave (1 +) al naranja oscuro (4+), indica oxidación (8). 2. La presencia de una sustancia reductora, 2-cetogluconato. El 2-cetogluconato reduce el sulfato de cobre (color azul), cuando se calienta, a óxido cuproso insoluble (Cu20), que precipita. C. Negativo (-) 1. Ningún cambio de color; el medio permanece de color azul o verde azulado después del agrega do de la solución de Benedict o de un comprimido de Clinitest. 2. N o hay ninguna sustancia reductora presente.

VIII.

PRECAUCIONES

A. Comprimidos de Clinitest 1. No usar la prueba Clinistix con tiras impregnadas porque es específico para glucosa, un azúcar re ductor (1,7). 2. Los comprimidos de Clinitest son estables por tiempo indefinido cuando se guardan sin abrir a temperatura ambiente (22-25°C); sin embargo, son higroscópicos y muy sensibles a la humedad. También se destruyen a temperaturas superiores a 49° C (120°F). Deben descartarse los comprimi dos que muestren cualquier cambio de color al azul oscuro. B. Comprimidos Key para sustrato de la prueba de gluconato (Key Scientific Products): Pease y col. (10) encontraron que el comprimido es más exacto que el caldo gluconato. En sus pruebas, 93% de los pseudomonadales productores de fluoresceína fueron positivos para gluconato. Estos autores encon traron demasiados resultados falsos positivos y falsos negativos con el medio líquido (10). C. Prueba específica para pseudomonadales fluorescentes; otros microorganismos, como Achromobacter y Pseudomonas cepacia, dan a veces un resultado falso positivo (8). D. Oberhofer (8) recomienda registrar las reacciones en grados de positividad, en lugar de sólo positivas y negativas; las reacciones débiles son útiles para caracterizar microorganismos.

176

Pruebas

b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

REFERENCIAS 1. Branson D. Methods in Clinical Bacteriology. Springfield IL: Charles C Thomas, 1972:23. 2. Burrows W, Lewert RM, Rippon JW. Textbook of Microbiology. The Pathogenic Microorga nisms, ed 19. Philadelphia, WB Saunders, 1968: 118-121. 3. Cohen SS. Gluco*kinase and the oxidative path of glucose-6-phosphate utilization. J Biol Chem 1951; 189(2):617-628. 4. Cowan ST. Cowan & Steel’s Manual for the Iden tification of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: Cambridge University Press, 1974:116,146. 5. Haynes WC. Pseudomonas aeruginosa-its cha racterization and identification. J Gen Microbiol 1951;5(5): 939-950 6. Hugh R, Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. J Bacteriol 1953;66(l):24-26. 7. Kark RM, Lawrence JR, Poliak VE, et al. A Pri

8. 9. 10.

11. 12. 13.

mer of Urinalysis, ed 2. New York: Hoeber Me dical Division, Harper & Row, 1963:36-38. Oberhofer TR. Manual of Practical Medical Mi crobiology and Parasitology. New York: John Wi ley & Sons, 1985:172-173. Oser BL, ed. Hawk s Physiological Chemistry, ed 14. New York: McGraw-Hill, 1965:80-81, 89. Pease M, Malcolm J, Chemaik R, Dunlop S. An approach to the problem of differentiating pseu domonads in the clinical laboratory. Am J Med Technol 1968;34(l):51-57. Sebek OK, Randles CL The oxidative dissimila tion of mannitol and sorbitol by Esem lomonasrluorescens. J Bacteriol 1952;63(6):693-700 Shaw C, Clarke PH. Biochemical classification of Proteus and Providence cultures. J Gen Micro biol 1955; 13(1): 155-161. Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA. The Mi crobial World, ed 2. Englewood Cliffs, NJ: Pren tice-Hall, 1963:269.

Prueba de hidrólisis del hipurato I. PRINCIPIO A. D eterm inar la capacidad enzim ática de un m icroorganism o para hidrolizar el hipurato de sodio (áci do hipúrico) a ácido benzoico y glicina por la acción de la enzim a hipurato hidrolasa (hipuricasa). B. La actividad enzim ática se determ ina p or detección de cualquier producto final, ácido benzoico o glicina. II. O BJETIV O (Véanse también caps. 43 y 45) A. Junto con una combinación de otras pruebas ayuda en la diferenciación de Streptococcus (3-hemolítico del grupo B bovino (S. agalactiae) (+) de especies humanas de Streptococcus P-hemolítico (nor malmente - ) (2, 6, 7) y en la identificación presu n tiv a de Streptococcus del grupo B. B. Diferencia Streptococcus p-hemolítico del grupo B de P-hemolítico de los grupos A y D no enterococos y de especies de Enterococcus P-hemolítico. C. La prueba de hidrólisis del hipurato es fundam ental para la diferenciación de Cam pylobacter je ju ni subesp .je ju n i (+) y subesp. doylei (+) (36) de C. coli (-), C. lari ( -) y otras especies de Cam py lobacter (-)(3 0 , 38, 42, 47, 55, 56, 60). C. je ju n i es la única especie de Cam pylobacter que hidroliza el hipurato (38). L a diferenciación de C. coli de C. je ju n i se basa casi com pletam ente en la hidrólisis del hipurato (50). U na cepa ocasional de C. je ju n i es hipurato negativa (28, 30, 55). D. Ayuda diagnóstica adicional, junto con otras pruebas bioquímicas (licuefacción de la gelatina y P-lactamasa), para la identificación de Legionella pneum ophila (+) y L. feeleii (V, variable) de otras espe cies de Legionella y similares a Legionella ( -) (29, 38). E. Ayuda diagnóstica adicional, junto con otras pruebas bioquímicas (hidrólisis del almidón, a - y P-glucósidos) para la identificación de Gardnerella vagin*lis (+) (4, 24, 41). F. Ayuda a la diferenciación de 1. Actinobacillus lignieresii (+) de Actinobacillus equuli (-). 2. Brevibacterium iodinum (-) de los aislados con mayor frecuencia B. casei (+), B. epidermidis (+) y B. li nens. 3. Listeria grayi (-) de L. innocua (+), L. ivanovii (+) y L. monocytogenes (+). 4. M obiluncus m ulieris ( -) de M. curtisii subesp. curtisii (+) y M. curtisii subesp holm esii (+). 5. Especies de Bacillus aerobias formadoras de esporas (52). La prueba no debe aplicarse indiscriminadamente a todos los grupos de estreptococos; sólo es útil pa ra los estreptococos (3-hemolíticos de origen humano o bovino y sólo debe usarse con ellos (2). III. BIOQUÍMICA El ácido hipúrico (W-benzoilglicina, ácido benzoilaminoacético, C6H5CONHCH2COONa) es un derivado de ácido benzoílico de la glicina; un anillo aromático benzoflo compuesto (C6H5CO~) conjugado con el aminoácido

178

Pruebas bioquímicas individuales

glicina (NH2CH2COOH). El ácido hipúrico es un ácido carboxílico aril-sustituido con un grupo carboxilo (-C O O H ) unido d irectam ente al anillo arom ático (benceno); la porción hid ro x ilo (-O H ) del o grupo carboxilo es elim inada (Re—) y reem plazada en este caso por una am ida (-N H 2). O

cc h 2c o o h nh2

Glicina

El ácido hipúrico es ácido porque puede ceder un ion hidrógeno a una solución más básica. También, como amida, es fácilmente hidrolizado (48) con partición química por el agregado de agua y la acción catalizadora de la enzima especílica hipurato hidrolasa. 0 COOH

+ H ,0

hipurato hidrolasa

c h 2n h 2

hidrólisis

Ácido hipúrico (benzoilglicina)

(B ,3D

COOH

Acido benzoico

Glicina (glicocola)

En el medio de prueba se usa una sal de hipurato (C6H 5CONHCH2COO_Na+), que forma benzoato de sodio (C6H 5COO Na+) y glicinato de sodio (NH2CH2COO_N a+) por hidrólisis. Los productos finales de la hidrólisis del ácido hipúrico, ácido benzoico y glicina, son insolubles en agua; sus sales son solu bles (48). La formación de sales depende de la fuerza ácida (o grado de ionización); si el ácido es RCOOH, su ionización (un proceso de equilibrio) es (48)

RCOOH v Ácido carboxílico no disociado

RCOO~ + H+ Ion carboxilato

Los ácidos carboxílicos reaccionan estequiométricamente (equivalente por equivalente) con bases pa ra formar sales que se disocian 100% en solución (26). Las sales de sodio normalmente son hidrosolubles y producen soluciones acuosas alcalinas; debido a que son sales de bases fuertes y ácidos débiles se hidrolizan (27). El cambio de pH del sustrato de hipurato de sodio a la alcalinidad probablemente se debe al producto aminoácido, la glicina (12). El ácido benzoico (ácido bencenocarboxílico, ácido fenilfórmico, ácido dracílico) es un ácido débil volátil (6). Es un ácido monocarboxílico de la serie aromática relacionado con el benceno (C6H~5), un de rivado bencénico (1). La glicina (glicocola) es un ácido monoaminomonocarboxílico (15); su grupo fun cional es el grupo amina (-N H 2) (48). La hipuricasa produce hidrólisis en la unión peptídica del ácido hipúrico; la evidencia sugiere que la com binación de la enzim a con el sustrato tiene lugar a través de la glicina (o de la porción aminoácida) (17). L a unión am ida entre un a-am inoácido y un grupo carboxilo se denom ina u n ió n p e p tíd ic a (48).

Prueba de hidrólisis del hipurato 179 _____ Unión peptídica

/ 9 \

/ I

R Ó -N H ^ -C H —C— OH

\s C H Unión peptídica

Glicina-carbono alfa (a), carbono vecino al grupo funcional (-NH o aminoácido)

La hidrólisis del hipurato puede ser determinada detectando cualquier producto ñnal (16). El ácido benzoico en el medio puede ser demostrado por el agregado de una solución de cloruro férrico acidifica da (FeCl3) o de un ácido inorgánico; el procedimiento con FeCl3 es el más sensible de los dos métodos (2). El producto final glicina se detecta por el método de la ninhidrina (16). La enzima denominada antiguamente histozima (39), nombre reemplazado por el término más am pliamente usado hipuricasa (39), se ha designado hipurato hidrolasa (ácido .V-benzoilamino amidohidrolasa, aminocilasa) (52, 54); esta enzima degrada los derivados benzoílo de los L-aminoácidos natura les (39). Las hidrolasas son una clase de enzimas que catalizan las reacciones de hidrólisis sin coenzimas. Las enzimas que degradan el ácido hipérico están ampliamente distribuidas en la naturaleza, pero la im portancia biológica de la hipurato hidrolasa es incierta. La especificidad de estas enzimas para sustratos diferentes del ácido hipúrico puede diferir de especie a especie (19). No se ha purificado, y sus caracte rísticas bioquímicas están poco definidas (19). La hipurato hidrolasa (hipuricasa), una enzima constitutiva (33), es termolábil y antigénica y requiere un pH de 7,1-9 para su actividad óptima (19). Ferrieri y col. (19) demostraron que el tratamiento con la enzima proteolítica tripsina produce pérdida completa de la actividad de la hipurato hidrolasa. Estos au tores también demostraron que la hipurato hidrolasa es en su mayor parte intracelular y no asociada a la pared de la célula, pero puede haber una tendencia ügera para la asociación a la membrana. Sus estudios confirmaron la asociación de la actividad hipurato hidrolasa con estreptococos del grupo B, descartando la liberación extracelular de la enzima en el medio. Los estudios confirman que los filtrados no son capa ces de hidrolizar el hipurato; sin embargo, las células lavadas, muertas o vivas, reaccionan con el sustra to de una manera similar a los cultivos líquidos con células enteras (19). Según los estudios realizados por Hwang y Ederer (34), los estreptococos del grupo B parecen poseer sistemas enzimáticos propios. Cuando el ácido hipúrico es degradado a ácido benzoico y glicina, el contenido de nitrógeno de ami nas del medio debe aumentar, a menos que la glicina sea usada por las bacterias (2). Un aumento grande en el nitrógeno de aminas constituye otra prueba de la hidrólisis (2).

IV. REACTIVO EMPLEADO: CLORURO FÉRRICO ACIDIFICADO A. Fórmulas; dos opciones 1. Fórmula 1 Cloruro férrico, acuoso, FeCl3 ■6H20 (12%) Ácido clorhídrico concentrado, HC1 (37%) Agua desionizada para completar a

12 g 5,4 mL 94,6 mL

2. Fórmula 2 (3) a. HC1 acuoso, 2%: 5,4 mL/94,6 m L de agua desionizada b. Cloruro férrico, 12 g/100 mL de HC1 acuoso al 2% B. Método de preparación 1. Agregar aproxim adam ente 75 mL de agua destilada o desionizada a un frasco volum étrico de 100 mL. 2. Con una pipeta, agregar 2,5 mL de HC1 al frasco, haciendo que el ácido corra por las paredes del frasco. 3. Agregar 12 g de cloruro férrico. 4. Disolver calentando el frasco suavemente, agitando el contenido para mezclar bien. 5. Llevar el volumen a 100 m L con agua destilada o desionizada. 6. La solución tiene color anaranjado. C. Control de calidad del reactivo 1. Debe ser realizado antes de agregar el reactivo a cualquier microorganismo de la prueba.

180

Pruebas bioquímicas individuales

2. Control negativo (NC), tubo 1. a. Contiene 0,8 mL de caldo de cultivo incubado. b. Agregar 0,2 mL de reactivo de FeCl3 al 12%. c. A gitar de inmediato el tubo suavemente. d. Dejar en reposo 10-15 min antes de interpretar los resultados, con agitación ocasional (18). (1) Si es negativo (a) Desaparición del precipitado inicial dentro de los 15 min (18) o el precipitado se redi suelve al agitar. (b) El ion férrico está en exceso. (c) Proceder a determinar los resultados en microorganismo(s) de prueba (véase V, Medio de cultivo empleado, punto N). (2) Si es positivo (a) El precipitado inicial no se redisuelve o no desaparece dentro de los 10-15 min al agitar (18). (b) El ion férrico no está en exceso. (c) Titular el FeCl3 para determinar la cantidad óptima de reactivo necesario para estar en exceso (paso 3). 3. Titulación del reactivo de FeCl3(13) a. Agregar rápidamente a alícuotas de 1 mL en los tubos de control negativo (NC) 3 ,4 ,5 y 6, 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5 mL de FeCl3, respectivamente. b. Agitar de inmediato los tubos suavemente. c. Dejar en reposo 10-15 min antes de interpretar los resultados, con agitación ocasional (18). d. La cantidad más pequeña de reactivo de FeCl3 acidificado que da una solución transparente indica que el ion fénico (Fe3+) está en exceso; esta cantidad se usa para los microorganismos de prueba. e. Proceder a determinar los resultados en microorganismos de prueba (parte E). 4. Control positivo (PC) a. Precipitado abundante que permanece después de 10-15 min con agitación ocasional (18). b. Hipurato hidrolizado. D. Método de uso - microorganismos de prueba 1. Agregar la cantidad apropiada de reactivo ácido de FeCl3 al 12% según se determinó por control de calidad del reactivo (parte C) a todos los tubos incubados. 2. Agitar los tubos suavemente. 3. Dejar en reposo 10-15 min antes de interpretar los resultados, con agitación ocasional (18). La lerminología reciente para los compuestos que contienen hierro es hierro (III) para el ion férrico (Fe3+) y hierro (II) para el ion ferroso (Fe2+) (40). La prueba del cloruro férrico depende de las solubili dades relativas de una sal de Fe3+ (hierro (III)) de benzoato y de hipurato; los complejos de benzoato fé rrico y de hipurato férrico difieren en estabilidad (52,59). La concentración final de hierro es crítica y de be medirse tanto en el líquido del cultivo en caldo como en el reactivo (13, 59); si se agrega una cantidad definida de reactivo de FeCl3 a una cantidad fija de medio, la reacción es equilibrada. La proteína (glici na), el hipurato residual y el benzoato son precipitados por el reactivo; sin embargo, los precipitados de proteína e hipurato son más solubles y se redisolverán por agitación o en presencia de un exceso de clo ruro férrico, mientras el benzoato permanece como precipitado insoluble (2, 13, 14, 25, 33). El cloruro fénico es muy sensible y reacciona incluso con vestigios de ácido benzoico (52). El cloruro férrico aci dificado, como el ácido clorhídrico, redisuelve el fosfato férrico formado en el medio (2) además de par ticipar en la reacción de color. E. Almacenamiento: guardar el reactivo en un refrigerador (4°C) cuando no está en uso. El cloruro férri co debe guardarse en botellas oscuras para evitar la exposición a la luz. Su estabilidad varía; por con siguiente, debe hacerse un control de calidad semanal y desecharlo si muestra una reacción negativa o débil con un microorganismo positivo conocido. F. Q uím ica de acción del reactivo: el cloruro férrico en solución da color con varios derivados orgá nicos: fenoles, enoles, ácidos hidroxám icos y algunos ácidos carboxílicos (57). Wesp y B rode (61) dem ostraron que los requisitos para una reacción de color con soluciones de FeCl3-fenol son: a) iones F e3+ (hierro (III)), b) un grupo ligeram ente ácido -O H o - S H com o los presentes en los fe noles y c) un solvente capaz de coordinación. El reactivo consiste en un ion férrico hidratado, FeCl3 • 6H20 , en el cual el agua se m antiene en com binación con el ion térrico (hierro (III)); es to se denom ina a m enudo agua de cristalización o agua de h idratación (indicado p o r el p unto q u í

Prueba de hidrólisis del hipurato 181 m ico (•) en la fórm ula) (40). T am bién puede escrib irse com o F e(H 20 ) J +3Cl. L a solución de cloruro férrico existe com o una m olécula solvatada (hidratada) o una m olécula disociada para dar iones solvatados. El agregado de fenol (C6H5OH) desplaza el solvente y produce un complejo aniónico (negativo) hie rro-fenol; cuando se encuentra en agua, el agua sirve como un aceptor de protones, de tal forma que es un ion fenóxido (fenolato) (C6H 50 - ) que puede desplazar una molécula de solvente (H20 ) del ion férri co solvatado (57). El reactivo solvente participa en la formación de color (57). El ion férrico hidratado, Fe(H ,0)63+ , es de color violeta pálido, pero pierde protones muy rápidamente (53). Las sales férricas en Reacción global 1. Benzoato de sodio----- RCOONa+

RCOOH■

Acido benzoico

RCONHCHpCOOH ■

Ácido hipúrico

H2NCH2COOH

Glicina

+ Hipurato de sodio residual

------------------ RCOI\IHCH2COO-Na+

Sal (neutra)

3Na+C r ---------

Gllcinato desodio ------------------- H2NCH2COCrNa+

(todos compuestos ácidos insolubles en agua)

Protón ---------------------- { H+) CT (sales de sodio básicas solubles en agua)

[Fe(H20 )5(RC00H)]+++

2. RCOOH + r c o n h c h 2c o o h

+ [Fe(H20 )5(RC0NHCH2C00H)]+

Moléculas del desplazamiento de

H2NCH2COOH

+ [Fe(H20 )5(H2NCH2C00H)]+++

agua deí ion férrico solvatado (hidratado)

+ 3H20

3 (Fe(H20 )6+++) Complejos intermedios Agente de color

3. [Fe(H20 )5(RC00H)]+++

[Fe(H20 )5(R C 0 0 )j"-------------------- Benzoato férrico

+ [Fe(H20 )5(RC0NHCH2C00H)]+++

PPT

Precipitado permanente castaño

[Fe(H20 )5(H2NCH2C00H)]+++

+ ( 3H20 )

[Fe(H20 )5(RC0NHCH2C00)]= ------

Hipurato férrico;

+ [Fe(H20 )5(H2NCH2C00)]= ---------- Glicinato férrico + 3H20+

Complejos intermedios

X Se redisuelven en exceso de FeCI3

Iones de hidronio (ácidos) Complejos férrico (hierro)-fenol de tipo aniónico (iones con carga negativa en radicales sales-ácidos)

) = sustancia importante en la reacción R = anillo aromático benceno, (C6H5-)

182

Pruebas bioquímicas individuales

solución son amarillas o de color castaño debido a la formación de complejos de hidróxido, y las soluciones que contienen el ion cloruro son más intensamente amarillas o bronceadas debido a la formación de com plejos de cloruro férrico (53); se necesita un grupo hidroxilo libre (OH) en un anillo aromático para pro ducir la reacción de color. Los ácidos fenólicos carboxílicos compiten por el ion férrico o por la molécula de cloruro férrico solvatados (57). Las sales básicas tienen un OH reemplazable; contienen iones -O H que pueden combinar se con un protón (40). El benzoato de sodio es una base insoluble en agua, pero el ion carboxilato (RCOO- ) es un buen aceptor de protones, sobre todo con ácido clorhídrico (HC1), un dador de protones (positivos) (32). El uso de cloruro férrico acuoso acidificado con un ácido fuerte (HCl) proporciona el protón nece sario; los ácidos fuertes liberan protones fácilmente (40). La coordinación es una condición en la que un par de electrones o más es compartido por lo menos por dos átomos. Los átomos con electrones no compartidos como el oxígeno (O) pueden actuar como ligandos para los iones metálicos (46). Un ligando es una molécula que proporciona los electrones nece sarios para formar uniones covalentes coordinadas con iones metálicos. Los iones férrico (Fe3+, hierro (III)) o ferroso (Fe2+, hierro (II)) tienen una afinidad alta por el oxígeno y están firmemente unidos; los iones metálicos se unen más firmemente a medida que aumenta el pH (46).

Reacción global (Ver diagrama en página 181) El complejo de color es un ion negativo (aniónico) (57, 61); su color se debe a la formación de iones complejos coordinados del tipo Fe(OR)6=, donde OR es fenol ionizado (46). El color puede ser destruido por el agregado de ácidos o bases (61). Los tres compuestos, glicinato, hipurato residual y benzoato, son precipitados por el reactivo; sin em bargo, el glicinato férrico y el hipurato férrico precipitados son más fácilmente solubles y se redisuelven por agitación o en presencia de un exceso de cloruro férrico (2, 13, 19, 25, 34, 43), dejando al benzoato férrico como único precipitado (33). El benzoato férrico se separa del agua como una capa líquida o, en este caso, como un precipitado insoluble (48) que es permanente (2 ,1 3 ,1 4 ,2 5 ,3 4 ). El ion hidronio (H30 +) se encuentra en todas las soluciones de ácidos en agua.

V. MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: CALDO HIPURATO (SODIO)____________________ A. Caldo de Ayers y Rupp (2); procedimiento modificado por Facklam y col. (18). B. Detección de ácido benzoico. C. Ingredientes 1. Medio basal: dos opciones a. Rutina: caldo infusión (de corazón) (HIB), pH 7,4 ± 0,2. b. Para desarrollo de grandes cantidades de microorganismos de prueba: caldo de Todd-Hewitt (THB); pH 7,8 + 0,2 (19). 2. Fórmula 1 HIB o THB Hipurato de sodio (7V-benzoilglicina, ácido benzoilaminoacético; C6H5CONHCH2COONa), \m

1.000 mL 10 g

3. Fórmula 2 Carne de corazón, infusión de Caseína/peptona de levadura (50/50) Cloruro de sodio, NaCl Hipurato de sodio Agua desionizada

500 g 10 g 5g 10 g 1.000 mL

D. Método de preparación 1. Pesar con precisión la cantidad como se indica en la etiqueta. Los productos de diferentes compañías pueden variar ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada. 3. Disolver 10 g de hipurato de sodio en caldo. 4. Calentar suavemente hasta la disolución.

Prueba de hidrólisis del hipurato 183 5. Distribuir aproxim adam ente 5 mL por tubo con tapa a rosca (15 x 125 mm) (18); aflojar las ta pas. E. Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. F. Enfriar y ajustar las tapas con firmeza. G. Antes del uso o del almacenamiento, marcar a qué nivel se halla el medio en cada tubo con un lápiz de cera para verificar después la posible evaporación. H. Refrigerar para la conservación (4-10°C). I. Inoculación 1. M arcar los tubo(s) con los números 1, 2, 3, etc.: microorganismo(s) de prueba a. Desarrollo de 18 a 24 h de un cultivo puro confirmado de Streptococcus |3-hemolítico. b. Inoculo abundante; 1-2 gotas (18). c. Para ahorrar tiempo, Facklam y col. (18) sugieren sembrar con 1-2 colonias aisladas de la pla ca de aislamiento original. 2. Tubo marcado PC: control positivo. 3. Tubo marcado NC: control negativo. J. Incubación - todos los tubos: 35°C; 48 h (2); 42-66 h (18, 34). K. Antes de agregar el reactivo, si es necesario, reponer el nivel del medio hasta la marca de lápiz con agua destilada estéril. La concentración de hipurato de sodio debe ser exactamente 1%. L. Si el cultivo está muy turbio (grumoso), centrifugal' para sedimentar el desarrollo y usar el líquido so brenadante límpido para la prueba (18). M. Asépticamente, transferir una alícuota específica de cultivo (o su sobrenadante) a tubos de ensayo pe queños (Wassermann o Kahn). 1. Microorganismo(s) de prueba: 0,8 mL. 2. Se usan cinco controles negativos (NC) por lote de microorganismos que se prueba por vez. a. NC 1:0,8 mL. b. NC 2-5: 1 mL. N. Agregar el reactivo de cloruro férrico. 1. Pruebe la cantidad apropiada de reactivo a agregar (véase Sección IV punto C) antes de agregar

reactivo a los otros tubos. 2. La cantidad apropiada de reactivo debe agregarse a todos los tubos incubados antes de intentar una interpretación. La hidrólisis del ácido hiptírico es más rápida en caldo con dextrosa (p. ej., Todd-Hewitt) durante las pri meras 24 h de incubación, pero después de esto los resultados son prácticamente idénticos (2). La piesen cia de dextrosa o caldo de carne no interfiere con la hidrólisis y una incubación de 48 h es suficiente (2). La influencia de la concentración de iones hidrógeno (pH) sobre la acción de la enzima (p. ej., desarrollo de acidez en el medio debido a la producción de ácido benzoico) no interfiere con la hidrólisis del hipurato y no es necesario considerarla en relación con las pruebas para esta reacción (2). Ayers y Rupp (2) también demostraron que si un medio es conveniente para el buen desarrollo de un estreptococo capaz de degradar el hipurato, su composición o reacción no tiene efectos sobre la hidrólisis. El medio infusión de carne (peptona) requiere más tiempo para ponerse claro cuando el hipurato no ha sido hidrolizado (2). La desventaja del caldo infusión (de corazón) es el período de incubación prolongado de 42-66 h (6).

VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Positivos (+) Streptococcus agalactiae Campylobacter jejuni

ATCC 27956 ATCC 33560

B. Negativos (-) Streptococcus salivarius Campylobacter coli No inoculado

ATCC 13419 ATCC 33559

Vil. RESULTADOS Véanse figuras 14-1 y 14-2 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color.

184 VIII.

P ruebas bioq uím icas individuales

INTERPRETACIÓN

A. Positivo (+) 1. Precipitado (ppt) de color castaño, floculoso, insoluble, que persiste al agitar después de 10 min (2, 18, 19, 21, 25). a. Intenso; bien marcado cuando se ha degradado un quinto o más del hipurato (2). b. Nebuloso (turbio) cuando se ha degradado menos de un quinto del hipurato (2). 2. Precipitado permanente del complejo de benzoato férrico (38). 3. Hipurato hidrolizado (19); informar “Streptococcus del grupo B presuntivo por hidrólisis del hi purato” (38). B. Negativo (-) 1. El precipitado, si existe, se disuelve al agitar. a. El precipitado inicial desaparece dentro de los 10 min (18). Si la solución se aclara dentro de los 10 min, la reacción es inespecífica debido a la interacción con hipurato sin hidrolizar o con la proteína del medio (38). b. Puede haber una ligera turbidez (nebulosidad) u opalescencia; color ámbar claro (naranja) (2, 19). 2. Hipurato no hidrolizado.

IX. A.

PRUEBAS RÁPIDAS: DETECCIÓN DEL PRODUCTO FINAL GLICINA Procedimiento de Hwang y Ederer (34) 1. Sustrato a. Solución de hipurato de sodio acuoso al 1% H ip u rato d e sodio A g u a d estilad a o d esionizada

1g 100 mL

b. Distribuir aproximadamente 0,4 m L por tubo estéril; se pueden usar tubos con tapa a rosca (15 x 125 mm). Es conveniente preparar los tubos con anticipación, que pueden guardarse a -20°C (3). c. Ajustar herméticamente las tapas o los tapones. d. Conservación: refrigeración; en congelador a -20°C. Descongelar antes del uso. La solución de hipurato se deteriora en 7 días a 4°C y debe permanecer congelada cuando no está en uso (49). 2. Solución de ninhidrina a. Ninhidrina, 3,5 g en 100 mL de una mezcla 1:1 de acetona y butanol (alcohol butílico) (4). b. M ezclar la acetona y el butanol y luego agregar la ninhidrina (4). c. Guardar en una botella oscura h erm éticam en te c e rra d a a temperatura ambiente (22-25°C); duración máxima: 6 meses. 3. Inoculación a. Inoculo abundante; una ansada grande de cultivo puro de especies de Streptococcus (3-hemolítico. b. Desarrollo en tripticasa soja agar (TSA) con 5% de sangre de oveja u otro medio conveniente, como agar con sangre de oveja al 5% ^SBA). c. Emulsionar el inoculo en el medio de prueba; la suspensión debe estar turbia. 4. Incubación a. Platina caliente o baño de agua; 37°C; 2 h. b. Con una pipeta, agregar 0,2 mL (5 gotas) de reactivo de ninhidrina; agregar la ninhidrina len tamente por las paredes del tubo para formar una interfase.

c. No agitar los tubos. d. Continuar la incubación en platina caliente o baño de agua durante 10 min. e. Sacar del calor; no incubar más de 30 min, ya que pueden producirse resultados falsos positivos. f. Registrar inmediatamente los resultados. 5. Interpretación a. Positivo (+) (1) Color púrpura-azul oscuro (violeta cristal) dentro de los 10 min posteriores al agregado del reactivo de ninhidrina. (2) Hipurato hidrolizado. b. Negativo (-) (1) Ningún cambio de color; el medio permanece incoloro o a veces tiene un débil tono púrpura. (2) Hipurato no hidrolizado.

Prueba de hidrólisis del hipurato 185 Los resultados de la prueba se correlacionan bien con los de la prueba de Facklam y col. (18). La ninhidrina puede usarse porque el sustrato contiene sólo hipurato de sodio acuoso, que no reacciona con la ninhidrina, y porque sólo uno de los productos, la glicina, es un aminoácido (34). 6. Química de reacción del reactivo: la ninhidrina, C6H4(CO)3 • H20 (51), es un agente oxidante fuer te (4, 33) que provoca la desaminación oxidativa del grupo O-amino (43); el carbono a es el car bono vecino al grupo funcional. NH? (R ;----- C — i COOH)

La determinación con ninhidrina de la presencia del producto final glicina involucra inicialmente un pro ceso de dos pasos, en el que un grupo amino es el iminado: a) se elimina hidrógeno, produciendo un iminoácido y finalmente se combina con oxígeno (de la ninhidrina) para formar agua y b) el iminoácido es hidrolizado a un cetoácido y amoníaco. El amoníaco no se acumula, sino que se transforma (48) en pasos secuenciales, produciendo color. La ninhidrina es positiva para todos los grupos libres, ya sea en aminoácidos, péptidos o proteínas (11) En el caso de un aminoácido libre que posee un grupo carboxilo libre (COOH) adyacente al grupo ami no, la reacción adicional causa la descarboxilación del iminoácido a dióxido de carbono y al próximo al dehido inferior, amoníaco y la reacción de color (11). La reacción descarboxilante de la ninhidrina es po sitiva para péptidos y proteínas (11). Uno de los productos de la hidrólisis, la serina, puede ser desanimada por la ninhidrina, que es reducida a un producto púrpura en el proceso (20). La reacción de la ninhidrina se basa en: a) la medición del C 0 2, b) la determinación de ser NH3 pre sente y c) el cambio de color (51). En la hidrólisis del hipurato, sólo se usa el desarrollo de color para ca racterizar una reacción positiva, aunque pueden usarse los otros medios de determinación para identifi car glicina. Durante la oxidación se libera un aldehido, NH3, C 0 2 y ninhidrina reducida. El NH 3reacciona con la ninhidrina residual y la ninhidrina reducida, hidrindantina, para formar un producto de reacción de color púrpura (33). Pasos de la reacción (11,26, 43, 48) 1.

ninhidrina (tricetohidrindina)(46)

a-Aminoácido (glicina)

a-lm inoácido (grupos caibonilo)

Ninhidrina reduci da hidrindantina + a-iminoácido (dicetohidrin damina) (46)

reducción o x id a tiv a —2H desaminación oxidativa

H ,0 hidrólisis rápida , ., , , , . „ (del paso 1 ) ------------------------------------------------■ a-C etoacido + amoniaco (alcalinidad)

CALOR

Aldehido (un átomo de ------------- ► carbono menos que el descarboxilación aminoácido original)

3. a-Cetoácido--------- :— :— —

dióxido de carbono

Los pasos 1-3 forman productos necesarios para la producción de color

Ninhidrina reducida (del paso 1)

Complejo intermedio

NH, liberado (del paso 2)

ninhidrina residual

NH, liberado (del paso 2)

condensación --------------------->• Complejo intermedio +

Complejo de condensación final de color azul fdicetohidrindilidenodiceto-hidrindamina) (46) (púrpura de Rhuhemann) (44) (enolato azul) (46) (absorbe luz en forma má xima a una longitud de onda de 570 nm)

V Pasos 4-5. producción de color

186

Pruebas bioquímicas individuales

Reacción global

Ninhidrina

Forma parcialmente reducida ninhidrinahidrindantina

Amoníaco

Ninhidrina residual i condensación

Complejo final coloreado (color púrpura-azul oscuro)

Complejo intermedio coloreado

*|-p__q _COOH no se a 's 'a realmente como intermediario. NH

(Redibujado y modificado de Harper, H. A., Rodwell, V. W. y Mayes, R. A. Review of Physiological Chemistry, 16a ed., 1977, pág. 26, con permiso de Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.)

La cromatografía gas-líquido (GLC) (37) es más reproducible que los métodos en tubo convenciona les para la determinación de la hidrólisis del hipurato en especies de Campylobacter (47). Según Morris y col. (47), los tubos son convenientes para el uso de rutina; sin embargo, se recomienda el método de GLC cuando las pruebas en tubo dan resultados cuestionables. La crom atografía en capa delgada (TLC) puede usarse para evaluar la actividad hidrolasa h ip u rato (52) o para confirm ar resultados dudosos de liberación de la glicina (59). La ventaja de la TLC es su capacidad de determ inar sem icuantitativam ente los productos de la glicina o del ácido b en zoico (52, 59).

Prueba de hidrólisis del hipurato 187 B. Discos de hipurato (41, 46, 56) 1. Fabricante: REM EL (véase Apéndice 11); seguir las instrucciones del fabricante. 2. Prueba para distinguir C. jejuni (+) de C. coli (-) y C. laridis (-). 3. Resultados en 3 h. 4. Los resultados positivos se basan en la presencia de un color azul, independientemente de su in tensidad (10). Sensibilidad del 9 5 especificidad del 94%. C. Prueba M A de hidrólisis del hipurato; prueba que usa los reactivos rodamina B y acetato de uranio co mo reveladores de color. No es un procedimiento de rutina (véase 2a. edición para el procedimiento).

PRECAUCIONES*1 4 3 2

A. Generales 1. Si se usan reactivos de FeCl3 o de ninhidrina, deben correrse controles positivos y negativos junto con los microorganismos de la prueba; si el medio sin sembrar se usa como control negativo, el tubo debe incubarse (6) junto con los microorganismos de la prueba para simular el mismo ambiente. 2. S. agalactiae bovino del grupo B, una causa frecuente de mastitis bovina (19), se encuentra en las ubres y en la leche de las vacas (2). Los estreptococos del grupo B están normalmente presentes en la vagin* del tracto genital femenino (7) pero se han aislado de diversos sitios y líquidos corpo rales (19), por ejemplo, de gargantas normales de seres humanos (2, 7). Con frecuencia los estrep tococos del grupo B están implicados en infecciones gray£s (34) y son patógenos humanos im por tantes (7, 45, 63) que causan septicemia materna y meningitis y neumonía en recién nacidos y lactantes (34). Braunstein y col. (7) demostraron que el microorganismo era un patógeno potencial del tracto urinario, causante de infecciones cutáneas y (casi exclusivamente en mujeres) de farin gitis. La cepas bovinas degradan el hipurato, pero ninguno de los tipos humanos posee esta capa cidad, y la hidrólisis del hipurato ayuda a ubicar adecuadamente los cultivos bovinos encontrados en gargantas normales (2). 3. La hidrólisis del hipurato se usa para la identificación dentro del género Streptococcus', sin embar go, esta capacidad enzimática también se encuentra en algunas especies de otros géneros: Aerococcus viridans, 100% positivos para h id ró lisis (18) E sp ecies de Bacillus. (14) E sp ecies de Beneckea (5) E sp ecies d e Corynebacterium (8)

Enterobacteriaceae (59) E sp ecies de Listeria (4, 18) Mycobacterium y Nocardia (22, 23) E sp ecies de Pediococcus (62) E sp ecies de Pseudom onas (35) E sp ecies de Staphylococcus', n o rm alm en te positivas; p uede variar entre cepas (35) E sp ecies de Strepiom yces (64)

Entre estos géneros, los únicos que deben ser motivo de preocupación cuando hidrolizan el hipura to son los cocos grampositivos catalasa negativos: Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus y Gemella; los otros géneros son catalasa positivos y/o bacilos grampo sitivos o gramnegativos, excepto las especies de Staphylococcus, que son cocos grampositivos, catalasa positivos. Las especies de Aerococcus son cocos grampositivos agrupados en tétradas, que producen zo nas grandes de a-hemólisis en agar con sangre de obeja (SBA); las especies de Pediococcus son sapro fitas de los vegetales (9) y no es probable que estén involucradas en infecciones humanas. 4. La prueba no debe aplicarse indiscriminadamente a todos los grupos de estreptococos; sólo es útil para los estreptococos (3-hemolíticos de origen humano o bovino (2). Cuando la P-hemólisis es el criterio para realizar la hidrólisis del hipurato, uno está interesado primordialmente en diferenciar estreptococos P-hemolíticos del grupo B de los estreptococos P-hemolíticos de los grupos A y D y de los enterococos del grupo D. Un microorganismo P-hemolítico debe identificarse como miembro del género Streptococcus antes de hacer la prueba de hidrólisis del hipurato, realizando primero una prueba de catalasa y una morfología por coloración de Gram. Todas las especies de Streptococcus son cocos grampo sitivos catalasa negativos, agrupados en cadenas, pares o aislados. La hidrólisis del hipurato se usa para ayudar en la identificación de los estreptococos del gru po B (18). H w ang y E derer (34) consideran esta prueba com o la m ejor form a de identificar

188

Pruebas bioquímicas individuales

estreptococos P-hemolíticos del grupo B . No debe confiarse en ninguna prueba aislada para la iden tificación presuntiva de microorganismos humanos o bovinos del grupo B; muchos microbiólo gos (7, 18) recomiendan usar una reacción de hipurato positiva en combinación con otras prue bas. Las pruebas serológicas son la única manera de confirmar la identificación del grupo B. Facklam y col. (18) recomiendan el diagnóstico clínico y el origen del cultivo junto con la hi drólisis. Braunstein y col. (7) recomiendan la identificación preliminar del grupo B correlacionan do la fuente con la morfología de las colonias en agar con sangre de oveja, seguida por dos prue bas confirmatorias: a) discos de bacitracina para descartar los P-estreptococos del grupo A y b) hidrólisis del hipurato para verificar la presencia de microorganismos del grupo B. La sensibilidad a la bacitracina se usa para distinguir estreptococos P-hemolíticos del grupo A de los que no per tenecen al grupo A, junto con estudios de inmunofluorescencia (61), y para diferenciar estreptoco cos p-hemolíticos del grupo A no de estreptococos p-hemolíticos que son del grupo A (7,18). Los microorganismos del grupo B a menudo se confunden con microorganismos del grupo A, sobre to do si se han obtenido en cultivos de fauces (7). Probablemente, S. agalactiae en cultivos de fauces se informa a veces incorrectamente como grupo D (que se supone poco importante) o como gru po A (importancia diferente) cuando se hacen estudios incompletos (7). Los estreptococos del gru po B también se confunden a menudo con otras bacterias, en especial las del grupo D, si el desa rrollo en caldo para Streptococcus faecalis (SF) es el único criterio (7). Los estreptococos P-hemolíticos que hidrolizan el hipurato pertenecen al grupo B o al gru po D; pueden ser diferenciados por la hidrólisis de bilis y esculina (18, 34) (grupo B, negati vos; grupo D, 99% positivos (18)) para la identificación presuntiva de este m icroorganism o (34). Facklam y col. (18) dem ostraron que ningún estreptococo del grupo A hidroliza el hipu rato, 96% del grupo B hidroliza el hipurato y 6,9.% de los enterococos del grupo D hidrolizan el hipurato. Los estreptococos hum anos y bovinos producen P-hemólisis (halo claro), pero el tipo hum ano m uestra halos hem olíticos más grandes alrededor de las colonias en placas de agar con sangre después de 24 h de incubación (2); los halos del grupo B son relativam ente estre chos (pequeños) y turbios (7). 5. La hidrólisis del hipurato no está limitada a los tipos P-hemolíticos (2); algunos tipos a de la ubre de la vaca no producen hidrólisis, mientras que la hidrólisis es una propiedad frecuente entre los estrep tococos de tipo láctico a y y (2). Los estreptococos no hemolíticos del grupo B se han aislado de se res humanos. Muchas especies de Enterococcus pueden hidrolizar el hipurato (7 ,9 ,1 8 ,5 8 ) y Facklam y col. (18) demostraron que un porcentaje pequeño (6,9%) de enterococos del grupo D son P-hemolíticos, que ninguna especie hidroliza más a menudo que otra y que no hay ninguna correlación de la hemolisis con la hidrólisis del hipurato entre estas cepas. Otros estreptococos que pueden hidrolizar el hipurato y son a o y-hemohticos son S. acidominimus y S. uberis, estreptococos viridans que se en cuentran raramente en muestras de infecciones humanas (7,18). Otra especie que no es P-hemolítica que se aisla de los seres humanos y es variable para la hidrólisis es S. dysgalactiae (cuadro 14.1). 6. La solución de hipurato se deteriora en 7 días a 4°C y debe perm anecer congelada cuando no está en uso (49). 7. Dado que la concentración de caldo de hipurato de sodio afecta los resultados de la prueba, los m e dios de cultivo con hipurato deben cerrarse herméticamente para evitar la evaporación durante la conservación (33).

Cuadro 14.1. Streptococcus/Enterococcus/Lactococcus p o s itiv o s /v a ría b le s p a ra

S. aga/acf/ae 3 S. dysgalactiae S. bovis E. faecalid> L. la c tic S. acidominimusf1 S. uberis

h id ró lisis d e l h ip u ra to

G ru p o d e L a n c e fie ld

H e m olisis, en a g a r con sa n g re de oveja a l 5%

H id ró lisis d e l h ip u ra to

B C D D N No agrupable No agrupable

oc, p, y a, y a, y oí, P, Y a, y a a, y

+ VV + V + V

Datos de la referencia 9. V, variable; V- , variable, normalmente-, a Fermentación del glicerol (en aerobiosis) +; hidrólisis de la arglnina +. bAnteriormente Streptococcus faecalis. 0Anteriormente Streptococcus lactis (55). d Fermentación del glicerol hidrólisis de la arginina hidrólisis del hipurato lenta.

Prueba de hidrólisis del hipurato 189 B. Procedimiento del cloruro férrico 1. Esta prueba requiere el agregado de reactivos a los cultivos, lo que impide repetir la prueba en el mismo cultivo (59), a menos que se tomen alícuotas asépticamente para la prueba. 2. Si el cultivo está excesivamente turbio, centrifugar para sedimentar el desarrollo y usar el líquido sobrenadante límpido para la prueba (18); la turbidez intensa puede producir un precipitado falso positivo que no desaparecería en 10-15 min. 3. Cuando se usa medio infusión de carne (peptona), se requiere más tiempo para que el medio se aclare cuando el hipurato no ha sido hidrolizado (2). 4. Después del agregado del reactivo de FeCl3, deben agitarse los tubos antes de inteipretar los resul tados, porque tanto la agitación como el exceso de FeCl3 ayudan a redisolver los precipitados so lubles de hipurato y glicinato para dar resultados negativos. La omisión de agitar los tubos puede dar resultados falsos positivos si el hipurato no está hidrolizado. 5. El procedimiento del cloruro férrico requiere un período de incubación prolongado, centrifugación y determinación de un punto final algo equívoco (16); éste es un proceso largo cuando se desean resul tados rápidos. La cantidad apropiada de cloruro férrico necesaria para alcanzar un exceso de iones férricos varía con la cantidad de medio de hipurato que se prueba y con la concentración de hipura to de sodio en el medio (33). Existe un delicado equilibrio entre el volumen de reactivo de FeCl3 y el de sobrenadante libre de células necesario para obtener resultados exactos; deben usarse controles positivos y negativos adecuados para asegurar un exceso de iones férricos durante la prueba (33). 6. Si el medio contiene fosfatos, es necesario usar una solución acidificada (con HC1) de FeCl3 para redisolver el fosfato de hierro formado (2), el cual podría producir un precipitado falso positivo. 7. El medio infusión de carne (peptona) requiere el uso de una solución acidificada de FeCl3 al 12% de concentración, no menos (2). 8. Para controlar la estabilidad de los constituyentes del medio con hipurato agregado, los tubos de ben taparse herméticamente después de la esterilización para evitar la evaporación de agua del caldo (6); hay errores considerables si la concentración de hipurato ha variado apreciablemente por cualquier razón (21). Si ha habido evaporación y la concentración de hipurato es inferior al 1% an tes de agregar el reactivo, puede ocurrir una reacción falsa positiva. Por consiguiente, antes del uso o de la conservación, se debe marcar el nivel del medio en cada tubo, y antes de agregar el reactivo, ajustar el nivel hasta la marca, si es necesario, con agua destilada. Los tubos hermética mente tapados y un nivel de líquido apropiado antes del uso equilibran la cantidad de medio gas tado y la cantidad de reactivo para dar una prueba más cuidadosamente controlada (6). 9. La prueba depende de las solubilidades relativas del benzoato férrico y del hipurato férrico; la con centración final de hierro es crítica y es necesaria la titulación del caldo de cultivo y del reactivo (13) antes de agregar cualquier reactivo al microorganismo de prueba. > 10. Colocar la solución del reactivo en una botella color caramelo tapada y guardar en un lugar oscu ro para evitar la exposición a la luz. La luz excesiva produce deterioro y pueden ocurrir resultados falsos negativos. Hacer un control de calidad semanalmente y desechar si la solución es negativa o débilmente reactiva con un control positivo conocido. 11. El precipitado coloreado puede ser destruido por el agregado de ácidos o bases (61). 12. El HC1 concentrado es sumamente cáustico, por lo que cuando se prepara el reactivo acidificado debe evitarse la exposición de la piel, ya que pueden ocurrir quemaduras dolorosas. Si el ácido en tra en contacto con la piel, lavar inmediatamente la zona con abundante agua. No pipetear el áci do con la boca; usar una pipeta Pro y siempre dejar correr el ácido concentrado lentamente por las paredes del frasco al agregarlo al agua, y descartar la pipeta en un recipiente adecuado. C. Procedimiento de la ninhidrina 1. No incubar los tubos más de 30 min en platina caliente, ya que pueden ocurrir resultados falsos positivos (34). 2. El procedimiento está limitado por no tener capacidad de desarrollo y por requerir un medio (am biente) no proteico (16). Dado que la mayoría de los medios de cultivo contienen proteínas y am i noácidos libres, no puede usarse la ninhidrina para la prueba de hidrólisis del hipurato en medios de cultivo que contienen proteínas (34). La prueba debe contener sólo hipurato, ya que la ninhi drina puede reaccionar con cualquier aminoácido libre en el medio de desarrollo u otros caldos (4). 3. Un tiempo de reacción superior a los 10 min dará resultados positivos no deseados con los estrep tococos del grupo D o con enterococos. Sin embargo, las pruebas de 6,5% de sal, bilis y esculina y, en la mayoría de los casos, la hemolisis evitarán la identificación errónea de estos microorganis mos como estreptococos del grupo B (48).

190

Pruebas bioquímicas ind viduales

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CAPÍ TULO

Prueba de ácido sulfhídrico

I. PRINCIPIO Determinar si se ha liberado enzimáticamente ácido sulfhídrico (H2S) gaseoso a partir de los aminoá cidos azufrados para producir una reacción coloreada visible, negra, en presencia de un sistema indica dor de H2S.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 y 45) A. Ayudar en la diferenciación de especies 1. Proteus mirabilis (+), P. penned (+) y P. vulgaris (+) de otras especies de Proteus (-). 2. Agar con azúcar triple y hierro (TSI): Erysipelothrix rhusiopathiae (+) (2) de especies de Corynebacterium (-) y de Listeria monocytogenes (-). 3. TSI: Campylobacter coli (+), C. concisus (+), C. hyointestinalis (+), C. mucosalis (+), C. sputorum biovar bubulus (+) y C. sputorum biovar sputorum (variable, por lo común positivo; V+) (25). 4. Microbacterium arborescens (+) y M. laevaniformis (+) de M. imperiale (-) y M. lacticum (-). 5. Sphingomonas paucimobilis (+) de S. parapaucimobilis (-). 6. Selenomonas ruminatium (+) de otras especies de Selenomonas (-) aisladas con mayor frecuencia. 7. Vagococcus salmoninarum (+) de V.fluvialis (-). 8. Aeromonas hydrophila (+), A. salmonicida subesp. masoucida (+) y A. salmonicida subesp. smithia (+) de otras especies de Aeromonas (-) aisladas con mayor frecuencia. B. Ayudar a la identificación 1. Enterobacteriaceae: Budvicia aquatica (V, por lo común +); Citrobacter freundii (V, por lo común +); Edwardsiella tarda (+); Salmonella (por lo común +); Proteus mirabilis, P. penned y P. vulga ris (V, por lo común +); especies de Leminorella (+); Morganella morganii del biogrupo 2 (V) y Pragia fontium (V, por lo común +). 2. Shewanella putrefaciens (+) (27) (antes Alteromans putrefaciens ), único no term entador que pro duce H2S en agar con hierro de Kligler (KIA)/TSI (25). 3. TSI: Arcobacter nitrofigilis (+) (antes Campylobacter nitrofigilis) (48). 4. Wolinella succinogenes (+).

III. BIOQUÍMICA La proteolisis de las proteínas produce aminoácidos individuales; ciertas bacterias heterotróficas pue den liberar enzimáticamente el azufre de los diversos aminoácidos azufrados (-SH ), produciendo H2S ga seoso (33). Peptona, cisterna, cistina, metionina y tiosulfato son fuentes de azufre, pero diferentes espe cies usan diferentes compuestos o aminoácidos azufrados para producir H2S (7). Las enzimas responsables ’ ' esta actividad son la cisterna desulfhidrasa (14, 31, 36) (antes denominada cisteinasa (14)) y la tiosul' reductasa (31). s aminoácidos azufrados (-SH ) son (18).

Prueba de ácido sulfhídrico 193 H2N — CH-COOH

H2N — CH-COOH CH2--------

h 2o

u -

c h -n h 2

+ H2St

COOH

Cisteína

Ácido pirúvico

nh3

Sulfuro de Amoníaco hidrógeno gaseoso

En el mercado existen muchos medios de cultivo con peptona y hierro para detectar la producción de H2S entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae. Los indicadores de sulfuro varían entre estos medios de cultivo: hierro peptouizado, sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso o férrico, citrato férrico, tiosulfato de so dio, sulfito de bismuto o acetato de plomo; sin embargo, el principio es el mismo. En uno de estos medios, el KIA, los indicadores de H2S son una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes, ya que el resultado final es un procedimiento en dos pasos. PASO 1

El tiosulfato es un intermediario en la reducción de sulfato a H 2S por las bacterias reductoras de sul fates (24). La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio en una reacción de reducción que da un sulfi to y un sulfato (11). Debe haber un pH ácido y una fuente de iones H+ en el KIA para que tenga lugar la reducción del tiosulfato. Hay dos hidratos de carbono presentes para proporcionar la acidez y el exceso de iones H+ (25). Éste es un proceso de respiración anaerobia en el cual el átomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidación de los sustratos orgánicos (38). El tiosulfato S2C>3 ~ reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es la fuente de azufre del microorganismo (11). •>

4H+

tiosulfato

+ 4e + 3S20 3 ------------------------- ►2 S O f + reductasa

Tiosulfato

Sulfito

2H2S

Sulfuro de hidró geno gaseoso

El H2S es un gas incoloro; por consiguiente, es necesario un segundo indicador para visualizar la pro ducción de H2S. PASO 2

El gas incoloro H2S reacciona con una sal fuerte de hierro, el citrato de amonio férrico, para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico. Se recomienda el uso de citrato de amonio férrico en lugar de citrato férrico porque es más soluble. El sulfato ferroso puede sustituir la sal férrica.

194

Pruebas bioquímicas individuales

La producción de H2S se detecta cuando el gas entra en contacto con ciertos metales, como plomo, hie rro o bismuto, y forma sulfuras de estos metales. Sulfuro de hidrógeno gaseoso+ Iones férricos

Sulfuro ferroso i precipitado negro

Reacción global Bacteria (en medio ácido) + tiosulfato de sodio------► H2S gas T (1)

H/5 +

férricos ----- ►Sulfuro ferroso i precipitado negro insoluble

(2)

Por consiguiente, el H2S gaseoso puede ser producido por la reducción de una fuente de azufre inor gánica como el tiosulfato (-S 20 3) o por la reducción del azufre orgánico proporcionado por el grupo fun cional R j-S H del aminoácido cisterna que está presente en la peptona (32). El acetato de plomo, Pb(C2H30 2)2 • 3H20 (PbAc), la sal del metal, también es un indicador de pro ducción de H2S. Al entrar en contacto con el PbAc, el H2S produce sulfuro de plomo, un precipitado ne gro, en una reacción de color negro visible. El PbAc es sumamente sensible y puede detectar cantidades pequeñas de H 2S; se requiere una concentración de por lo menos 0,2 mM para la detección de sulfuro en un medio con peptona (50). Pb(C2H30 2)2 •3H 20 + H2S Acetato de plomo

Sulfuro de hidrógeno g ase o so

+ H20 + Ac“

-------- ► P b S i

Acetato

Sulfuro de plomo i precipitado negro

La capacidad de un microorganismo para producir H2S es una característica consistente, y un produc tor de H2S normalmente produce gas (C 0 2 + H2) en los medios de cultivo con hidratos de carbono. Al de term inar la producción de H2S se deben tener en cuenta cuatro factores (7, 25): a) el tipo y la disponibi lidad de la fuente de azufre; b) la sensibilidad de la prueba para la detección de H2S; c) el desarrollo del microorganismo en un medio basal; d) la presencia del sistema enzimático productor de H2S en el mi croorganismo a probar. Existen muchos medios para detectar la producción de H2S, pero los procedimien tos con PbAc son los más sensibles para la detección de cantidades ínfimas de H2S en las bacterias que no sean de la familia Enterobacteriaceae.

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

____

____________________________

Cuadro 15-1. M e d io s de cu ltivo d e te cto re s d e H 2S u sa d o s co n m a y o r frecuencia Medio

Propósito

Fuente(s) ele azufre Indicadores) de H¿S

Agar bilis-esculina (BEA) Agar sulfito de bis muto (BSA) Agar sulfuro-citrato0 Agar desoxicolatocitrato (DCA) Agar entérico de Hektoen (HE) Agar con hierro de Kligler (KIA) Tiras de acetato de plomo (PbAc) Agar con lisina y hierro (LIA) Agar peptona-hierro (PIA)

Aislamiento/diferenciación de Streptococ-

Peptona

Citrato de amonio férrico

Peptona y sulfitob

Sulfato ferroso

cus/Enterococcus Aislamiento selectivo de Salmonella

Ayuda a la diferenciación entre géneros Tiosulfato de sodiod Aislamiento de microorganismos entéricos Peptona gramnegativos Aislamiento selectivo/diferenciación de Tiosulfato de sodio

Citrato de amonio férrico Citrato férrico Citrato de amonio férrico

Salmonelia/Shigella Ayuda a la identificación de microorganis mos entéricos gramnegativos Bacterias que exhiben pequeñas cantida des de H2S Ayuda a la identificación de microorganis mos entéricos gramnegativos Ayuda a la identificación de microorganis mos entéricos gramnegativos

Tiosulfato de sodio Tiosulfato de sodio

Sulfato ferroso o citrato de amonio férrico Acetato de plomo

Tiosulfato de sodio

Citrato de amonio férrico

Tiosulfato de sodio

Citrato de amonio férrico

Prueba de ácido sulfhídrico 195 Cuadro 15-1. M e d io s de cultivo de te cto re s de H2S u sados con m a y o r fie cu e n cia (cont.) Medio

Propósito

Fuente(s) de azufre

Indicador(es) de HsS

Agar SalmonellaShigella (SS) Moviiidad-sulfuroindol (SIM) Agar tiosulfato-citrato-sales biliaressacarosa (TCBS) Agar con azúcar tri ple y hierro (TSI) Agar xilosa-lisinadesoxicoiato (XLD)

Aislamiento selectivo de Salmonella/Shi-

Tiosulfato de sodio

Citrato férrico

Ayuda a la identificación de microorganis mos entéricos gramnegativos Aislamiento selectivo/diferenciación de vi briones

Tiosulfato de sodio

Hierro peptonizado, sul fato de amonio ferroso Citrato férrico

Ayuda a la identificación de microorganis mos entéricos gramnegativos Aislamiento/diferenciación de Salmone-

Tiosulfato de sodio

gella Peptona, tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio

Sulfato ferroso, sulfato de amonio ferroso Citrato de amonio férrico

lla/Shigella

Datos de las referencias 2 y 25. a Los medios de cultivo detectores de H2S no usados de manera sistemática son el Tergitol 7 (T7) agar/caldo, el agar de Tinsdale, el agar Vibrioparahaemoiyticus (VP), el agar esculina de Lombard-Dowell, el medio de sulfuro para movilidad, el medio de carne cocida (picada) (CM), el medio de Rimler-Shotts (RS), el agar oleandomicina-polimixina-sulfadiazinaperfringens (OPSP) y el agar Salmonella de Ónóz. b En presencia de fermentación de la glucosa, el sulfito (p. ej., sulfito de bismuto) es reducido con producción de sulfuro de hierro. 0 Medio de citrato de Christensen solo; aditivos opcionales. d El tiosulfato de sodio es un compuesto inorgánico agregado a un medio como suplemento.

A. Medios de cultivo comerciales que contienen aminoácidos azufrados usados con mayor frecuencia 1. Detección de H 2S en la familia Enterobacteriaceae a. A g ar con h ie rro de K ligler (KIA) (véase cap. 18, agar con hierro de Kligler). b. A g ar con az ú c a r trip le y h ie rro (TSI) (véase cap. 18, agar con hierro de Kligler/agar con azú car triple y hierro). c. A g ar sulfito de bism uto (BSA) (1) Fórmula de Wilson y Blair (49); modificada por Hajna (16) y Hajna y Damon (17). (2) Ingredientes, pH 7,5 ± 0,2 10 g 5g 5g 4g 0,3 g 8g 0,025 g 20 g 1.000 mL

Peptona de caseína/came (50/50) Extracto de carne (de vaca) Glucosa (dextrosa) Fosfato disódico, Na2HP04 • 12H20 Sulfato ferroso, FeS04 • 7H20 Sulfito de bismuto, Bi2(S03)3 Verde brillante Agar Agua desionizada A gares desoxicolato (desoxicolato de sodio) (cuadro 15-2) (1) A g ar desoxicolato (ag a r D) Peptona de caseína/came (50/50) Lactosa Cloruro de sodio, NaCl Fosfato dipotásico, K2HP04 • 12H20 Citrato férrico, FeCfiFL07 • 5H,0,(o sulfato de amonio férrico, FeNH4(S04)2 • 12H20) Citrato de sodio, Na3C6H50 7 • 2HzO Desoxicolato de sodio, C24H40O4Ña Agar Rojo neutro (M ejor agregarlo como solución acuosa al i Agua desionizada

10,g 10 g 5g 2g 1g 1g 1g 15 g 0,033 g (33 mg) agregar 3 mL/L (26) 1.000 mL

(Nota: Si el medio se va a usar en placas para estriar para patógenos entéricos, el citrato fénico puede omitir se; sin embargo, entonces es mejor continuar agregando 0,1% de citrato de sodio para aclarar el medio.)2 (2) A g ar desoxicolato-citrato (ag a r DC): modificación’de Leifson (26); concentración más alta de citrato de sodio y de desoxicolato de sodio.

196

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 15-2. D ife re n cia s p rim a ria s entre d ive rso s a g a re s b a se co n desoxicolato Concentración (g/L) Ingrediente

DCL

DCLS

DC LS

Lactosa Sacarosa Citrato de sodio Desoxicolato de sodio Tiosulfato de sodio Indicador de pH pH final

7,5 7,5

1 1

20 a 5

2 0,5b

NR 7,3

NR 7,3-7,5

5 5 6-10,5a 2,5-3 5 NR 7,2-7,5

7,1

10a 10

7,5 BCP 7,2

NR, rojo neutro; BCP, púrpura de bromocresol. a Concentración aumentada para el aislamiento de patógenos entéricos, especies de Salmonella y Shigella. b Concentración disminuida para el recuento de conformes.

(3) Agar desoxicolato-citrato-lactosa (DCL): fórmula de Leifson (26); menor concentración de desoxicolato de sodio. (4) Agar desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa (DCLS): fórmula de Leifson (26). (5) Agar desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa (DCLS): fórmula de Hajna y Damon (17). e. Agar entérico de Hektoen (agar HE, HEA) (1) Modificación de King y M etzger (20-22); fórmula según especificaciones APHA (37). (2) Ingredientes; pH 7,5-7,6 ± 0,2 Peptona de carne Extracto de levadura Lactosa Sacarosa Salicina Sales biliares Citrato de amonio férrico (mezcla 50/50 de citrato férrico, FeC6H50 7 • 5H20, y citrato de amonio, (NH4)3C6H50 7) Tiosulfato de sodio, Na2S20 3 • 5H20 Cloruro de sodio, NaCl Fucsina ácida Azul de bromotimol (BTB) Agar Agua desionizada

12 g 3g 12 g 12 g 2g 9g 1.5 g 5g 5g 0,19 g 0,065 g 14 g 1.000 mL

f. Agar con lisina y hierro (LIA) (1) Fórmula de Edwards y Fife (12). (2) No suplanta el medio de descarboxilasa de M pller (2) ni puede ser sustituido por KIA o TSI. (3) Ingredientes, pH 6,7 ± 0,2 Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa (dextrosa) L - Lisina • HC1 Citrato de amonio férrico Tiosulfato de sodio, N a ^ C ^ • 5H20 Púrpura de bromocresol (BCP) Agar Agua desionizada

5g 3g 1g 10 g 0g 0,04 g 0,02 g 15 g 1.000 mL

g. Agar peptona-hierro (PIA); medio semisólido; pH 6,7 ± 0,2 (10) Peptona Citrato de amonio férrico Tiosulfato de sodio, Na2S20 3 • 5H20 Fosfato dipotásico, K2HP04 Agar Agua desionizada h. Agar para sulfuro-indol-movilidad (SIM ); medio semisólido

20 g 0,5 g 0,08 g 1g 15 g 1.000 mL

Prueba de ácido sulfhídrico 197 (1) Ayuda a identificar integrantes de la familia T.i iterobacteriaceae, en especial Salmonella y Shi gella, por la producción de sulfuro, la formación de indol y la movilidad; se usa después de la evidencia presuntiva obtenida en medios de cultivo diferenciales en tubo (p. ej., KIA/TSI). (2) Ingredientes, pH 7,3 ± 0,2 Peptona de caseína Peptona de carne Sulfato de amonio ferroso, FeNH4(S04)2 • 12H20 (o li ierro peptonizado 0,2 g) Tiosulfato de sodio, Na2S20 3 • 5H20 Agar Agua desionizada

20 g 6,1g 0,2g 0,2g 3,5g 1.000 mL

{Nota: la peptona de caseína contiene triptófano, necesario para la producción de indol.) i. Agar Salm onella-Shigella (SS) (1) Modificación del agar desoxicolato-citrato de Leifson (26). (2) Ingredientes, pH 7 ± 0,2 Peptona de caseína/came (50/50) Extracto de carne (de vaca) Lactosa Citrato de sodio, C3 H4OH(COO)3Na3 Mezcla de sales biliares Tiosulfato de sodio, N a ^ O j • 5H20 Citrato férrico, FeC6H50 7 • 5H20 Rojo neutro Verde brillante Agua desionizada

5g 5g 10 g 8.5 g 8.5 g 8.5 g lg 0,025 g 0,00033 g (0,33 mg) 1.000 mL

j. Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) (1) Aislamiento e identificación de patógenos entéricos; sobre todo apoya el desarrollo de las especies de Shigella y Providencia con mayores requerimientos de cultivo (40-45). (2) Ingredientes, pH 7,5 ± 0,2 Extracto de levadura Xilosa L-Lisina • HC1 Lactosa Sacarosa Cloruro de sodio, NaCl Desoxicolato de sodio, C24H40O4Na Tiosulfato de sodio, Na2S20 3*5H20 Citrato de amonio férrico Rojo fenol Agar Agua desionizada

3g 3,5 g 5g 7,5 g 7,5 g 5g 2,5 g 6,8 g 0,8 g 0,08 g 13,5 g 1.000 mL

2. Especies de Streptococcus/Enterococcus: agar bilis esculina (BEA) (véase cap. 2). 3. Ayuda a diferenciar géneros: agar sulfuro-citrato de Christensen (6), pH 6,7 ± 0,2 4 Extracto de levadura Glucosa (dextrosa) Citrato de sodio, Na3C6H50 7 • 2 H20 Cisterna • HC1 Citrato de amonio férrico Fosfato monopotásico, KH2HP04 Cloruro de sodio, NaCl Tiosulfato de sodio, Na2S20 3 • 5H20 Rojo fenol Agar Agua desionizada

0,5 g 0,2 g 3g 0,1 g 0,4 g 1g 5g 0,08 g 0,012 g 15 g 1.000 mL

4. Aislamiento/diferenciación de vibriones: agar tiosulfato-citrato-sales-biliares sacarosa (TCBS) (agar selectivo para Vibrio) a. Fórmula de Nakanishi (30); modificada por Kobayashi, Enomoto, Sakazaki y Kuwahara (23).

198 (2)

Pruebas bioquímicas individuales Ingredientes, pH 8,6 ± 0,2 Peptona de caseína/came (50/50) Extracto de levadura Sacarosa Citrato de sodio, Na3C6H50 7 • 2H20 Tiosulfato de sodio, Na2S20 3 • 5H20 Sales biliares (o colato de sodio, 3 g, y Oxgall deshidratado, 5 g (34)) Cloruro de sodio, NaCl Citrato férrico, FeC6H50 7 • 5H20 Azul de timol Azul de bromotimol (BTB) Agar Agua desionizada

10 g 5g 20 g 10 g 10 g 8g 10 g 1g 0,04 g 0,04 g 15 g 1.000 mL

5. Método de preparación: para cualquiera de los medios de cultivo anteriores a. Pesar con precisión la cantidad que indica la etiqueta. Los productos de diversas compañías pue den diferir ligeramente. b. Rehidratar con agua destilada o desionizada c. Calentar suavemente la solución. d. Distribuir los medios de cultivo antes de la esterilización. (1) Tubos: 4-5 mL/tubo (13 x 100 mm): KIA, TSI, BEA, sulfuro-citrato, LIA, PIA. (2) Tubos: 8 mL/tubo (16 x 125 mm): SIM. (3) Placas: BEA; esterilizar el frasco de medio antes de verter. e. Método de esterilización para todos los medios de cultivo en tubo y para los frascos de BEA: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. No esterilizar en autoclave los medios de cultivo siguien tes: BSA, agares con desoxicolato, agar de Hektoen, agar SS, TCBS y agares XLD (véase IX. Precauciones). f. Enfriar los medios de cultivo en tubo. (1) En pico de flauta con fondos profundos: KIA, TSI, LIA. (2) En pico de flauta con picos largos/fondos cortos: BEA y agar sulfuro-citrato. (3) En posición vertical (derechos): los medios de cultivo semisólidos PIA y SIM. g. En baño María, a 37°C: todos los medios de cultivo en placas. (1) Enfriar el frasco de medio a 45°C-50°C. (2) Asépticamente verter 15-20 mL por placa de Petri estéril. (3) Enfriar en posición vertical (tapa hacia arriba). (4) Desplazar la tapa (ligeramente entreabierta) para secar la superficie. (5) Usar el mismo día que se vierten. h. Método de inoculación (1) Cultivo puro, una sola colonia aislada. (2) Tocar el centro de la colonia con una aguja de inoculación. (3) Medios de cultivo en tubo en pico de flauta. (a) Estriar la porción inclinada. (b) Punzar el fondo. 1. Hasta 0,5 cm del fondo. 2. Retirar la aguja siguiendo el trayecto de entrada. (c) El orden puede invertirse si se prefiere. (4) Vertical (PIA, SIM), punzar el fondo. (a) Hasta 0,5 a 1,25 cm del fondo. (b) Retirar la aguja siguiendo el trayecto inicial de la inoculación. i. M edios de cultivo en placa; estriar para el aislamiento (método de los 4 cuadrantes). (Véase cap._ 31 para el procedimiento.) 6. Incubación a. 35°C. b. Todos los medios de cultivo en tubo, 18-24 h. c. Medios de cultivo en placa (1) Invertidos (tapas hacia,abajo). (2) Hasta 48 h antes de informar como negativos.

Prueba de ácido sulfh ídrico 199 B. Prueba con tiras de PbAc, principalmente para la detección de H2S por bacterias que no sean de la fami lia Enterobacteriaceae; microorganismos no entéricos que pueden producir cantidades pequeñas de H2S. 1. Tiras de reactivo a. Reactivo: solución acuosa caliente, saturada, al 5% de PbAc. b. Hay tiras para la prueba de H2S disponibles en el comercio. c. Preparación de las tiras de papel de PbAc (1) Cortar papel de filtro blanco en tiras de aproximadamente 1,25 cm de ancho y 5 cm de largo. (2) Remojar las tiras en la solución de PbAc caliente y colocar (con pinzas) en placas de Petri grandes de vidrio o en frascos de boca ancha con tapa a rosca. (3) Secar al aire o colocar en estufa a 50-60°C. (4) Sellar la placa de Petri con cinta para autoclave; dejar flojas las tapas de los frascos. d. Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. e. Enfriar y secar, después ajustar las tapas. f. Rotular el recipiente con la fecha de la esterilización en la autoclave. Reesterilizar después de 3 semanas para mantener la esterilidad. 2. M edios de cultivo empleados a. Para la detección de H2S de rutina; 3 opciones (1) Caldo nutritivo, pH 6,9 ± 0,2 Peptona o peptona proteasa Extracto de carne Agua desionizada

5g 3g 1.000 mL

(2) Caldo de tiopeptona, pH 6,8 ± 0,2 Peptona Thiotone Extracto de carne Agua desionizada

5g 3g 1.000 mL

(3) Caldo con tripticasa soja (TSB), pH 7,3 ± 0,2 Peptona tripticasa Peptona (de porotos de soja) Cloruro de sodio, NaCl Fosfato dipotásico, K2HP04 Glucosa (dextrosa) Agua desionizada

17 g 3g 5g 2,5 g 2,5 g 1.000 mL

(4) Método de preparación: para cualquiera de los medios de cultivo anteriores (a) Pesar con precisión la cantidad que indica la etiqueta. Los productos de diferentes com pañías pueden diferir ligeramente. (b) Rehidratar con agua destilada o desionizada. (c) Calentar suavemente la solución. (d) Distribuir alrededor de 4 -5 mL por tubo, excepto para la peptona Thiotone (Thiopeptone), 0,8 mL por tubo (75 x 10 mm) (29). (5) Método de esterilización para todos los medios de cultivo: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. (6) Enfriar a 45°C en baño Mana. b. Especies de Brucella. Detección de H2S: picos de flauta de agar glucosa suero (19) o de Tryptose agar (1) (1) Ingredientes, base nutritiva Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio, NaCl Agar Agua desionizada

10 g 5g 5g 20 g 1.000 mL23

(2) Preparación de la base nutritiva (véase Sección IV.B.2.a. (4)-(6)). (3) De manera aséptica, agregar los enriquecimientos estériles al medio base enfriado. Suero de caballo Glucosa, al 20% en solución acuosa Base nutritiva

50 mL 50 mL 1.000 mL

200

Pruebas bioquímicas individuales (4) M ezclar completamente. (5) D e manera aséptica, distribuir alrededor de 5 mL por tubo estéril. (6) Enfriar en posición inclinada y refrigerar para la conservación (4-10°C).

El género Brucella requiere enriquecimientos adicionales con puentes sulfhidrilo (-SH ) para la detec ción de H 2S. 3. Procedimientos a. Macroprocedimiento (1) Método de ZoBell y Feltham (50). (2) M edios de cultivo: varias opciones Caldo con tripticasa soja (TSB) Caldo nutritivo Picos de flauta con agar glucosa suero, sólo para especies de Brucella (3) Inoculación (a) Desarrollo proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 horas: KIA u otro cultivo conveniente.

(b) Inóculo abundante. (4) De manera aséptica, suspender una tira de PbAc estéril por encima del nivel del caldo. (a) Colocar la tira en el tubo. 1. A lo largo de una pared. 2. Aproximadamente a 10 mm sobre el nivel del caldo 3. No sumergir la tira en el caldo. (b) Fijar la tira. 1. Doblar un extremo de la tira sobre el borde del tubo. 2. Colocar nuevamente el tapón para sostener la tira en su lugar. (5) Incubación (a) Especies de Brucella 1. 35°C 2. Tensión de C 0 2 aumentada (10%). 3. Cambiar la tira de PbAc diariamente durante los 7 días de incubación. 4. Registrar los resultados diariamente. (b) Todos los otros microorganismos 1. 30°C (óptimo) a 35°C (47). 2. Leer después de 12 y 24 h. a. Puede haber un resultado positivo dentro de las primeras 12 h de incubación. b. Si es negativo después de 24 horas, incubar nuevamente. 3. M antener hasta 6 días antes de informar como negativo. a. Leer diariamente. b. No cambiar las tiras. U sar la m isma tira durante los 6 días. Tittsler (47) encontró que con ciertas bacterias se detecta más H 2S cuando los cultivos se incuban a 30°C. La detección de H2S con tiras de papel con PbAc es más ventajosa que incorporar efectivamente PbAc en el medio, ya que obvia los posibles efectos tóxicos de la sal metálica (7). Asimismo, es más fá cil detectar H2S en las tiras de PbAc que observar una reacción de color en el medio; la tira detecta can tidades tan pequeñas como 0,01 mmol de sulfuro liberado a partir de la peptona (50). Es esencial un inóculo abundante del microorganismo de prueba, porque la cantidad de H2S produci da y el tiempo transcurrido hasta la detección dependen de la concentración de la suspensión (8). Cuan do se usa un inóculo abundante, puede haber una reacción positiva ya a los 15-30 min de incubación y por lo general en 1-2 h con la mayoría de los microorganismos (8). b. Microprocedimiento (1) Método de Morse y Weaver (29). (2) Medio: caldo de Thiopeptone. Si se prepara justo antes de usar, no hay necesidad de este rilizar los tubos ni el medio (29). (3) Inoculación (29) (a) Calentar los tubos en un baño de agua a 37°C. (b) Desarrollo proveniente de un cultivo puro de 6 h en fase logarítmica, desarrollado en un medio enriquecido (p. ej., agar infusión en pico de flauta).

Prueba de ácido sulfhídrico 201 (c) Transferir el inoculo con un hisopo. 1. El hisopo no tiene que ser estéril. 2. Raspar la mitad de la superficie del pico de flauta; inoculo abundante. (d) Hacer rotar suavemente el hisopo en el medio; descartar el hisopo en desir fectante. (4) De manera aséptica, suspender una tira de PbAc estéril a aproximadamente 10 mm sobre el nivel del caldo; fijar la tira doblando un trozo de 1 cm sobre la boca del tubo. No sumergir la tira en el caldo. (5) Incubación: 35°C; leer los resultados a intervalos de 15 min durante un lapso de 45 min. Según Morse y Weaver (29), su microprocedimiento da resultados comparables a los obtenidos por el macrométodo; sin embargo, una incubación más larga aumenta la sensibilidad y muchos microorganismos muestran producción de H2S no observada con las macrotécnicas. El Thiopeptone (BBL-Thiotone peptona) es especialmente rico en azufre. El tiempo necesario para la detección de H2S aumenta si el cultivo usa do para la siembra no está en fase de crecimiento logarítmica (29). Según Morse y Weaver (29), las varia ciones en la producción de H 2S entre los m icroorganismos “difieren cuantitativamente en lugar de cualitativamente”.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Detección de H2S principalmente de miembros de la familia Enterobacteriaceae 1. Positivo (+) Salmonella choleraesuis subesp. arizonae ATCC 13314 2. Negativo (-) Shigella flexneri Escherichia coli

ATCC 12022 ATCC 25922

B. SIM Microorganismo Salmonella typhimurium Shigella flexneri Escherichia coli

ATCC 13311 9199 25922

h 2s

Indole

Movilidad +

C. Agar bilis-esculina (BEA) 1. Positivo (+): Enterococcusfaecalis 2. Negativo (—): Streptococcus pyogenes

ATCC 29212 ATCC 19615

D. Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) 1. Positivo (+): Enterococcus faecalis 2. Negativo (—): Vibrio parahaemolyticus E. Agar con lisina y hierro (LIA) 1. Positivo (+) Salmonella choleraesuis subesp. arizonae Citrobacter freundii 2. Negativo (-): Proteus vulgaris

VI.

ATCC 29212 ATCC 17802

ATCC 13314 ATCC 8454 ATCC 9484

RESULTADOS

Vil. INTERPRETACIÓN A.

Medios de cultivo con aminoácidos azufrados 1.

M edios de cultivo en tubo: KIA, TSI, BEA, LIA, sulfuro-citrato, SIM, PIA a. Positivo (+): cualquier ennegrecimiento del medio. (1) A lo largo de la línea de siembra. El ennegrecimiento se ve primero donde la fermentación ácida es máxima, a lo largo de la línea de siembra (25).

202

Pruebas bioquímicas individuales

(2) En todo el fondo. b. Negativo (-): ausencia de ennegrecimiento. 2. M edios de cultivo en placa: BSA, agar desoxicolato, Hektoen, SS, TCBS, XLD a. Positivo (+): colonias negras rodeadas por una zona negra pardusca en el medio. (1) El diámetro del halo puede ser de varias veces el tamaño de la colonia. (2) La supericie del halo puede exhibir un brillo metálico. b. Negativo (-); ningún ennegrecimiento y ningún brillo metálico. B. T iras de PbA c 1. Detección de H2S de rutina a. Positivo (+) (1) Color negro pardusco en la tira de papel; puede tener un cierto brillo. (2) Registrar el grado de ennegrecimiento; trazas (T) a 4+. b. Negativo (-) (1) Ningún cambio, ningún color en la tira. (2) Controlar la reacción sacando la tira y agregando unas gotas de HC1 2 N (170 mL de HC1 llevados a 1 L con agua destilada) al cultivo. (a) El ácido disuelve el H2S, si está presente. (b) Colocar nuevamente la tira y observar de nuevo después de unos minutos. 2. Especies de Brucella. Detección de H2S (9) a. El tiempo en que se produce el H2S sólo es importante con las especies de Brucella. b. Registrar los resultados diariamente; ejemplos: (1) “H 2S producido en los primeros 2 días.” (2) “H 2S producido del primero al quinto día.” c. Resultados (1) Positivo (+): color negro pardusco de la tira de papel; puede tener cierto brillo. (2) Negativo (-): ningún cambio, ningún color en la tira. La magnitud del ennegrecimiento de una tira de PbAc puede medirse en milímetros, lo que transfor m a la prueba en un procedimiento cuantitativo (50).

VIII.

PRUEBA RÁPIDA

H2S/Indole Disks de BBL: Seguir las instrucciones del fabricante.

IX. PRECAUCIONES A.

Medios de cultivo con aminoácidos azufrados 1. Generales a. Deben cumplirse las siguientes condiciones para detectar la producción de H2S: a) el medio de be contener una fuente de azufre ( - SH); por ejemplo, aminoácidos, cisterna y metionina; b) de be estar presente un indicador de H2S; c) el medio debe soportar el desarrollo del microorga nismo de prueba, y d) la bacteria presente debe poseer un sistema enzimático productor de H2S (25). Las diferencias entrejos diversos medios de cultivo para la detección de H2S se deben a las alteraciones en una o más de estas cuatro condiciones; la producción de H2S por un microor ganismo específico en un medio puede no detectarse en otro (25). Uno debe conocer el siste m a de prueba exacto para poder interpretar los resultados. b. Deben hacerse controles de la peptona usada en el medio para H2S a fin de determinar si el con tenido de azufre es suficiente para la detección de H2S. Si la peptona es deficiente para la de tección rápida de H2S, puede agregarse cisterna para enriquecer la concentración de puentes sulfhidrilo ( - SH). c. Según Tittsler (47), hay cierta inhibición del H2S cuando la prueba se incuba a 34°C, y la inhi bición aumenta a m edida que aumenta la temperatura hasta 40°C. Tittsler realizó experimentos con Salmonella pullorum y encontró que las temperaturas óptimas de incubación para la pro ducción máxima de H 2S variaban entre 30°C y 34°C. d. El detector de H 2S sulfato ferroso es un poco menos sensible que otras sales férricas o ferrosas; por lo tanto, puede haber diferencias en las lecturas de H2S entre KIA/TSI y otros medios de cultivo para la detección de H,S (25).

Prueba de ácido sulfhídrico 203 e. La mayoría de las bacterias usan los sulfatas como fuente principal de azufre; sin embargo, el sulfato debe reducirse, dado que el azufre está en el nivel de oxidación del H2S en la mayoría de los compuestos azufrados (15). 2. KIA/TSI a. La producción de H2S puede ser evidente en KIA, pero negativa en TSI debido a la sacarosa que sólo está presente en TSI (4). Bulmash y Fulton (4) demostraron que el uso de sacarosa pue de suprimir los mecanismos enzimáticos responsables de la producción de H2S, enmascarando el indicador sulfuro férrico en el medio. Padrón y Dockstader (32) afirman que no todas las es pecies de Salmonella productoras de H2S son positivas en TSI y que este medio no proporcio na separaciones bien definidas de otros miembros productores de H2S de la familia Enterobacteriaceae. b. El KIA es más sensible que el TSI porque se cree que la sacarosa suprime los mecanismos en zimáticos responsables de la producción de H2S (25). c. Los medios de cultivo KIA/TSI carecen de inhibidores y todas las bacterias crecerán, menos las que tienen más requerimientos especiales de cultivo, con la excepción de los anaerobios obligados (25). Por consiguiente, estos medios de cultivo sólo pueden usarse cuando se seleccionan las bac terias de prueba a partir de una sola colonia recuperada en placas de agar primarias o selectivas (25).

3. Agar sulfito de bismuto a. El BSA deshidratado se deteriora rápidamente cuando es expuesto a la atmósfera; el deterioro se indica por la formación de masas sólidas, no friables, con adquisición de un color castaño. Al rehidratarlo, el medio permanece de color castaño en lugar del verde normal y pierde sus propiedades selectivas y diferenciales (46). b. El BSA no debe guardarse en el refrigerador (4°C) por más de 2 días; después de 3 días de al macenamiento el medio se pone verde y pierde su selectividad, por lo que se recuperan núm e ros menores de Salmonella (28). Preferentemente, el medio debe usarse en el día de su prepa ración y no debe guardarse. c. No permita que la luz del sol incida directamente sobre las placas de BSA; se produce una reac ción que destruye la utilidad del medio (39). d. Sólo las colonias de S. typhi que crecen cerca de la superficie o en la superficie muestran un bri llo negro metálico definido. e. Las muestras conservadas en glicerol deben diluirse primero con agua para reducir el conteni do de glicerol, ya que S. typhi se inhibe en 2% de glicerol (10). f. Las colonias de S. typhi típicas normalmente desarrollan en el término de 24 h; sin embargo, todas las placas deben incubarse durante 4S hpara permitir el desarrollo de todas las cepas tifoideas (10). g; No esterilice el medio en autoclave; calentarlo mucho más tiempo del necesario para disolver los ingredientes destruye su selectividad (10). 4. Agares con desoxicolato-citrato: hervir el medio sólo hasta que se funda; el calentamiento exce sivo en cualquier momento aumenta la inhibición. No esterilizar en autoclave. La combinación de citrato y hierro (Fe) tiene un fuerte efecto hidrolizante sobre el agar si el medio se calienta, ló que produce un agar blando, no elástico; si se esteriliza en autoclave, se ablanda aún más y es ca si imposible de sembrar por estrías (26). 5. Agar entérico de Hektoen (HE), (HEA): no esterilizar el medio en autoclave; el calor excesi vo puede alterar los ingredientes. La esterilización no es necesaria; el medio es muy inhibitorio pa ra los microorganismos Grampositivos.

6. Agar con lisina y hierro (LIA) a. Las especies de Proteus productoras de H2S no ennegrecen este medio (2). El sulfuro ferroso (FeS) puede no verse con microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, dado que el ácido del fondo puede suprimir su formación; sin embargo, éste no es ningún problem a si el medio se usa junto con KIA o TSI. b. Todos los microorganismos sembrados en LIA deben ser termentadores de la glucosa. 7. Medio para sulfuro-indol movilidad (SIM) a. Las reacciones del ácido sulfhídrico se intensifican por medio de los cultivos móviles (10). b. U n microorganismo productor de H2S puede exhibir ennegrecimiento en el medio SIM (posi tivo) pero no en el medio TSI (negativo) (3). c. El medio SIM es más sensible que el KIA, debido a su consistencia semisólida, a la carencia de hidratos de carbono para suprimir la formación de H2S y al uso de hierro peptonizado como indicador (25).

204

Pruebas bioquímicas individuales

8. Agares con xilosa-lisina a. Los períodos de incubación que excedan las 48 h pueden dar resultados falsos positivos; sin em bargo, la incubación durante 48 h aumenta la producción de centros negros a causa de la pro ducción de H2S. b. Salmonella serovar paratyphi A, S. choleraesuis, Salmonella serovar pullorum y Salmonella serovar gallinarum pueden formar colonias rojas sin H2S, lo que las hace similares a las especies de Shigella. c. Algunas especies de Proteus pueden desarrollar centros negros en XLD y raramente en XLBG. d. El H2S sólo se produce cuando existen condiciones alcalinas; por ejemplo, Salmonella, Citrobacter y Proteus por lo común son H2S negativos en XLD debido a la reación ácida producida por la fermentación de los hidratos de carbono. 9. Agar sulfuro-citrato de Christensen: la producción de H2S se observa en el fondo, como un cam bio de color al negro; sin embargo, los resultados de la producción de H2S pueden no estar de acuer do con los obtenidos en KIA/TSI.

B. Tiras de acetato de plomo 1. Algunos investigadores tratan las tiras de PbAc con glicerol para aumentar sus características hi groscópicas. ZoBell y Feltham (50) afirman que esta práctica no tiene utilidad real para mejorar la detección de H2S. 2. Los procedimientos con tiras de PbAc son 10 veces más sensibles que los procedimientos que in corporan el metal en el medio (50); el resultado en las tiras de PbAc puede ser positivo cuando la reacción en el fondo del KIA/TSI es negativa o sólo positiva débil. 3. El PbAc es tóxico para el desarrollo bacteriano y muestra una acción bacteriostática que inhibe la liberación de H 2S a partir de la peptona (50); por consiguiente, no permita que las tiras de PbAc toquen el caldo. 4. Al probar la producción de H2S entre especies de Brucella es esencial cambiar las tiras de PbAc diariamente. El período necesario para la producción también es importante (9). 5. Estudios realizados por Rodler y col. (35) con Escherichia coli demostraron que el color negro ob tenido con PbAc se debía a la interacción del indicador con mercaptanos producidos a partir de la cistina. Estos autores recomiendan usar sólo indicadores de H2S como las sales de hierro, que no reaccionan con los mercaptanos (35). 6. Las tiras de PbAc son sumamente sensibles y deben usarse siempre que las bacterias exhiban só lo vestigios de H2S en los medios de cultivo para la detección de H2S utilizados de rutina (25). 7. La desventaja del PbAc es que también puede inhibir el desarrollo de muchas bacterias con reque rimientos especiales de cultivo, específicamente las que pueden requerir un sistema detector de H2S más sensible (25). 8. La sensibilidad extrema de las tiras de PbAc hace posible fijar la tira de papel de filtro impregna da con el tapón de un tubo KIA o TSI sin incorporarla directamente en el medio (25).

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C APÍ TU LO

Prueba de indol

I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo para separar indol a partir del triptófano.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43-45) A. Ayudar a la diferenciación entre géneros 1. Separación de Escherichia coli (+) de los miembros de los géneros Klebsiella (variables, por lo co mún negativos; V - ) , Enterobacter (V - ) , Hafnia (-), Serraría (V - ) y una especie de Pantoea, P. agglomerans (—) (antes Enterobacter agglomerans) (30). 2. Cardiobacterium hominis (+ débiI) (antes grupo II D del CDC) de Eikenella corrodens (-), de es pecies de K ingella'(-) y de Suttonella indologenes (■-) (antes Kingella indologenes) (30). B. Ayudar en la diferenciación de especies junto con otras pruebas bioquímicas 1. Paenibacillus alvei (antes Bacillus alvei) (+) de otras especies de Bacilllus (por lo general -). 2. Escherichia coli (+), E. hermanii (+) y E. fergusonii (+) de E. vulneris (-) y E. blattae (-) (30). 3. Citrobacter freundii (-) de C. koseri (antes C. diversus) (+) y de C. amalonaticus y del biogmpo 1 (+). 4. Klebsiella oxytoca (+) y K. ornithinolytica (+) de otras especies de Klebsiella (V - ) (30). 5. Proteus vulgaris (+), P. inconstans (+), P. rettgeri (+) de otras especies de Proteus (-) (30). 6. Pasteurella dagmatis (+), P. dagmatis subesp. séptica (V+), Pasteurella multocida (+), P multocida subesp. gallicida (+) y P. multocida subesp. multocida (+), P. pneumotropica (+) de P. haemolytica ( -) y de Actinobaciüus ureae (antes Pasteurella ureae) (-)x(30). 7. Paenibacillus alvei (+) de las especies aisladas con mayor frecuencia P macerans (—) y P. polymgm (-). 8. Peptostreptococcus asaccharolyticus (+) y P. indolicus (+) de otra especies de Peptostreptococcus (-) que pueden causar infecciones humanas. 9. Propionibacterium acnés (+) de las especies de Propionibacterium ( -) aisladas con mayor fre cuencia. C. Prueba de indol en mancha 1. Junto con otras pruebas (ureasa y ornitina) subdivide Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae en biotipos (30, 51 )H . influenzae de los biotipos I, II, V y VII son indol positivos; los biotipos III, IV, VI y VIII son indol negativos. H. parainfluenzae de los biotipos IV, VI, VII y VIII son indol positivos; los biotipos I, II y III son indol negativos. Otras especies de Haemophilus son indol negativas, excepto H. paracuniculus (+). Según Welch y Ahlin (51) la prueba de indol en mancha por sí sola puede proporcionar la identificación presuntiva de H. influenzae en las mues tras de vías respiratorias, ya que las cepas del biotipo indol positivo II representan 40-70% de las cepas de H. influenzae encontradas en muestras respiratorias. 2. Junto con la sialidasa, a - y (J-glucosidasas y a-fru cto sid asa, diferencia entre los anaerobios con pigm ento negro (antes género B acteroides): Porphyromonas asaccharolyticus (+), P. endodontalis (+), P. gingivalis (+) y Prevotella interm edia (+) de Prevotella corporis (-), P. denticola ( -) , P. loescheii ( -) , P. m elaninogenica ( - ) y Porphyromonas levii (antes B acteroides levii) ( - ) (38).

Prueba de indol 207 III. BIOQUÍMICA El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolites indólicos principales: indol, escatol (metil indol) y ácido indolacético (IAA, indolacetato) (8, 22, 54). Las diversas enzimas intracelulares involucradas se denominan colectivamente “triptofanasa”, un término gene ral usado para designar el sistema completo de enzimas que median la producción de indol (22) por activi dad hidrolítica sobre el sustrato triptófano (23, 53). El principal intermediario en la degradación del triptó fano es el ácido indolpirúvico, a partir del cual puede formarse indol por desanimación y escatol por descarboxilación del IAA (22). La degradación del triptófano in vitro (54) se muestra a continuación.

H L-triptófano

H Indolacetaldehído

H Indolacético (IAA-indolacetato), incubación corta

Descarboxilación

H Escatol (metil indol), incubación larga Principales metabolites indólicos producidos. (Redibujado en forma abreviada de Yokoyama, M. T y Carison, J. R. (1974) Appl. Microbiol., 27, 546, con permiso de la Am erican Society for Microbiology.)

La triptofanasa cataliza la reacción de desaminación (12) atacando la molécula de triptófano sólo en su cadena lateral y dejando el anillo aromático intacto como indol (9). O

c h 2— c h — c o o h

+ CH3 — C— COOH + NH3

nh2

H L-Triptófano

Triptofanasa H20 Desaminación

> Indol

Ácido pirúvico

Amoníaco

208

Pruebas bioquímicas individuales

La desaminación y la hidrólisis tienen lugar con el agregado Je una molécula de agua en presencia de la triptofanasa y de la coenzima fosfato de piridoxal (9). En la desaminación, la porción amina (NH2) del aminoácido es eliminada, con liberación de una molécula de amoníaco. Existen dos tipos de desamina ción: oxidativa y reductiva. La desaminación oxidativa separa el grupo NH2 de un aminoácido y agrega un enlace doble al producto desaminado (un compuesto no saturado) y de NH3 y energía (9). R— C — COOH

I nh

Desaminación oxidativa *1/20 2

Aminoácido

R— C — COOH + NH3 +

Energía

II O Cetoácido

El desaminación del triptófano es reductiva; la NH2 es separada y liberada como NH3 y energía, la cual es utilizada por la bacteria. La degradación del triptófano libera indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía. El ácido pirúvico puede metabolizarse más a través del ciclo glucolítico o ingresando al ciclo de Krebs pa ra liberar C 0 2, H20 y una gran cantidad de energía. El NH3 puede usarse para sintetizar nuevos aminoáci dos usando la energía presente para la reacción anabólica. El indol liberado de la molécula de triptófano pue de detectarse por medio de un reactivo que involucra una combinación química que produce un color definido. La presencia o la ausencia de formación de indol se usan para la identificación bacteriana.

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS A. Caldo triptófano o peptona 1. Ingredientes a. Medio basal: la mayoría de las peptonas, de los digeridos pancreáticos de caldo de caseína (triptona) o de los hidrolizados enzimáticos de caseína disponibles en el comercio contienen sufi ciente triptófano para la determinación de indol (4). P ep to n a de caseín a (un fragm ento p ro teico ) C lo ru ro de sodio, N aC l A g u a d esio n izad a

10 g 5 g 1.000 m L

b. Triptófano: variable, puede incorporarse en una concentración del 1% en el caldo peptona. 2. Método de preparación a. Pesar con precisión la cantidad que se indica en la etiqueta. Los productos de diferentes com pañías pueden variar ligeramente. b. Rehidratar con agua destilada o desionizada. c. Calentar suavemente la disolución. d. Distribuir alreededor de 4 mL por tubo. 3. Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. 4. Enfriar antes del uso y refrigerar para la conservación (4-10°C). 5. Inoculación a. Inoculo liviano (16). b. Desarrollo proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h: agar con hierro de Kligler (KIA). 6. Incubación: 35°C; 24 a 48 h. 7. Agregar el reactivo de Kovacs o de Ehrlich directamente al tubo incubado antes de intentar una interpretación.

B. Medio de caseína 1. Puede prepararse un digerido pancreático de solución de caseína si no se dispone del medio comercial, a. Ingredientes D ig erid o pan creático de caseína C lo ru ro de sodio, N aC l A g u a d esio n izad a

b. Método de preparación (1) Disolver por calor moderado. (2) Distribuir 4 mL en cada tubo.

2 g 0,5 g 100 m L

Prueba de indol 209 c. Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. d. Proceder como con el medio comercial. 2. La caseína contiene 1,2 g de triptófano por 100 g (10).

V. REACTIVOS USADOS (Nota: La opción entre el reactivo de Ehrlich o el de Kovacs es según la preferencia del laboratorio; sin embargo, el reactivo de Ehrlich es más sensible y se prefiere para probar bacilos no fermentadores o anaerobios con producción de indol mínima (30).) A. Prueba de indol de Ehrlich (2, 44) 1. Ingredientes; una solución coloreada estable a la luz a temperatura ambiente (22-25°C) cuando se conserva en un frasco de vidrio color caramelo p -D im etilam in o b en zald eh íd o (D M A B A ) A lco h o l etílico (absoluto) HC1 (concentrado)

95 mL 20 mL

2. Método de uso a. Agregar 1 mL de éter (4, 52) o xileno (4) a un tubo de caldo incubado durante 24 o 48 h; estos solventes extraen y concentran el indol. No exceder la cantidad recomendada de solvente; in cluso una dilución mínima puede disminuir la concentración de indol por debajo del límite de sensibilidad. b. A gitar bien. c. Esperar que el éter suba a la superficie del medio. d. Suavemente agregar 0,5 mL del reactivo de Ehrlich al tubo, inclinando el tubo para que el reac tivo se deslice por la pared hacia abajo. B. Prueba de indol de Kovacs (4, 7, 31) 1. Ingredientes: solución pálida; conservar en un frasco de vidrio color caramelo. A lco h o l am ílico o iso am ílico puro (pu ed e sustituirse p o r alcohol butílico) p -D im etilam in o b en zald eh íd o (D M A B A ) HC1 (co n centrado)

150 m L 10 g 50 m L

2. Método de preparación a. Disolver el aldehido en el alcohol; puede ser necesario calentar con suavidad para disolver. b. Agregar lentamente el ácido a la mezcla de aldehido-alcohol. 3. Método de uso a. Agregar 5 gotas del reactivo de Kovacs directamente a un tubo incubado durante 24 o 48 h. b. Agitar el tubo con suavidad. G adebusch y G abriel (20) inform aron que el reem plazo por alcohol isoam ílico hace más estable el reactivo de Kovacs. Con cualquier reactivo, para disolver el aldehido en el solvente puede ser n e cesario calentar suavemente en un baño de agua a 50-60°C. Para realizar la prueba de indol, Ew ing y Davis (17) recom iendan el reactivo de Kovacs; el reactivo de Ehrlich se usa con no ferm entadores com o Flavobacterium (28) y con anaerobios (24). Los reactivos no son colorantes ni tinciones, p e ro por hidrólisis son reactivos acoplados que se condensan para form ar un crom óforo (32). C. Con cualquier reactivo, si se usa un tubo incubado durante 24 h para la producción de indol, se reco mienda separar asépticamente una alícuota de 2 mL para la prueba. 1. Una reacción positiva después de 24 h denota una prueba completada. 2. Si a las 24 h el cultivo es negativo, debe incubarse 24 h adicionales y luego repetirse la prueba. D. Control de calidad: cualquier reactivo debe probarse con cultivos positivos y negativos conocidos an tes de ponerse en uso. E. Conservación: guardar ambos reactivos en un refrigerador (4°C) cuando no están en uso. Su estabili dad varía; por consiguiente, cada semana se les debe hacer un control de calidad y se deben descartar si muestran una reacción negativa o positiva débil con un microorganismo positivo conocido.

210

Pruebas bioquímicas individuales

F. Química de acción del reactivo: el indol, si está presente, se combina con producción de color en la capa del alcohol (10). Esta reacción ocurre por un proceso de condensación formado por la degrada ción ácida de la proteína (19). La reacción ocurre sin calentar si el reactivo se ha preparado con HC1 concentrado. CHO HCl alcohol

condensación en caliente

Color rojo-violeta

p-Dimetilaminobenzaldehído (DMAB, DMABA)

El indol es volátil, en tanto que el a-m etil indol no lo es, y tanto el calor como el ácido demuestran el indol volátil (6). La reacción de color se basa en la estructura pirrol presente en el indol.

La estructura pirrol puede reaccionar en sus formas tautoméricas (cuando está en solución, algunas de las moléculas se reordenan de modo que hay dos formas presentes) (40). h 2c

ch2

CH N

Formas tautoméricas del pirrol

Los grupos CH2 de ambas formas de pirrol permiten la condensación con el aldehido en un procedi miento en dos pasos (19).

(

(2)

Compuesto quinónico rojo-violeta

Prueba de indol 211

U naquinona Q:

o o una estructura de tipo quinona es un compuesto importante productor de

color (40). Los pasos 1 y 2 de la reacción ocurren inmediatamente con el DMABA en HC1 concentrado (19). Los derivados del pirrol muestran las mismas reacciones de condensación siempre y cuando tengan un grupo CH intacto en la posición a o (3 con relación al grupo NH cíclico (19). La capa alcohólica extrae y concentra el complejo de color rojo. Este complejo es soluble en éter etílico, alcohol etílico, alcohol isoamllico, alcohol amílico o alcohol butílico.

VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD Rutina

1. Positivo {+) Escherichia coli 2. Negativo (-)

ATCC 25922 ATCC 23355 ATCC 27853

Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa

B. Medio indol-nitrito Cepa Pasteurella multocida Clostridium petfringens Clostridium sordellii

ATCC 6529 13124 9714

Indol + +

Nitrato + +

Medio movilidad-indol-omitina (MIO)

Cepa Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

ATCC 25922 13048

Movilidad + +

Indol + -

Ornitina + +

13883

—

Vil. RESULTADOS Véase figura 16-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII.

INTERPRETACIÓN: AMBOS REACTIVOS

A. Positivo (+): en segundos, aparece un anillo rojo (fucsia brillante) en la interfase del medio con la por ción inferior de la fase alcohólica, sobre el medio. B. Negativo (-): no hay ningún desarrollo de color en la capa de alcohol o aparece un anillo turbio; toma el color del reactivo de Kovacs o de Ehrlich (amarillo). C. Variable (±): un color anaranjado en la superficie del medio, debido al escatol, un compuesto m edia do que puede ser un precursor de la formación de indol (23).

IX. A.

PRUEBAS RÁPIDAS Prueba de indol en mancha 1. Método de Vracko y Sherris (49). 2. Caracterización presuntiva de E. cotí, determinación rápida de especies de Proteus a partir de pla cas de aislamiento primario (2). 3. Reactivos; selección a. Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehído (DMABA) (1) Fabricante: Eastman Organic Chemicals (véase Apéndice 11). (2) Solución al 5% en alcohol amílico acidificado (3 mL de alcohol amílico en 1 mL de HC1 concentrado). b. p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA) (1) Solución al 1 % en HC1 concentrado al 10% (v/v).

212

Pruebas bioquímicas individuales (2) Preparar nuevamente cada 4 meses.

(3) Detecta 6-12 ¡j.g de indol por mL (34). (4) Es el reactivo más estable y más económico, c. p-Dimetilaminocinamaldehído (DMACA, PACA) (1) Análogo vinílico del DMABA (34, 49). (2) Fabricante: Aldrich Chemical Company (véase Apéndice 11). (3) Solución al 0,1% en HC1 concentrado al 10% (v/v). (4) Preparar nuevamente cada 2 meses. (5) Detecta 3 pg de indol por mL (34). (6) Es el reactivo más sensible. 4. Inoculo: cultivo puro de 18 a 24 h, agar con sangre de oveja (SBA); preferible si está disponible: agar sangre tripticasa soja, con 5 % de sangre de oveja (33, 47). 5. Procedimiento a. Papel de filtro W hatman No. 1 (9 cm) (1) Colocar en la tapa de la placa de Petri. (2) Humedecer con 1-1,5 mL del reactivo de Kovacs (u otro de los reactivos enumerados an tes). b. Disperse el inoculo (pasta celular) sobre el papel de filtro humedecido. Pueden realizarse mu chas pruebas en un solo papel de filtro. 6. Interpretación a. Positivo (+) (47) (1) Reactivo de Kovacs (a) Color castaño a castaño roji*zo o rojo. (b) 1-3 min. (2) DMABA (a) Color rosa a rojo. (b) 1-3 min. (3) DMACA (a) Color azul o verde. (b) En unos segundos. B. Prueba de indol en mancha para bacterias anaerobias (4, 47) 1. Usar el mismo procedimiento que para la pmeba en mancha de Vracko y Sherris (49), con la excepción del reactivo; usar DMACA al 1% en HC1 concentrado al 10% (v/v); guardar en botella oscura. 2. Interpretación a. Positivo (+): formación inmediata de un color azul alrededor del desarrollo. b. Negativo (-): ningún cambio de color o un color rosado. c. E l desarrollo de color tardío debe ignorarse. C. Micro técnica para indol 1. Método de Arnold y Weaver (1). 2. M edios de cultivo: dos opciones a. Caldo 1 Triptona Extracto de carne

1% 0,3%

b. Caldo 2 Triptófano Peptona Fosfato dipotásico, K2HP04

0,03% 0,1% 0,5%

c. pH óptimo para la producción de indol, 7,4-7,8. d. Distribuir alícuotas del caldo de 1 mL en tubos de ensayo pequeños (10 x 7 5 mm). (1) La esterilidad no es necesaria (1). (2) Los tapones no son necesarios. 3. Reactivo: reactivo de Kovacs a. Debe ser fresco. b. El mejor solvente: alcohol isoamílico. 4. Procedimiento

Prueba de indol 213 a. Precalentar los tubos con caldo; requisito absoluto. (1) En baño de agua, 37°C. (2) Acorta el tiempo requerido para la producción de indol (1). b. Inoculo abundante (1) (1) Preferido: proveniente de agar o caldo triptona. (2) Alternativa: cualquier medio con triptófano o medios sintéticos que contienen triptófano. c. Agregar 4 gotas del reactivo de Kovacs fresco. 5. Incubación, preferida: en baño de agua, 37°C, 6 min-2 h. 6. Interpretación a. Positivo (+): color rosa a rojo en la capa de alcohol. b. Negativo (-): ningún cambio de color; el medio permanece de color amarillo pálido.

X. A.

PRUEBAS MÚLTIPLES

______________

Medio indol-nitrito (caldo tripticasa nitrato) 1. Ayuda al desarrollo de aerobios y anaerobios facultativos y obligados. 2. Los diferencia por la capacidad de reducir nitratos y/o producir indol. 3. Ingredientes, pH 7,2 ± 0,2 P ep to n a de caseína G lu co sa (dextrosa) F o sfato disódico, N a 2H P 0 4 N itrato de potasio, K N 0 3 A g ar A g u a d esionizada

4. 5. 6. 7.

20 g 1g 2g lg 1g 1.000 m L

Distribuir 5 mL por tubo (13 x 100 mm). Esterilización: 118-121°C, 15 Ib, 15 min. Inoculo: cultivo puro de 18 a 24 h; por ejemplo, agar con sangre. Interpretación a. Indol: cualquier reactivo, Kóvacs o Ehrlich; igual que para las pruebas de rutina. b. Nitratos: véase capítulo 30, Pmebas de reducción de nitratos/nitritQs —

B. Movilidad-indol-lisina (MIL)/con sulfuro (MILS) 1. Prueba en un tubo de Reller y Mirrett (45). 2. Identificación de miembros de la familia Enterobacteriaceae en muestras fecales (14). 3. Procedimiento: véase capítulo 28, Prueba de movilidad. C. Medio para movilidad-indol-ornitina (MIO) 1. Fórmula de Ederer y Clark (13) y Oberhofer y Hajkowski (41) 2. Diferenciación de miembros de la familia Enterobacteriaceae (véase cap. 28, Prueba de movilidad). D. Medio para sulfuro-indol-movilidad (SIM): véase capítulo 15, Prueba de ácido sulfhídrico.

XI. A.

PRECAUCIONES

_________________________

Generales 1. Cuando se usa caldo peptona en lugar de caldo con triptófano para la prueba de indol, el medio de be probarse con un microorganismo productor de indol conocido. Esto determina si la peptona es adecuada para la producción de indol y también establece el período de incubación óptimo reque rido (48). Existen diferentes lotes y variedades comerciales de medios de cultivo con peptona en el mercado y algunos no son adecuados para la producción de indol porque contienen demasiado poco triptófano. 2. Los medios con peptona que contienen glucosa no deben usarse para la detección de indol. La formación de indol sólo ocurre con los microorganismos capaces de fermentar los hidratos de car bono. Los microorganismos que usan oxidativamente los hidratos de carbono no pueden producir indol (26). La alta acidez producida por la fermentación de la glucosa puede impedir el desarrollo del microorganismo (5) o inhibir la enzima (15). El agregado de triptófano estimula la producción de indol, mientras la glucosa inhibe su producción (11, 18, 54). 3. Algunos microorganismosuTorman indol, pero lo degradan tan rápidamente como lo producen; por consiguiente, puede haber una reacción falsa negativa (44). Esto ocurre principalmente con algu nas especies de Clostridium (44).

214

Pruebas bioquímicas individuales

4. El pH óptimo para la actividad de la triptofanasa es ligeramente alcalino (pH 7,4-7,8); una dismi nución en el pH (hacia la acidez) disminuye la producción de indol (50) y puede dar un resultado falso negativo o positivo débil. 5. Los cultivos a probar para la producción de indol deben incubarse en aerobiosis. La tensión de oxí geno disminuida reduce la producción de indol (18, 22). 6. La capacidad de un microorganismo para producir indol interfiere con la actividad antimicrobia na, ya sea por medios químicos o genéticos (29). Klein y col. (29) demostraron que, en el caso de Klebsiella, las cepas productoras de indol son frecuentes en muestras clínicas, y estos microorga nismos son más susceptibles a la acción de los antibióticos que los no productores de indol. M ar tin y col. (36) informaron resultados similares. 7. Según M üller (39), la positividad para indol se pierde por incubación prolongada; sin embargo, es tudios realizados por Pickett (42) no mostraron ninguna pérdida después de 96 h de incubación. 8. La diferenciación entre C. hominis, especies de Kingella, E. corrodens y S. indolo genes requiere una siembra abundante en caldo triptona, incubación durante 48 h y extracción con xileno o clo roformo usando el reactivo de Ehrlich (30). 9. Comámonos acidovorans (antes Pseudomonas acidovonm s) produce una reacción peculiar de in dol de color “naranja calabaza” debido a la formación de ácido antranílico en lugar de indol a par tir del triptófano (35). 10. Pueden requerirse modificaciones menores al hacer la prueba de producción de indol por ciertos no fermentadores positivos débiles; se necesita un medio enriquecido, como el caldo infusión de corazón (30). 11. Según Maslow y col. (37), la diferenciación de especies de Klebsiella solamente sobre la base de la actividad de la triptofanasa puede ser poco confiable; la diferenciación es clonal (37). El operón de la triptofanasa de las especies de Klebsiella no ha sido analizado formalmente (37).

B. Reactivos de Ehrlich y Kovacs 1. Los reactivos de Kovacs y Ehrlich no son específicos para el indol. El a-m etil indol (ácido indolacético) también se produce a partir del triptófano y reacciona con el reactivo dando un color ro jo. Isenberg y Sundheim (27) encontraron que el reactivo del indol reacciona con 17 compuestos de indol diferentes dando color rojo; sin embargo, usando un solvente (p. ej., xileno, éter o cloro formo) para extraer primero el indol, el color rojo se obtiene en la capa de solvente sólo con el in dol y el escatol (5-metil indol). Indol + escatol (5-metil indol) + reactivo de prueba-------- > Color rosa

2. Se debe tener cuidado de agregar sólo una pequeña cantidad de extractante; incluso una dilución mínima puede disminuir la concentración de indol por debajo de la sensibilidad de detección de cualquier reactivo (30). 3. Debido a que el indol es soluble en compuestos orgánicos, debe agregarse xileno o cloroformo al medio de prueba antes de agregar el reactivo de Ehrlich (30); el paso de extracción es menos crí tico con el reactivo de Kovacs porque se usa alcohol amílico como diluyente (30). 4. Usar el reactivo de Kovacs sin agitar el tubo es el método de elección (42). 5. Hemo-De (PMP M edical Industries) y Shandon (Shandon Inc.) son solventes a base de terpenos y son extractantes menos tóxicos; pueden usarse estos sustitutos del xileno, aunque son menos efi caces. En casos dudosos debe usarse xileno (21). Debido a su acción bloqueante, el uso de indolnitrato no puede recomendarse (21). Hemo-De es un sustituto satisfactorio del xileno en la m odi ficación de Happold y Hoyle (22) de la prueba de indol de Ehrlich. 6. El reactivo de Kovacs debe ser fresco; sin embargo, puede guardarse varios días en un refrigera dor (4-10°C). Si se deja a temperatura ambiente durante cierto tiempo, el color cambia de amari llo pálido al marrón y disminuye su sensibilidad (1). Ambos reactivos deben guardarse en botellas color caramelo con tapones de vidrio.

C. Prueba de indol en mancha 1. Puede haber reacciones falsas positivas débiles con la prueba en mancha si el inoculo es un culti vo mixto de microorganismos indol positivos y negativos. Debe obtenerse un cultivo puro. Usar una sola colonia bien aislada para hacer la prueba. Asimismo, los inóculos deben cultivarse en un medio que estimule la producción de indol, un medio con triptona o triptófano. Dado que el indol

Prueba de ¡ndol 215 producido por las colonias adyacentes puede difundir en el medio y producir resultados falsos po sitivos, las colonias de prueba deben estar separadas por lo menos 5 mm (25). El agar de MacConkey (MAC) o el agar eosina-azul de metileno (EMB) no son aceptables, ya que contienen indicadores de pH que podrían producir traslado del color hacia el papel de filtro humedecido e interpretaciones falsas positivas (25); se prefieren las placas de agar con sangre (30). La prueba de indol en mancha también se realiza mejor con colonias que crecen en agar con san gre, dado que la pigmentación de las colonias lactosa positivas en el MAC hará difícil la interpre tación de una reacción de color (30). Sin embargo, el medio debe contener bastante triptófano pa ra iniciar la positividad del indol (3); las placas de agar con sangre incubadas durante 1 día pueden dar resultados falsos negativos (42). 2. El reactivo de indol para la prueba en mancha puede no ser lo suficientemente sensible para las bacterias indol positivas débiles, como C. hominis y Suttonella indologenes (30). 3. El PACA es más sensible que el reactivo de Kovacs (30) 4. Ciertas cepas de Proteus vulgaris, Providencia y Aeromonas darán un resultado falso negativo en las pruebas en mancha para indol (6).

D. Medio de indol-nitrito 1. El medio puede usarse para las pruebas de nitritos con los miembros de la familia Enterobacteriaceae, pero no se recomienda para la prueba de indol con microorganismos que reducen los nitra tos a nitritos, lo que impide la detección de indol (46). Los nitritos presentes en el medio pueden bloquear la detección de indol (46). 2. Si el medio tiene más de 2 días, hervir inmediatamente antes del uso durante 2 min y enfriar sin agitar (43).

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CAPÍ TULO

Pruebas de hidrólisis de sustratos indoxílicos I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de esterasas bacterianas específicas para hidrolizar sustratos indoxílicos es pecíficos a un colorante índigo, con el resultante color azul oscuro.

II. OBJETIVO (Véase también cap. 43) A. Hidrólisis del acetato de indoxilo (IA): prueba rápida y diferencial selectiva para distinguir entre un número limitado de especies de Campylobacter y ex Campylobacter y las especies de los géneros re lacionados Helicobacter y Wolinella (1): C. jejuni (+), C. coli (+), C. upsaliensis (+), Arcobacter cryaerophila (+), H elicobacter fennelliae (+) y H. cinaedi (variable, V, por lo general - ) de otras espe cies de Campylobacter ( -) (6, 11, 15), microorganismos similares a Campylobacter (CLOs) (-), Helicobacter pylori ( -) y Wolinella succinogenes (-) (15). 1. Distinguir Helicobacter cinaedi (-) (antes en el género Campylobacter) de Campylobacter upsa liensis (+) (6), en especial las variantes de C. upsaliensis (+) que no desarrollan a 42°C (14). 2. Distinguir Campylobacter lardi (-) (antes C. laridis) de C. jejuni (+) y C. coli (+) (8,15). 3. Distinguir Helicobacter cinaedi (-) de Campylobacter fennelliae (+) (15). 4. Distinguir Helicobacter pylori (-) de H. mustelae (+) (15). 5. Distinguir Wolinella succinogenes ( -) de W. recta (+) y W. curva (+) (15). B. Hidrólisis del sulfato de indoxilo (IS): identificación de Providencia stuartii (+) y Klebsiella pneu moniae (+) (3). C. Hidrólisis del butirato de indoxilo (IB) (hidrólisis de la tributirina) 1. Diferenciación rápida de especies que anteriormente pertenecían al género Branhamella, Moraxella catarrhalis (+), M. caviae (+) y M. ovis (+) de otros cocos gramnegativos oxidasa positivos (-)(2). 2. Otras bacterias que pueden ser positivas para la hidrólisis son Pseudomonas aeruginosa (+) y Staphylococcus aureus (V, por lo común +) (2). D. Hidrólisis del indoxil-(3-D-glucurónido (IBDG): detección directa e identificación rápida de Esche richia coli en orina y en muestras del medio ambiente y por tecnología de placas replicadas (4, 9,18).

III. BIOQUÍMICA El indoxilo es un producto de la descomposición putrefactiva del triptófano en el intestino humano por acción bacteriana (13). Es un compuesto heterocíclico con un anillo de 5 componentes unido a un anillo benceno. Las hidrolasas bacterianas liberan indoxilo a partir de acetato, sulfato, butirato P y D-glucurónido (15). En presencia de aire ( 0 2) y álcali, el indoxilo se hidroliza espontáneamente para formar el índigo blanco, y en un medio ácido, índigo (3). El índigo blanco y el índigo (índigo azul) producen un color azul oscu ro que indica que el compuesto indoxílico fue metabolizado.

218

Pruebas bioquímicas individuales Hidrólisis de sustratos indoxílicos (3, 5,10,15) nh2

I c h 2— c

—

cooh

H L-Triptótano

I Indol

Colorantes de índigo (ásteres de indoxilo)

Especies de Campylobacter

Providencia stuartii Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

C o CHi'C00HCo Acetato de indoxilo (IA)

0-S03H

Sulfato de indoxilo (IS)

Escherichia coli

Moraxella catarrhalis

C O -O C C 3 H

Butlrato d e Indoxilo (IB)

’ CO

■ C 00H (C H 0H ) 4 C H 0

Indocll-p-D-glucurónido (IBDG)

I Hidrólisis | Hidrolasas bacterianas

índigo (índigo azul)

Pruebas de hidrólisis de sustratos indoxílicos 219 El cromóforo exacto es dudoso; las cetonas (C = 0) en un anillo cerrado a menudo se encuentran en los colorantes. El índigo se considera con propiedades cromóforas (10). Dealler y col. (3) demostraron que todas las bacterias que tenían actividad de indoxil sulfatasa tam bién tenían actividad de indoxil fosfatasa, lo que sugiere que la misma enzima hidroliza los dos sustratos. El pH óptimo es 5,1 para ambas actividades (3). Las esterasas rom pen las uniones éster entre los grupos del sustrato y las moléculas portadoras (2). La pérdida de una parte del sustrato libera indoxilo, que reacciona espontáneamente para producir índi go azul e indirrubina (6). Los compuestos coloreados índigo blanco, índigo e indirrubina (índigo rojo) son visibles a concentraciones muy bajas, lo cual hace que las pruebas sean sensibles y rápidas.

IV. PROCEDIMIENTOS/RESULTADOS A.

Hidrólisis del acetato de indoxilo (IA) (IAH) 1. Método de Mills y G hem a (11). 2. Reactivo a. Acetato de indoxilo: Sigma Chemical Co. (véase Apéndice 11). b. Solución: al 10% (p/v) de acetato de indoxilo en acetona; 1 g de indoxilo en 10 mL de acetona. 3. Preparación del disco diferencial a. Discos: 0,64 cm (0,25 pulgadas) de diámetro. (1) Disponibles en el comercio. (a) American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA (véase Apéndice 11). (b) Centers for Disease Control (CDC). b. Impregnación de los discos; dos métodos (1) Método 1: colocar los discos estériles sobre una superficie seca y agregar 0,5 m L (50 juL) por disco. Secar al aire protegidos de la luz directa. (2) Método 2 (a) Colocar 100 discos estériles sin impregnar en una botella oscura que contenga 0,25 g de acetato de indoxilo disueltos en 2,5 mL de acetona. (b) Distribuir los discos saturados en una placa de Petri de vidrio y secar al aire protegidos de la luz directa. c. La fecha de vencim iento es a los 6-8 m eses si se guardan en un frasco color caram elo her m éticam ente cerrado, protegidos de la luz, bajo un desecante (gel de sílice), a 4°C (refrige rador) (6). On y Holmes (12) dem ostraron que los discos im pregnados con 25 p L de sustra to eran más confiables que los im pregnados con 50 liL . M ills y Gherna (11) dem ostraron que todas las cepas que hidrolizan el acetato de indoxilo lo hacen independientem ente del m edio de cultivo usado. 4. Inóculos a. Cultivos puros de los microorganismos que se prueban; inóculos provenientes de agar infusión de corazón complementado con 5% de sangre de conejo desfibrinada (HIA-RB) incubado a 36°C, en 5% CO , durante 18-24 h. b. Inóculos abundantes (6). 5. Procedimientos; tres opciones a. Método 1 (1) Colonias de especies de Campylobacter untadas en un disco. (2) Humedecer cada disco con una gota de agua destilada estéril. (3) Resultados a temperatura ambiente (22-25°C) (11) (a) Positivo (+) 1. Color azul oscuro a los 5-10 min; positivo débil (+w) un color azul más pálido en 10-30 min (15). 2. Hidrólisis. (b) Negativo (-): ningún cambio de color dentro de los 20 min; ninguna hidrólisis. b. Método 2 (en tubo) (1) Suspenderlas colonias en 0,3 mL de agua destilada estéril; tubo de vidrio de 13 x 100 mm. (2) Agregar el disco a la suspensión. (3) Resultados a temperatura ambiente (22-25°C) (a) Positivo (+)

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Pruebas bioquímicas individuales 1. Color azul oscuro dentro de los 10-15 min (11), positivo débil (+w) un azul más pá lido en 10-45 min. 2. Hidrólisis. (b) Negativo (-): ningún cambio de color; ninguna hidrólisis, c. Método 3 (6) (1) Discos impregnados con acetato de indoxilo; 0,25 g disueltos en 2,5 mL de acetona. (2) Colocar los discos en un portaobjeto de vidrio y humedecer con 1-2 gotas de agua destila da estéril. (3) Untar las colonias sobre el disco. (4) Resultados a temperatura ambiente (22-25°C) (a) Positivo (+): tono azulado en 1 min; el color se intensifica estando en reposo hasta los 20 min. (b) Negativo (-): ningún cambio de color dentro de los 20 min.

B. Hidrólisis del sulfato de indoxilo (IS) 1. Determinada en el síndrome de la bolsa púrpura (PUBS), en el que la bolsa unida al catéter urina rio de un paciente toma color púrpura en un período de horas o días después de la cateterización (1, 17). La identidad química es desconocida, pero se ha sugerido que es una mezcla de índigo e indirrubina, aunque la indirrubina no se ha identificado específicamente (16). 2. Los placas de agar base sangre com plem entadas con sulfato de indoxilo 7,9 mM (3); Sigma Chem ical Co. 3. Siembra por estría en cuatro cuadrantes del microorganismo de prueba para obtener aislamiento máximo. 4. Incubación: 35°C, 48 h. 5. Positivo (+): colonias de un color azul profundo; hidrólisis.

C. Hidrólisis del butirato de indoxilo (IB) 1. Tiras de butirato de indoxilo a. Butylase Lab M. Co., Bury, Inglaterra. b. Guardar en bolsa de plástico cerrada a 4°C con desecante; fecha de vencimiento a los 4 meses (2). 2. Inóculos a. Medio de desarrollo: agar chocolate, agar nutriente o placa de agar sangre. b. Cultivo puro. c. Incubación: 35°C, 14-18 h, 5% C 0 2. 3. Procedimiento a. Untar suficiente cultivo puro sobre la tira de papel de filtro como para que sea visible. b. Humedecer la tira con 10 pL de agua a temperatura ambiente (22-25°C). Los estudios no mos traron ninguna diferencia entre m ojar con agua del grifo, agua destilada estéril, buffer Tris (pH 7,5) o solución fisiológica al 0,9% (2). Dejar a temperatura ambiente. c. Positivo (+): color azul-verde en el sitio del inoculo dentro de los 2,5 min (2). D. Hidrólisis del indoxil-P-D-glucurónido (IBDG) (4) 1. D iferenciación de ferm entadores de la lactosa, no ferm entadores de la lactosa y de E. coli IBD G positiva (4); visualización inm ediata y detección de E. coli en placas de aislam iento prim ario. 2. Agar de MacConkey (MAC) complementadas con 0,8 g IBDG/L (agar MAC-IBDG). 3. Con ansa calibrada, inocular la placa con 0,01 mL de orina; método de estría en cuatro cuadrantes con ansa. 4. Incubar 35°C, 18 h. 5. Positivo (+) a. Colonias de color azul-negro profundo. b. E. coli.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD_____________ [Nota'. Hacer un control de calidad cuando se preparan los discos y después mensualmente.)

A cetato de indoxilo 1. Positivo {+)'. Campylobacter jejuni 2. Negativo (-): una gota de agua sobre el disco

ATCC 29428

Pruebas de hidrólisis de sustratos ¡ndoxílicos 221 B. Sulfato de indoxilo 1. Positivo (+): Providencia stuartii 2. Negativo (—): Escherichia coli

ATCC 29914 ATCC 25922

C. Butirato de indoxilo 1. Positivo (+): Moraxella catarrhalis 2. Negativo (—): Neisseria lactamica

ATCC 11020 ATCC 23970

D. P-D-glucurónido 1. Positivo (+): Escherichia coli 2. Negativo (—) Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

ATCC 25922 ATCC 10031

VI - RESULTADOS V éanse figuras 17-1 y 17-2 (Apéndice 1) p ara los resultados fotográficos en color.

Vil. PRECAUCIONES A. Acetato de indoxilo 1. Los discos recién preparados son blancos. Por almacenamiento prolongado (hasta 1 año), los dis cos cambian de color (púrpura pálido) (6). Desechar todos los discos con cambios de color.

B. Butirato de indoxilo 1. Si el recipiente frío se abre y se cierra con frecuencia, las ti ras pueden tener un cambio de color al rosa pálido, causado por la condensación de agua (2). 2. D ealler y col. (2) dem ostraron que los resultados positivos con A cinetobacter lwoffii, un microoorganism o oxidasa negativo, y con M oraxella lacunata, un cocobacilo gram negativo raro que form a colonias transparentes, no causan ningún problem a en la identificación de M. catarr halis con tiras. C. Indoxilo-P-D-glucurónido 1. La actividad de la P-glucuronidasa se lim ita a los géneros Escherichia, Shigella y Salmonella (7), que deben diferenciarse fácilmente por la capacidad de fermentar la lactosa. Las especies de Shi gella y Salmonella raramente se encuentran en la orina y también pueden diferenciarse por la prue ba ONPG y por la prueba de indol en mancha (7). 2. Delisle y Ley (4) demostraron que E. coli 0157:H7 no hidroliza el IBDG.

REFERENCIAS 1. Barlow GB, Dickson JAS. Purple urine bags. Lan cet 1978;i:220-221. 2. Dealler SF, Abbotl M, Croughan MJ, Hawkey PM. Identification of Branhamella catarrhalis in 2.5 min with an indoxyl butyrate strip test. J Clin Microbiol 1989;27(6):1390-1391. 3. Dealler SF, Hawkey PM, Millar MR. Enzymatic de gradation of urinary indoxyl sulfate by Providencia stuartii and Klebsiella neumoniae causes the purple bag syndrome. J Clin Microbiol 1988;26(10):21522156. 4. Delisle GJ, Ley A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic P-glucuronidase assay. J Clin Microbiol 1989;27 (4):778779. 5. Guibault GG, Kramer DN. Resorufin butyrate and indoxyl acetate as fluorigenic substrates for choli nesterase. Anal Chem 1965;37:120-123. 6. Hodge DS, Borczyk A, Wat L-L. Evaluation of the indoxyl acetate hydrolysis test for the differentia tion of Campylobacters. J Clin Microbiol 1990;

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222

Pruebas bioquímicas individuales

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CAPÍ TULO * %

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato de carbono específico incorpo rado en un medio de desarrollo basal, con producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la posible producción de ácido sulfhídrico (H2S).

II. OBJETIVO

_______________

(Véase también cap. 45) (Nota: Un asterisco delante del nombre de un microorganismo indica reacciones variables. Los mi croorganismos en negrita son los encontrados con mayor frecuencia en la reacción KIA/TSI específica mecionada. Para más detalles sobre un microorganismo particular (p. ej., clasificación anterior, microor ganismo humano o del medio ambiente) véanse los cuadros del capítulo 45 sobre esquemas de identifi cación de la familia Enterobacteriaceae y de bacterias intestinales.) A. La producción de H2S y/o los patrones de fermentación por lo general son característicos de grupos bacte rianos específicos, géneros o especies, sobre todo entre los miembros de la famiha Enterobacteriaceae (5,9). 1. Ácido/ácido, con/sin gas a. KIA/TSI Budvicia aquatica Buttiauxella agrestis * Cedecea davisae * Cedecea lapageri * Cedecea neteri * Especies de Citrobacter *

G ru po en térico 64

Enterobacter aerogenes * Enterobacter amnigenus de los b iog rup os 1 y * Enterobacter asburiae Enterobacter cloacae * Enterobacter dissolvens * Enterobacter gergoviae Enterobacter intermedius Enterobacter nimipressuralis Enterobacter sakazakii Escherichia coli * Escherichia coli inactivo * Escherichia hermannii Escherichia vulneris Ewingella americana Klebsiella omithinolytica Klebsiella oxyíoca Klebsiella planticola * Klebsiella pneumoniae subesp. ozaenae Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae Klebsiella terrigena Especies de Kluyvera

224

Pruebas bioquímicas individuales Leclerica adecarboxylata Moellerella wisconsensis Pantoea agglomerans Plesiomonas shigelloides de los b iog rup os Rahnella aquatilis * Serrada ficaria Serrada fondeóla Serrada odorífera de los biogrupos 1 y 2 * Serrada plymuthica Serrada rubidaea * ¡¡feísima bercoyieri * Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia *Wersinia mollaretii

1y 2

b. T SI solo *

Arsenophonus nasoniae Cedecea de la especie 3 Cedecea de la especie 5 Edwardsiella hoshinae Edwardsiella tarda del biogrupo 1 G ru po e n térico 68

Enterobacter hormaechae * Klebsiella pneumoniae subesp. rhinoscleromatis * Pantoea dispersa Proteus inconstans ProteuStmyxoJaciens Proteus penneri Proteus rettgeri * Providencia rustigianii Providencia stuartii Serrada entomophila Serrada grimesii Serrada marcescens Serrada proteamaculans Tatumella ptyseos * Yersinia aldovae Yersinia enterocolitica Yersinia rohdei 2. A cido/ácido, U 2S a. K IA /T SI Budvicia aquatica * Citrobacter freundii * Salmonella choleraesuis subesp. arizonae * Salmonella choleraesuis subesp. diarizonae Salmonella indica *

b. T S I solo Proteus mirabilis Proteus penneri * Proteus vulgaris3 * *

3. A lcalino/ácido, con/sin gas a. K IA solo * Arsenophonus nasoniae * Cedecea davisae * Cedecea neteri *

Cedecea subesp. 5 Citrobacter amalonaticus del b io g ru p o Edwardsiella hoshinae Edwardsielia tarda del b io g ru p o 1

G ru p o en térico 68

Enterobacter amnigenus d e l b io g ru p o Enterobacter asburiae * Enterobacter dissolvens

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 225 * Enterobacter gergoviae Enterobacter hormaechae Pantoea agglomerans Pantoea dispersa Proteus inconstans Proteus myxofaciens * Proteus penned Proteus rettgeri Serrada entomophila * Serrada ficaria Serrada grimesii Serrada marcescens Serrada plymuthica Serrada proteamaculans Tatumella ptyseos * Yersinia bercovieri Yersinia enterocolitica * Yersinia frederiksenii * Yersinia intermedia * Yersinia mollaretii Yersinia rohdei b .K IA /T S I * Budvicia aquatica * Cedecea lapagei * Cedecea de la especie 3 * Cihobacter amalonaticus * Citrobacter freundii * Citrobacter koseri Edwardsiella ictaluri Grupo entérico 63 * Enterobacter aerogenes Enterobacter amnigenus del biogrupo 2 Enterobacter cancerogenus * Escherichia blattae * Escherichia coli inactiva * Escherichia fergusonii * Escherichia hermannii * Escherichia vulneris * Ewingella americana * Hafnia alvei * Hafnia alvei del biogrupo 1 * Klebsiella pneumoniae subesp. ozaenae * Klebsiella pneumoniae subesp. rhinoscleromatis * Kluyvera cryocrescens Morganella morganii * Morganella morganii de los biogrupos 1 y 2 Obesumbacterium proteus * Plagia fontinum * Especies de Providencia * Salmonella choleraesuis serovar. choleraesuis * Salmonella choleraesuis serovar. paratyphi A Especies de Shigella. * Yersinia aldovae Yersinia kristensenii * Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis Yersinia ruckeri Yokenella regensburgei Especies de Xenorhabdus 4. A lta iino/ácido, gas, H 2S a. K IA solo Proteus penneri Proteus vulgaris b . K IA /T SI

226

Pruebas bioquímicas individuales * Budvicia aquatica * Citrobacter freundii Edwardsiella tarda Especies de Leminorella * Morganella morgartii del biogrupo 2 (raro) * Pragia fontinum * Proteus mirabilis * Especies de Salmonella.

5. Alcalino/alcalino o alcalino/sin cambios: K1A y TSI Acinetobacter baumanni Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffii Alcaligenes faecalis Alcaligenes latus Alcaligenes piechaudii Alcaligenes xylosoxidans Pseudomonas aeruginosa 6. Para ayudar a la determinación de género a. Yersinia enterocolitica (TSI, ácido/ácido) de Y pestis (TSI, alcalino/ácido) y de Y. pseudotuber culosis (TSI, alcalino/ácido). b. Edwardsiella tarda (H2S +) de otras especies de Edwardsiella (H2S - ). c. Proteus inconstans, P. myxofaciens y P. rettgeri (todos H2S - ) y P. penneri (H2S variable) de P. mirabilis (H2S +) y P. vulgaris (H2S +) B. Ayuda en la identificación de bacterias diferentes de las de la familia Enterobacteriaceae 1. Shewanella putrefaciens (H2S +) (antes Pseudomonas putrefaciens) de S. hanedai (H9S - ) y S. benthica (H2S - ) (1, 9). 2. Aerotolerantes previamente pertenecientes al género Campilobacter, Arcobacter nitrofigilis (H2S +) deA .butzleri (H2S - ) y A.cryaerophilus (H2S - ) (9). 3. Diferenciación de Erysipelothrix rhusiopathiae (H2S +) de otros bacilos gramnegativos no entéri cos (H2S - ) (9).

III. BIOQUÍMICA El agar con hierro de Kligler (KIA) y el agar con azúcar triple y hierro (TSI) son medios de cultivo di ferenciales en tubo que cum plen un doble propósito: a) la determinación de fermentaciones de hidratos de carbono y b) la determinación de la producción de H 2S. Un microorganismo puede usar varios sustra tos incorporados en el medio; el patrón de sustratos metabolizados se usa para diferenciar entre los diver sos grupos, géneros o especies, principalmente entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae. El KIA contiene dos hidratos de carbono: 1% de lactosa y 0,1% de glucosa. El TSI puede sustituir el KIA; la diferencia prim aria es el agregado de un tercer hidrato de carbono, la sacarosa, a una concentra ción del 1% . La bioquím ica es básicamente igual a la del KIA. Por eso, sólo se discute en detalle el KIA. En el KIA, algunos microorganismos pueden fermentar am bos hidratos de carbono, otros fermentan só lo la glucosa; incluso otros no pueden fermentar ni la lactosa n i la glucosa. La fermentación de los hidra tos de carbono puede ocurrir con producción de gas o sin ella (C 0 2 + H2). La fermentación tiene lugar tanto en aerobiosis (en el pico de flauta) como en anaerobiosis (en el fon do). En el pico de flauta, el monosacárido glucosa es catabolizado inicialmente por la vía metabólica anae robia de Embden-M eyerhof-Pamas, usada por aerobios y anaerobios para producir el intermediario cla ve ácido pirúvico. El ácido pirúvico es degradado luego a través del ciclo de Krebs por aerobios o anaerobios facultativos para rendir C 0 2, HzO y energía. Ambas vías metabólicas, la de Embden-M eyerhof-Pamas y el ciclo de Krebs, involucran pasos secuenciales que producen muchos intermediarios; cada paso está mediado por enzimas específicas. La lactosa es un disacárido compuesto por dos unidades de monosacárido: glucosa y galactosa. 0-Galactosidasa

L a c to s a --------------------- ► Glucosa + galactosa Ciclo de Krebs

Glucosa o galactosa

aerobio

C02 + H20 + energía

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 227 En el l'ondo del KIA (en profundidad) existen condiciones anaerobias, de forma que la glucosa se metaboliza por la vía de Embden-Meyerhof-Pamas a ATP y ácido pirúvico, que luego se convierten en los di versos productos finales estables: ácido láctico y/u otros ácidos orgánicos, aldehidos, alcoholes, C 02, H2 y energía.

Glucosa

Vía de Embden-Meyerhof-Pamas

ácidos orgánicos

A aldehidos

anaerobia

alcoholes

C 02 + H2 energía

Las reacciones del KIA se usan principalmente para identificar a los miembros de la fam ilia Enterobacteriaceae (entéricos), que por definición son bacilos gramnegativos catalasa positivos, todos los cuales fermentan la glucosa con producción de ácido. Asimismo, existen muchos bacilos intestinales gramnegativos no entéricos cuya identificación o separación de la familia Enterobacteriaceae es facili tada por sus reacciones en el KIA. Se observan tres patrones de fermentación básicos en el m edio KIA: a) fermentación sólo de la glucosa, b) fermentación de glucosa y de lactosa y c) ausencia de fermenta ción de glucosa o la lactosa. A los fines de identificación, todos los tubos de KIA deben interpretarse en lo que respecta a la fermen tación de los hidratos de carbono después de 18-24 h de incubación. Las interpretaciones realizadas antes o después pueden dar patrones de fermentación no válidos que producirán errores al agrupar los microorganis mos entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae o en la identificación de género y/o especie.

Fermentación sólo de la glucosa (alcalino/ácido) El primer patrón del KIA después de las 18-24 h de incubación es un pico de flauta alcalino y un fon do ácido (alcalino/ácido). Esta reacción se observa con los microorganismos capaces de fermentar sólo la glucosa; son los no termentadores de la lactosa. El pico de flauta es alcalino (rojo), lo cual indica la degradación aerobia de la glucosa. Después de 1824 h de incubación, la concentración baja de la glucosa (0,1%) se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas del medio como nutrientes de desarrollo. El catabolismo de la peptona libera amonía co (NH3) que alcaliniza el pH con el rojo fenol, el indicador de pH incorporado en el medio. Sin embargo, el fondo del KIA tiene un color amarillo debido a la degradación anaerobia de la gluco sa. La glucosa aquí también es degradada después de 18-24 h de incubación; sin embargo, se forman pro ductos finales ácidos, lo que produce un pH ácido (color amarillo); la reacción ácida se mantiene en el fondo debido a la tensión de oxígeno más baja. Si un m icroorganism o term entador de la glucosa en el KIA fuera leído antes (p. ej., a las 12 horas o menos), el pico de flauta estaría ácido, dado que en este corto tiem po la glucosa todavía no ha sido com pletam ente agotada y da una reacción falsa. U n m icrobiólogo interpretaría el m icroorganism o co mo capaz de ferm entar ambos hidratos de carbono presentes, la glucosa y la lactosa. D e m anera sim i lar, si el tubo de KIA no se lee hasta después de 48 h de incubación o más, tanto el pico de flauta co mo el fondo pueden ser alcalinos (rojos), lo cual indica que ningún hidrato de carbono fue fermentado. La acidez norm alm ente presente en el fondo se debe a la producción de productos ácidos estables; fi nalmente, sin embargo, estos productos se oxidan y el m icroorganism o pasa a usar las peptonas como sus nutrientes, lo que da por resultado un pH alcalino a lo largo de todo el tubo de KIA (tanto en el p i co de flauta como en el fondo).

Fermentación de lactosa y de glucosa (ácido/ácido) Algunos microorganismos pueden fermentar la lactosa y la glucosa para obtener sus nutrientes y pro ducen una reacción en el KIA con un pico de flauta ácido y un fondo ácido (ácido/ácido) después de 1824 h de incubación. La concentración de lactosa (1 %) es 10 veces la de la glucosa. En 18-24 horas, la lactosa (presente en mayor cantidad) no se ha agotado y todavía existe un medio ácido. Si el mismo tubo de KIA se leyera después de 48 h o más, el pico de flauta se pondría finalmente alcalino debido al agota miento de la lactosa y al uso de las peptonas.

228

Pruebas bioquímicas individuales

Ausencia de fermentación de lactosa y de glucosa (alcalino/alcalino; alcalino/sin cambios) Ciertas bacterias, principalmente los bacilos gramnegativos no entéricos, no pueden fermentar ni la glucosa ni la lactosa. Estas bacterias están presentes en el tracto intestinal junto con los miembros de la familia Enterobacteriaceae y es necesario identificarlas definitivamente como no entéricas. Dado que es tas bacterias no pueden obtener sus nutrientes a partir de los hidratos de carbono, dependen de la peptona del medio. Estos microorganismos no entéricos pueden usar la peptona de manera aeróbica o anaeróbica y producen dos reacciones posibles en el KIA. Un microorganismo que produce un KIA con un pico de flauta alcalino y el fondo alcalino degrada la peptona aeróbica y anaeróbicamente. U na reacción con un pico de flauta alcalino y ningún cambio en el fondo es el resultado de un microorganismo que puede catabolizar la peptona sólo aeróbicamente; por ende, sólo el pico de flauta muestra un cambio de color (rojo). Cuando las peptonas son degradadas y producen un pH alcalino debido a la liberación de amonía co (NH3), el medio adquiere un color rojo profundo. _

aeróbicamente

Peptonas------- —— -—

anaeróbicamente

Amoníaco (NH3)

Por consiguiente, una reacción en KIA puede interpretarse de cuatro maneras, según las bacterias a probar: 1 Alcalino/ácido: sólo la glucosa es degradada. 2. Acido/ácido: glucosa y lactosa degradadas. 3. Alcalino/alcalino: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas; uso de las peptonas. 4. Alcalino/sin cambios: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas; uso de las peptonas. Un tubo de KLA se observa para determinar si las bacterias presentes pueden fermentar la lactosa y/o la glucosa y también si se produce gas (C 0 2 y 0 2) como producto final del metabolismo de los hidratos de carbono. Un productor de gas se denomina aerógeno y se evidencia por la fragmentación del medio, por una sola burbuja de gas, por el desplazamiento completo del medio desde fondo del tubo dejando una zona libre o por una ligera separación del medio de las paredes del tubo. Los microorganismos no pro ductores de gas se denominan anaerógenos.

Formación de H2S Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de H2S presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores de ben estar presentes, ya que el resultado final es un procedimiento en dos pasos. PASO 1 Bacteria (en ambiente ácido) + tiosulfato de s o d io --------- > H2S gaseoso t

El H2S es un gas incoloro; por ello, es necesario un segundo indicador para visualizar la producción de H2S. PASO 2 H2S + iones férricos -------- > Sulfuro ferroso I (precipitado negro insoluble)

(Véase cap. 15, Prueba de ác;do sulfhídrico, para una explicación más detallada de la bioquím ica de producción do H 2S.) El precipitado negro del sulfuro ferroso que indica la producción de H2S puede en mascarar la condición ácida producida en el fondo del KIA; por consiguiente, si se produce H2S, existe una condición ácida aun cuando no sea evidente. Tittsler (15) encontró un paralelo entre la capacidad de un microorganismo para producir H 2S y los gases C 0 2 y H2 por las fermentaciones de los hidratos de carbono. No todos los monosacáridos son degradados por todas las especies bacterianas; sus patrones de fermentación y producción de H2S difieren, lo que ayuda a la identificación del grupo, del género o de la especie. La fermentación es un proceso anaeróbico y los fermentadores bacterianos normalmente son anaerobios facultativos (6).

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 229 Cuando se lee un KIA después de 18-24 h de incubación, buscar: a) la fermentación de la lactosa y/o la glucosa, b) la producción de COz y H, a partir del metabolismo de los hidratos de carbono y c) la pro ducción de H2S.

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

_____________________________________

A. Agar con hierro de Kligler (KIA) 1. Fórmula de Kligler (7, 8): una combinación del medio con acetato de plomo de Kligler y del agar con azúcar doble de Russell (13). 2. Ingredientes, pH 7,4 ± 0,2 E x tracto de carne (de vaca) E x tracto de levadura P ep to n a P ep to n a pro teo sa L acto sa G lu co sa (dextrosa) S ulfato ferroso, F e S 0 4 • 7 H 20 o C itrato de am onio férrico (50/50) C itrato férrico, F eC sH 5O v C itrato de am onio [(N H 4)3C 6H 50 7] C lo ru ro de sodio, N aC l T io su lfato de sodio, N a2S20 3 • 5 H 20 R o jo fenol A g ar A g u a d esionizada

3 g 3g 15 g 5 g 10 g 1g 0,2 g 0,5 g

5 g 0,3 g 0,024 12 g 1.000 m L

(Nota: ferroso, Fe2+ o hierro (II); férrico, Fe3+ o hierro (III).)

B. Agar con azúcar triple y hierro (TSI) 1. Fórmula de Krumwiede y Kohn (medio de azúcar triple) (10); medio de Russell de azúcar doble (13) modificado por el agregado de sacarosa. Sulkin y W illett (14) hicieron una modificación adi cional agregando los indicadores de H2S; la fórmula final es una modificación de Hajna (4). La agrupación de las los integrantes de la familia Enterobacteriaceae por las reacciones en TSI varía ligeramente de la realizada por KIA, ya que algunos no termentadores de la lactosa pueden fermentar la sacarosa, lo que produce una reacción diferente en el pico de flauta (cuadro 18-1). Por ejemplo, Proteus vulgaris es alcalino/ácido en KIA pero normalmente es ácido/ácido en TSI. 2. El agregado de sacarosa ayuda a la detección de Salmonella y Shigella, ya que sólo las cepas ra ras usan lactosa o sacarosa. 3. Ingredientes: los mismos que para el KIA con los siguientes agregados: a. Sacarosa, 10 g/L (1%T b. Indicadores de H2S: sulfato de amonio ferroso, FeNH4(S 0 4)2 • 12H20 , o sulfato ferroso, F e S 0 4 • 7H20 . Tanto el KIA como el TSI contienen cuatro derivados proteicos: extracto de carne, extracto de leva dura, peptona y peptona proteosa; estos ingredientes hacen que ambos medios de cultivo sean nutriti vamente ricos (9).

Cuadro 18-1. Reacciones y colores en KIA/TSI Reacción

KIA

TSI

Alc/A (rojo/amarillo)

Sólo la glucosa sola fermentada Peptonas usadas Glucosa fermentada Lactosa fermentada Ausencia de fermentación de la glucosa y la lactosa; peptonas usadas

A/A (amarillo/amarillo) Alc/Alc (rojo/rojo)

230

Pruebas bioquímicas individuales

C. Hidratos de carbono 1. KIA Lactosa, 1% Glucosa (dextrosa), 0,1% 2. TSI Lactosa, 1% Sacarosa, 1% Glucosa (dextrosa), 0,1% D. Indicador de pH: rojo fenol 1. Alcalino: rojo. 2. Ácido: amarillo. 3. Medio sin sembrar: pH 7,4; naranja roji*zo. E. Indicadores de H2S 1. Tiosulfato de sodio. 2. Citrato de amonio fénico, sulfato de amonio férrico, sulfato de amonio ferroso o sulfato ferroso. F. Método de preparación 1. Pesar con precisión la cantidad que se indica en la etiqueta. Los productos de diferentes compa ñías pueden diferir ligeramente. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada. 3. Calentar suavemente la solución. 4. Distribuir alrededor de 5 mL por tubo. 5. Autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. 6. Enfriar en una posición inclinada con fondos profundos. G. Método de inoculación 1. Cultivo puro, colonia única. 2. Tocar el centro de la colonia con una aguja de inoculación. 3. Medio en tubos: estriar el pico de flauta; punción del fondo. El orden puede invertirse si se prefiere. H. Incubación: 35°C; 18-24 h, ni menos ni más.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD PARA KIA/TSI Microorganismo Escherichia coli Shigella flexneri Edwardsiella larda Pseudomonas aeruginosa

VI.

ATCC 25922 12022 15947 27853

Pico de flauta Acido Alcalino Alcalino Alcalino

Fondo Ácido, gas Ácido Ácido Alcalino

h 2s -

+ -

RESULTADOS Véanse figuras 18-1 a 18-8 (Apéndice 1) p a ra los resultados fotográficos en color.

Vil. INTERPRETACIÓN A. Utilización de los hidratos de carbono 1. La sólo fermentación de la glucosa a. Pico de flauta (1) Reacción alcalina. (2) Color rojo. b. Fondo (1) Reacción ácida. (2) Color amarillo. (a) Si también se produce H2S gaseoso, el precipitado negro puede enmascarar la acidez. (b) Existe una condición ácida en el iondo y se registra como tal. 2. Fermentación de la glucosa y la lactosa a. Pico de flauta

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 231 (1) Reacción ácida. (2) Color amarillo, b. Fondo (1) Reacción ácida. (2) Color amarillo. (a) Citrobacter freundii produce H2S además de fermentar ambos hidratos de carbono. (b) Sin embargo, existe una condición ácida en el fondo y debe registrarse como tal si no es observable. 3. No hay fermentación ni de la glucosa ni de la lactosa (no entéricos) a. Pico de flauta (1) Reacción alcalina. (2) Color rojo. b. Fondo (1) M icroorganismo aerobio (a) Ningún desarrollo. (b) Ningún cambio de color. 1. El mismo color que el tubo no inoculado. 2. Color naranja roji*zo. 3. Si no es seguro, comparar con un tubo no inoculado. (2) M icroorganismo facultativo (a) Reacción alcalina. (b) Color rojo. 4. No hay fermentación ni de la glucosa ni de la lactosa; bastante común. a. Pico de flauta

(1) Desarrollo solamente. (2) Ningún cambio de color; igual al tubo no inoculado (color naranja roji*zo). b. Fondo

(1) Desarrollo solamente. (2) Ningún cambio de color; igual al tubo no inoculado (color naranja roji*zo).

B. Producción de gas 1. Aerógeno a. Producción de gas: C 0 2 y H2. b. Evidente por una de las características siguientes: (1) U na sola burbuja de gas. (2) Burbujas en el medio. (3) Fragmentación del medio. (4) Desplazamiento completo del medio desde el fondo del tubo, dejando una zona libre. (5) Desprendimiento ligero del medio de la pared del tubo. 2. Anaerógeno: ninguna producción de gas. C. Producción de H 2S: precipitado negro (sulfuro ferroso) evidenciado por: 1. Diseminación del color negro en todo el fondo, lo cual enmascara la acidez; incluso puede haber leve evidencia en el pico de flauta. 2. Un anillo negro cerca de la parte superior del fondo. 3. Un precipitado negro esparcido en el fondo, pero sin enmascarar completamente la acidez.

Puede observarse cualquier combinación de las reacciones anteriores cuando se lee el resultado de un KIA. Observar siempre si existen las tres características: a) fermentaciones de los hidratos de carbono, b) producción de gas (C 0 2 y H2) y c) producción de H2S. Registrar todas las observaciones. VIII.

PRECAUCIONES

______________

El TSI puede sustituir el KIA. La diferencia primaria es el agregado de un tercer hidrato de carbono, sacarosa al 1%. Sin embargo, el principio, el objetivo y la bioquímica son básicamente iguales a los del KIA. Estas precauciones son válidas para ambos medios de cultivo. A.

Los tubos de KIA deben leerse e interpretarse dentro de un período de 18 a 24 h de incubación. Si se leen antes (p. ej., a las 12 h), puede haber un resultado falso positivo ácido/ácido o el hidrato de carbono

232

Pruebas bioquímicas individuales

fermentado puede no haber producido todavía suficiente ácido como para alterar el indicador de pH (rojo fenol) incorporado al medio. Un tubo de KIA leído después de 24 h puede dar un resultado fal so alcalino/alcalino porque el microorganismo ha usado las peptonas, produciendo un pH alcalino. B. Un microorganismo productor de H2S puede formar tanto precipitado negro (sulfuro ferroso) que la acidez del fondo queda completamente enmascarada. Sin embargo, si se produce H2S, existe una con dición ácida en el fondo, aun cuando no sea evidente, y debe registrase como tal. C. Los resultados del KIA siempre se escriben de una manera estándar. Primero la reacción del pico de flauta, luego la reacción del fondo, separada por una barra (es decir, reacción del pico de flauta/reacción del fondo). La reacción del pico de flauta involucra la presencia o la ausencia de acidez (fermen tación del hidrato de carbono). Cuando se interpreta la reacción del fondo buscar: a) la ausencia o la presencia de acidez (fermentación del hidrato de carbono) o el uso de peptonas, b) la presencia de C 0 2 y H2 gaseosos y c) la presencia de un precipitado negro que indica la producción de H2S. El H2S es un gas, pero como es incoloro, el segundo indicador de H2S es necesario para detectar su presencia. El citrato de amonio férrico reacciona con el H2S gaseoso para formar sulfuro ferroso, que produce el precipitado negro observado en el fondo. Así, cuando se registra la producción de H2S, no usar la pa labra gas; el símbolo H2S implica que se ha producido gas. Las diferentes reacciones observadas en el KIA pueden escribirse de forma completa o pueden abre viarse con abreviaturas estándar para todos los laboratorios de bacteriología. La acidez puede desig narse con la letra A; alcalinidad, por la abreviatura A le o el símbolo K. Los gases C 0 2 y H2 pueden de signarse con la palabra gas, el símbolo G o haciendo un círculo alrededor de la reacción del fondo. El H 2S sólo se designa con H2S. Las diversas maneras de registrar las diferentes reacciones en el KIA se enumeran a continuación; recordar que la reacción del pico de flauta va primero y en segundo lugar la reacción del fondo. 1. Ácido/ácido: A/A 2. Ácido/ácido, gas A/A, gas A/A, G A /® 3. Alcalino/ácido Alc/A K/A 4. Alcalino/ácido, gas K/A, gas Alc/A, gas K/A, G Alc/A, G A le / ® K /® 5. Alcalino/ácido, gas, H2S K/A, gas, H2S Alc/A, gas, H 2S K/A, G, H,S Alc/A, G, H2S A l e / ® , H 2S K / ® , H2S 6. Alcalino/ácido, H2S Alc/A, H7S K/A, H2S‘ AJA, H2S 7. Ácido/ácido, H2S 8. Alcalino/alcalino Ale/Ale K/K 9. Alcalino/sin cambios Alc/SC K/SC 10. Sin cambios/sin cambios: SC/SC El símbolo K, que significa alcalinidad, es aceptable y con frecuencia se usa en laboratorios o en li bros de referencia. Antes de usar este símbolo, asegurarse que es aceptable en su laboratorio de bacterio logía particular.

D. El KIA no contiene ningún inhibidor; por consiguiente, cualquier microorganismo puede crecer en es te medio; permite el desarrollo de las especies con más requerimientos especiales de cultivo excepto

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 233

H. I.

J. K.

los anaerobios obligados (estrictos), El medio diferencial KIA en tubos se usa para identificar a todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae (entéricos) y los bacilos intestinales gramnegativos no entéricos. Por ende, antes de sembrar un tubo de KIA con un microorganismo desconocido, hay que asegurarse de que sea un bacilo gramnegativo catalasa positivo. Si se siembran otros microorganis mos en KIA, puede observarse una variedad de reacciones y algunos no encajarán en ningún patrón de agrupación entérica (p. ej., ácido/alcalino, ácido/sin cambios). El medio sólo puede usarse para probar una sola colonia recuperada a partir de placas de aislamiento primario o selectivas. Un cultivo puro es esencial para sembrar un tubo de KIA. Siempre toque el centro de una colonia bien aislada en un medio sólido en placa con una aguja de inoculación. Si el KIA se siembra con un cultivo mixto, pueden ocurrir observaciones irregulares después de la incubación; las reacciones m ix tas en las pruebas bioquímicas siguientes son habituales, lo que hace imposible ubicar con precisión el microorganismo en un patrón particular para la identificación del grupo, del género o de la especie. Aun cuando un microorganismo sea un fermentador de la glucosa y sospechoso de ser entérico, de be realizarse una prueba de citocromo oxidasa para excluir los microorganismos que pertenecen a otros géneros de bacterias fermentadoras como Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio y Pasteurella, que son oxi dasa positivas (9). Después de leer los resultados de un tubo de KIA, refrigerar para sembrar los medios bioquímicos pa ra la identificación o la confirmación de género o de género y especie. Colocar los tubos de KIA en una gradilla junto con los tubos de medios de cultivo para pruebas bioquímicas a ser inoculados. El tu bo de KIA se incuba junto con los de medios bioquímicos para mantener la continuidad de la m ues tra, ya que el tubo de KIA debe haberse rotulado para identificar la muestra adecuadamente. Por lo general, los medios bioquímicos sembrados a partir de un tubo de KIA no se rotulan; por ende, el tu bo de KIA se coloca en la prim era posición en la gradilla, seguido por las pruebas bioquímicas en el orden usado en su laboratorio. Esto también mantiene la continuidad al sembrar los diversos tubos de medios bioquímicos. Después de la incubación de la gradilla de medios bioquímicos no intentar la in terpretación del tubo de KIA de nuevo. La reacción ya se ha interpretado y registrado. Un cambio en la reacción no tiene ninguna importancia. El KIA detectará dos tipos de gases: a) C 0 2 y H2, que son los productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono y (b) H2S. El H2S es incoloro y produce un precipitado negro cuando entra en contacto con el citrato de amonio férrico o el sulfato ferroso. Por consiguiente, sólo los gases C 0 2 y H2 se registran usando la palabra gas; H2S se usa sólo para indicar la presencia de ácido sulfhídrico gaseoso. No usar la palabra gas para indicar la producción de H2S. A menudo, un microorganismo que produce C 0 2 y H2 no presenta ninguna evidencia de estos ga ses en el fondo del KIA: burbujas, fragmentación del medio, un ligero desprendimiento del medio de la pared del tubo o un desplazamiento del medio desde el fondo del tubo que deja un espacio libre. Si no se observa gas con un microorganismo que habitualmente produce gas, no hay que preocuparse. Si se forma gas, se detectará en las diversas pruebas para hidratos de carbono (principalmente glucosa) usando un tubo de Durham o un medio semisólido. Si un microorganismo puede producir H2S gaseoso, su detección depende de la presencia de am bos indicadores de H2S: el tiosulfato de sodio y el citrato de amonio férrico o el sulfato ferroso. Si fal ta uno de ellos, el H2S no puede ser detectado. Salmonella typhi produce habitualmente un anillo de H2S cerca de la superficie del fondo. Sin em bar go, esta característica no es suficiente para los fines de identificación. Deben realizarse pruebas bio químicas y tipificación serológica para la identificación y la confirmación definitivas. Otros microor ganismos productores de H2S pueden producir a veces la falsa apariencia de un anillo de H 2S porque producen una pequeña cantidad de H 2S en el período de incubación de 18 a 24 h. No debe confiarse en la presencia de un anillo de H2S para la identificación definitiva de SI typhi. No usar un ansa de inoculación para sembrar un tubo de KIA. Al punzar el fondo se produce ruptura mecánica, la que da un falso aspecto de producción de gas (C 0 2 y H2). No debe omitirse la punción del fondo del KIA durante la siembra; la omisión de este paso puede in validar el resultado. El orden para sembrar un tubo de KIA es: a) pico de flauta por estría, punción del fondo o b) punción del fondo, pico de flauta por estría, no tiene ninguna importancia, con tal de que se hagan ambasisiembras. El orden usado depende de la preferencia del microbiólogo. BBL (12) recomienda preparar los tubos de KIA el mismo día en que serán usados para obtener mayor exactitud; si esto no es factible, el medio debe fundirse y resolidificarse inmediatamente antes de usar. Los indicadores de H2S en el KIA no son tan sensibles como las tiras de acetato de plomo para detec tar la producción de H2S. La determinación de H2S por el medio de KIA debe limitarse a los miembros

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Pruebas bioquímicas individuales

de la familia Enterobacteriaceae; otros microorganismos exigen el procedimiento más sensible con ti ras de acetato de plomo, para detectar la formación de H2S. L. Algunos microorganismos, fundamentalmente de los grupos Klebsiella- Enterobacter, producen tan to gas (C 0 2 y H2) que los medios pueden ser desplazados por completo por el gas y hacen saltar el ta pón del tubo. Si esto ocurre, manipular el cultivo con la mayor cautela cuando se subcultiva para evi tar la contaminación del cultivo o la contaminación personal. M. La cantidad de H2S producida por ciertos microorganismos varía. Algunos producen tanto gas que el fondo está completamente ennegrecido por el sulfuro ferroso precipitado; otros producen una canti dad moderada, ennegreciendo eldbndo, pero dejando la acidez visible, mientras que otros producen sólo cantidades mínimas en el período de incubación de 18 a 24 h. Sin embargo, cualquier traza de color negro en el fondo indica la producción de H2S y debe registrarse como tal. A veces, Proteus rettgeri (antes Providencia rettgeri) o Morganella morganii muestran oscurecimiento del fondo del KIA, pero esto no debe interpretarse como producción de H2S. N. En ciertas oportunidades, se observa después de la incubación un resultado del KIA sin cambios/sin cambios. No hay que apresurarse a desechar el tubo. Verificar el tubo cuidadosamente para ver si hay desarrollo. Si no hay desarrollo, posiblemente el microbiólogo no lo sembró; buscar una línea de punción en el fondo y las marcas de la estría en el pico de flauta. Ciertas bacterias crecen en el KIA, pero no muestran ninguna acción sobre los hidratos de carbono dentro de las 24 h ni un cambio en el indicador de pH hacia la alcalinidad. Si hay desarrollo presente, registrar la reacción del KIA como SC/SC y proceder a la siembra de los medios bioquímicos para la identificación, después de realizar una coloración de Gram para confirmar la presencia de un bacilo gramnegativo. O. A veces, un tubo de KIA muestra una reacción ácida en el pico de flauta, pero ningún cambio en el fondo. Esto podría ser el resultado de: a) la siembra de un microorganismo grampositivo que puede utilizar la lactosa sólo aeróbicamente o b) la omisión de punzar el fondo por parte del microbiólogo. Si ocurre esto, verificar que en el fondo hay una línea de punción, controlar nuevamente la morfolo gía de la colonia en el medio en placa usado para la siembra del KIA y realizar una coloración de Gram y una prueba de catalasa en el desarrollo del pico de flauta. P. Los grupos Klebsiella-Enterobacter normalmente causan una reversión rápida del pico de flauta den tro de las 18 a 24 h incubación. Por lo general, estos grupos muestran una reacción en el KIA AJA, gas. Informar la reacción del KIA exactamente como se observa; por ejemplo, con reversión alcalino/ácido, gas. Si se sospecha una reversión debido a la morfología de la colonia, se puede escribir re versión entre paréntesis después de la reacción del KIA: alcalino/ácido, gas (reversión). Si hay rever sión, normalmente comienza en la punta del pico de flauta, con una reversión a la alcalinidad. Esto no debe crear ningún problema si se verifica la morfología de la colonia en los medios de cultivo sólidos y en el pico de flauta del KIA. Estos microorganismos por lo general son sumamente mucoides, tan to en los medios en placa como en el pico de flauta del KIA, y normalmente producen abundante gas, el cual desplaza todo el medio hasta la boca del tubo. De todas maneras, deben realizarse pruebas bio químicas para la identificación de los grupos, géneros o género y especie presentes. Q. No usar tubos con tapa a rosca para los medios de cultivo KIA/TSI ni tubos herméticamente tapados con tapones o tapas durante la incubación. El estímulo de la condición alcalina en el pico de flauta re quiere intercambio libre de aire a través de tapones flojos en los tubos. Si los tapones son demasiado herméticos, una condición ácida puede involucrar solamente el pico de flauta debido a la fermentación de la glucosa. R. Al preparar el medio, el pico de flauta y el fondo deben tener la m isma longitud, alrededor de 1,5 pul gada, o 3 centímetros, para conservar el efecto de doble cámara (9). S. Los microbiólogos que usan equipos comerciales y omiten la siembra de muestras desconocidas en KIA/TSI no pueden saber si deben seleccionar un sistema fermentador u oxidativo; la oxidación/fermentación (OF) de todos los aislamientos desconocidos de bacilos gramnegativos debe evaluarse por la siembra en KIA o TSI. T. Los ácidos producidos por los no fermentadores son considerablemente más débiles que los ácidos mixtos derivados de bacterias fermentadoras, por lo que el pH en los medios de fermentación en los que desarrolla un no fermentador puede no disminuir lo suficiente como para afectar el indicador de pH; la indicación inicial es una falta de producción de ácido, tanto en KIA como en TSI, con un pico de flauta alcalino (rojo) y un fondo alcalino (rojo oscuro). U. La producción de H 2S puede ser evidente en KIA pero negativa en TSI, porque la sacarosa sólo está presente en el TSI. Los estudios realizados por B ulm ash y Fulton (3) dem ostraron que el uso de sacarosa puede suprim ir los m ecanism os enzim áticos responsables de la producción de H 2S.

Pruebas en agar con hierro de Kligler/azúcar triple y hierro 235 Padrón y Dockstader (11) afirman que no todas las especies de Salmonella productoras de H2S son po sitivas en TSI y que este medio no proporciona diferenciaciones netas de otros miembros productores de H 2S de la familia Enterobacteriaceae. V. Deben hacerse controles de la peptona usada en el medio para H2S, para determinar si el contenido de azufre es suficiente para la producción de H2S. Si la peptona es deficiente para la detección rápida de IES, puede agregarse cisterna para enriquecer la concentración de puentes sulfhidrilo ( - SH). W. Un microorganismo productor de H2S puede mostrar ennegrecimiento en el medio para movilidadsulfuro-indol (SIM) (positivo) pero no en el medio TSI (negativo) (2). X. Según Tittsler (15), ocurre cierta inhibición del H2S cuando la prueba se incuba a 34°C, y la inhibición aumenta a medida que aumenta la temperatura hasta 40°C. En los experimentos con Salmonella pullorum, Tittsler (15) encontró que la temperatura de incubación óptima para la máxima producción de H2S era 30-34°C. Y. La sacarosa se agrega al TSI para eliminar ciertas bacterias fermentadoras de la sacarosa, no fermentadoras de la lactosa (p. ej., especies de Proteus y de Citrobacter) (15). REFERENCIAS 1. B alow s A , H au sler W J Jr, H errm an n KL, e t al. M a nual o f C lin ic a l M icro b io lo g y , e d 5, W ashington, D C : A m erican S o ciety fo r M icrobiology, 1991:439. 2. B ran so n D . M eth o d s in C linical B acteriology. S pringfield, IL: C h arles C T h o m a s,1972:24-25. 3. B u lm ash JM , F u lto n M . D iscrep an t tests fo r h y d ro gen sulfide. J B a c te rio l 1964;88(2): 1813. 4. H ajn a A A . T rip le-su g ar iro n ag ar m ed iu m fo r the id en tificatio n o f th e in te stin al g roup o f b acteria. J B acterio l 1 9 4 5 ;49(5):516-517. 5. H o w ard B J, K laas J I I , R ubin SJ, e t al. C linical and P a th o g en ic M ic ro b io lo g y . St. L o u is: C V M osby, 1987:,299-301. 6. H u g h R , L eifso n E. T h e taxonom ic significance o f fe rm e n ta tiv e v ersu s o x id ativ e m eta b o lism o f c a r b o h y d rates b y v arious gram negative bacteria. J B a c teriol 1 9 5 3 ;6 6 (l):2 4 -2 6 . 7. K lig ler U . A sim p le m ed iu m fo r th e differentiation o f m em b ers o f the typh o id -p araty p h o id group. A m J P ublic H ealth 1917;7(12): 1042-1044. 8. K ligler I J . M odifications o f culture m edia used in the iso latio n an d d ifferen tiatio n o f typhoid, dysentery, and allied bacilli. J E xp M ed 1918; 28(3) 319-322

9. K onem an EW , A llen SD , J andaW M , e t al. C o lo r A tlas a n d T e x tb o o k o f D ia g n o stic M ic ro b io lo g y , e d 4. P h ilad elp h ia: JB L ippincott, 1992: 113. 114, 127131, 1 5 4 -1 5 8 ,2 1 2 , 2 5 1 ,4 8 3 . 10. K rum w iede C Jr, K ohn L A . A trip le-su g ar m o d ifi cation o f the R ussell dou b le sugar m edium . J M ed R es 1917;37:225-227. 11. P ad ró n AP, D ock stad er W B . S elective m ed iu m for h y d ro g en sulfide pro d u ctio n by salm onellae. A ppl M icro b io l 1972;23(6): 1107-1112. 12. P o w e r D A , M c C u e n P J. M a n u a l o f B B L P ro d u c ts a n d L a b o ra to ry P ro c e d u re s, e d 6. C o c k e y s v ille , M D : B e c to n D ic k in s o n M ic ro b io lo g y S y s te m s, 1988: 171. 13. R u ssell FF. T h e isolation o f typhoid b acilli fro m u ri ne and feces w ith the d escription o f a new double sugar tu b e m edium . J M e d R es 1911;25:217-229. 14. S ulkin SE, W illett JC . A tnple sugar-ferrous sulfate m e d iu m fo r u se in id e n tific a tio n o f e n te ric o rg a nism s. J L ab C lin M ed 1940;25(6):649-653. 15. T ittsler RP. T h e effect o f tem perature u p o n th e p ro duction o f hydro g en sulphide b y Salmonella pullorum. J B acterio l 1931;21:111-118.

Prueba de p-lactamasa

I. PRINCIPIO Establecer la sensibilidad de microorganismos específicos a penicilinas sensibles a la penicilinasa o a cefalosporina sensibles a la cefalosporinasa, determinada por su capacidad de elaborar una enzima (3-lactamasa que hidroliza el anillo P-lactámico para producir ácido peniciloico o ácido cefalosporoico.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 y 44) Las P-lactamasas se encuentran en una variedad de bacterias grampositivas y gramnegativas (42). La importancia de las enzimas producidas por muchas bacterias entéricas (Enterobacteriaceae) es menos cla ra y estas bacterias no deben probarse para la producción de P-lactamasa (42); su escaso valor se debe a la diversidad de enzimas con especificidades de sustrato diferentes que pueden producirse dentro de las especies o incluso por una sola cepa (98). A. Haemophilus influenzae!Haemophilus parainfluenzae (39, 94) 1. Deben realizarse pruebas de P-lactamasa en todas las especies de Haemophilus clínicamente im portantes; para cualquier aislamiento considerado patógeno (42). 2. La P-lactamasa TEM-1 (mediada por plásmidos) puede detectarse por una variedad de pruebas in vitro para P-lactamasa (94, 100). B. Neisseria gonorrhoeae (4) 1. La prueba de p-lactamasa debe realizarse para todas las bacterias N. gonorrhoeae clínicamente im portantes; para cualquier aislamiento considerado patógeno (42). 2. Las cepas productoras de P-lactamasa resistentes a la penicilina se encuentran cada vez con m a yor frecuencia y deben detectarse antes de comenzar el tratamiento antibiótico (42). C. Moraxella (Branhamella) catarrhalis (57) 1. Todo aislamiento clínicamente relevante debe probarse rutinariamente para la producción de p-lactamasa (70). 2. La prueba de nitrocefma no puede diferenciar las cepas de tipo BRO-1 (tipo Ravisio) de las de ti po BRO-2 (tipo 1908); todas las cepas productoras de p-lactam asa deben interpretarse e informar se como resistentes a la penicilina (70). 3. El ensayo de nitrocefma tiene la tasa más baja de resultados falsos negativos y es el método de elec ción (19, 21, 23, 24, 32, 45). D. Enterococcus faecalis: el ensayo de nitrocefma crcm ógena es el método de elección (68). E. Ciertas especies de Racteroidcs/Prevotella (63) 1. Identificación presuntiva de los miembros del grupo Bacteroides fragilis y de otras especies ante riormente pertenecientes al género Bacteroides productoras de p-lactamasa: Prevotella melaninogenicus y Prevotella oralis. 2. El grupo p-lactamasa de B. fragilis se detecta fundamentalmente por el método de ensayo de ni trocefma cromógena. 3. P. melaninogenicus se detecta por las pruebas cromógena y de almidón-yodo (11). F. Staphylococcus aureus subesp. aureus (74,109): se prefiere la prueba de nitrocefina cromógena (1,24,41).

Prueba de p-lactamasa 237 G. Especies de Legionella: L. cincinnatiensis (-), L fe e le i (-), L. micdadei (-), y L. maceachernii (-); L. bozemanii (V, variable) y L. longbeachae (V) de otras especies de Legionella (+) (92). H. Se ha informado la presencia de P-lactamasa en especies de Clostridium y Fusobacterium (58).

III. BIOQUÍMICA_______________________________________________________________ Plásmidos/Resistencia Los plásmidos son partículas de ADN extracromosómico, trozos circulares de ADN que actúan inde pendientemente de los cromosomas (42). La codificación genética (información) para la producción de P-lactamasa normalmente reside en plásmidos (episomas) que portan los genes que determinan y contro lan la resistencia a antibióticos (103). A veces son físicamente distintos del cromosoma bacteriano y al gunas bacterias pueden transferirlos de una bacteria a otra (107), lo que explica la difusión de la resisten cia (52). Están surgiendo otros mecanismos de resistencia; además de la producción de una enzima inactivante, existe la “resistencia intrínseca” (52). La agrupación de genes resistentes a múltiples antibióticos en un plásmido permite el traslado masivo de la resistencia que caracteriza a muchos de los microorganismos que se han hecho resistentes de mane ra reciente. El ADN de los plásmidos se transfiere fácilmente de una cepa a otra, de una especie a otra e incluso de un género a otro (42). Sin embargo, parte de la resistencia a antibióticos es mediada por los cromosomas (107). El mecanismo más común de transferencia de genes resistentes a otras bacterias es a través de un trans posón (elemento genético transportable), que lleva porciones de plásmidos y un trozo de cromosoma de una bacteria a otra por transferencia por conjugación (transposón conjugativo o “gen saltarín”) (42). Por lo común, la resistencia depende completamente o en parte de las P-lactamasas (55). Los genes de los plásmidos son responsables de la resistencia adquirida, que es mutacional o adquiri da (92). La resistencia adquirida a muchas penicilinas tiene lugar por la producción de P-lactamasas. El gen transpuesto que codifica una P-lactamasa determinada por plásmidos es la P-lactamasa TEM encon trada en H. influenzae y en N. gonorrhoeae (92). Las P-lactamasas mediadas por plásmidos son princi palmente de los tipos TEM y SHV.

P-lactamasas Se conocen más de 50 P-lactamasas o penicilinasas diferentes (35). Las p-lactamasas (penicilinasas) son enzimas modificadoras (enzimas inactivadoras de fármacos) que se encuentran en todos los tipos de bacterias, grampositivas y gramnegativas. Son enzimas bacterianas heterogéneas; enzimas destructoras de penicilina que degradan (es decir, abren) el anillo P-lactámico de las penicilinasty cefalosporinas pa ra inactivar el antibiótico (35,42). Sin embargo, no todas las p-lactamasas producidas por diferentes ce pas bacterianas resistentes son idénticas (52). Los microorganismos productores de p-lactamasas pueden reducir la eficacia de los antibióticos P-lactámicos para erradicar la infección en diversas localizaciones (12). Estos microorganismos no sólo se pro tegen a sí mismos frente a la penicilina, sino que también pueden proteger microorganismos sensibles a la penicilina que pueden estar presentes en el sitio de la infección (13). Las P-lactamasas puede ser inducidas o constitutivas. Una enzima inducible sólo se produce cuando un microorganismo se expone a un antibiótico P-lactámico (60); la enzima sólo se produce en presencia de (es decir, la exposición a) un sustrato de un agente antimicrobiano p-lactámico, después de lo cual se desencadena la producción de la enzima (42). Una célula inducida que contiene el gen para la resisten cia tiene un mecanismo de control que le permite que se abstenga de sintetizar una enzima (p. ej., p-lactamasa) cuando no la necesita (p. ej., en ausencia de antibiótico) (52). Sin embargo, en presencia del an tibiótico, se evoca el mecanismo llamado inducción y la célula sintetiza la enzima inactivadora (52). El antibiótico no causa la resistencia; sólo induce la expresión de resistencia potencialmente presente en la célula (52). La enzima constitutiva se expresa de manera continua, independientemente de que haya o no un estímulo desencadenante (42). La P-lactamasa es sólo uno de varios factores que contribuyen a la resistencia a la penicilina y a las cefalosporinas por parte de las bacterias gramnegativas; otros factores incluyen: a) la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que constituyen una barrera impermeable hidrófoba y b) la elipticidad, que se refiere la interacción de la P-lactamasa uniaa a la célula con la función de barrera de la envoltura celular (98).

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Pruebas bioquímicas individuales

La m ayoría de las (3-lactamasas de las bacterias gram positivas tienen afinidad aum entada por las penicilinas más que por las cefalosporinas (penicilinasas) (42). E n las.bacterias gramnegativas, las en zimas crom osóm icas tienen una especificidad m ayor para las cefalosporinas que para las penicilinas (cefalosporinasas). Algunas enzimas son segregadas hacia el medio extracelular, donde ejercen su acción antibacteriana; por ejemplo, las P-lactamasas de los cocos grampositivos, como los estafilococos, son segregadas (42). La mayoría de las enzimas gramnegativas están unidas a las células y sólo ejercen sus efectos si el anti biótico entra en la célula (42). Se cree que la resistencia bacteriana a agentes antimicrobianos se debe a a) un defecto, la inactivación enzimática del antibiótico por las P-lactamasas de las bacterias grampositivas y gramnegativas, y b) la al teración de las proteínas ligadoras de una variedad de antibióticos P-lactámicos, para las bacterias gram positivas y gramnegativas (42); la alteración en las proteínas ligadoras de penicilina (las peptidoglucanotranspeptidasas), que son esenciales parala actividad de los antibióticos P-lactámicos (42,55). Las proteínas ligadoras pueden unirse a un antibiótico particular. Varias proteínas diferentes de la membrana interna, las llamadas proteínas ligadoras de penicilina, pueden unirse específicamente a los P-lactámicos (52). D i ferentes P-lactámicos varían en su afinidad de unión (52).

p-lactámicos El grupo de los P-lactámicos incluye dos de las familias más importantes de antibióticos: las penicili nas y las cefalosporinas. Las bacterias pueden tener afinidad alta por cualquier fármaco P-lactámico de cualquier clase (42). Todas las penicilinas y todas las cefalosporinas son fármacos P-lactámicos que inhi ben selectivamente la síntesis de la pared celular bacteriana (35). La pared celular está compuesta de peptidoglucano, una macromolécula (mucopéptido o glucopéptido o mureína), y de otros polímeros (polisacáridos, lipoproteínas, etc.) que varían en los diferentes tipos de bacterias (52). Los inhibidores de la síntesis del peptidoglucano se clasifican en tres grupos según el proceso con el que ellos interfieren; los P-lactámicos inhiben las uniones cruzadas y son bactericidas (causan daño irre versible) (52). Todos los P-lactámicos tienen mecanismos de acción similares, pero no idénticos: impiden o interrumpen la maduración del peptidoglucano al inhibir las uniones cruzadas (42, 52). El modelo siguiente para el mecanismo de los efectos irreversibles de los P-lactámicos (lisis celular) se relaciona indirectamente con la interferencia con sus blancos primarios (PBP) (Penicillin-Binding Pro teins, proteínas ligadoras de penicilina, N. del T.) (52): 1. L a in h ib ició n de la actividad de una o m ás enzim as n ecesarias p a ra la síntesis d el p ep tid oglucano (PB P ), lo cual inhibe el d esarro llo bacteriano. 2. Se g en era u n a “ señal” (desconocida) que desen cad en a la lib eració n de ácidos teicoicos e n el m edio. 3. L a p érd id a de los ácidos teicoicos activa u n a o m ás actividades h idrolizantes d el peptidoglucano. 4. E stas activ idades ro m p en las u niones covalentes de la p ared celular, exponiendo la m em b ran a celular. 5. A co n tin u ación h a y lisis o sm ótica de la p a red celular.

Penicilinas Los antibióticos penicilínicos de espectro reducido son activos principalmente contra cocos grampo sitivos y algunos gramnegativos, con poca acción contra bacilos gramnegativos. La penicilina G y la pe nicilina V son ejemplos de antibióticos de espectro reducido (92). Las penicilinas resistentes a la penicilinasa tienen espectros reducidos, pero son activas contra los estafilococos productores de penicilinasa. Las penicilinas inhiben la síntesis de la pared celular; se unen a las proteínas ligadoras de penicilina adyacentes a la membrana citoplasmática y bloquean la reacción de transpeptidación que une las m olé culas de peptidoglucano por medio de puentes de pentapéptidos para proporcionar rigidez estructural a la pared celular (92). Los diferentes antibióticos P-lactámicos pueden tener efecto predominante sobre di ferentes combinaciones de enzimas ligadoras de penicilina (92). Las penicilinas sintéticas (p. ej., meticilina, oxacilina, nafcilina) son resistentes a las penicilinasas pro ducidas por los estafilococos.

Acción de los p-lactámicos Los fármacos p-lactámicos son amidas cíclicas, ejemplos de com puestos heterocíclicos. La penici lina G, la penicilina natural más am pliamente usada, es la penicilina prototipo. Todas las penicilinas comparten la misma estructura básica: ácido 6-aminopenicilánico (6APA), un núcleo de dos anillos com-

Prueba de [3-lactamasa 239 puesto por un anillo de tiazolklina de cinco átomos unido a anillo (3-lactámico inestable de cuatro átomos (106) que posee un grupo amino libre (35, 74) sobre una cadena ac:lo lateral. Las propiedades de la pe nicilina dependen de la cadena lateral en el átomo de carbono 6-p. El radical acídico unido al grupo am i no puede ser degradado por amidasas bacterianas y otras amidasas (35). Los diferentes radicales (R) unidos al ácido aminopenicilánico determinan las propiedades farmaco lógicas esenciales de los fármacos resultantes.

Penicilinas representativas (35,

92)

“R” Radical-las siguientes estructuras pueden sustituir al radical R para producir una nueva penicilina

C H —C —

Penicilina G (benzilpenicilina)-Destruida

por las p-lactamasas Penicilina V (fenoximetilpenicilina)

Meticilina (dimetoxifenilpenicilina)

Cl 0 II

-c-c-

-c—cN\

/ c\ xr x ch3

y O' ------ ' c_'h_c“ 2 / =

=/ \

v_ /

Oxacilina; cloxacilina (un Cl en la estructura); dicloxacilina (2 Cl en la estructura); flucloxacilina (un Cl y un F en la estructura) (Isooxazollpenlcllinas)

0 H -

C-

A OC2H5

Ampicilina (a-aminobenzilpenicilina) Destruida por las p-lactamasas

Nafcilina (etoxinaftamidopenicilina) o

-C — CH — C —

COONa

HO—¿

)c —CH — c — nh7

Ticarcilina

Amoxicilina

240

Pruebas bioquímicas individuales

Por hidrólisis, la P-lactamasa (la penicilinasa) abre los anillos p-lactámicos para producir ácido peniciloico, que está desprovisto de actividad antibacteriana (15), pero que posee el determinante antigénico de las penicilinas y actúa como un hapteno sensibilizante cuando se une a proteínas portadoras (35). El anillo P-lactámico puede abrirse enzimática o químicamente. La cadena lateral del anillo P-lactámico confiere la actividad antibacteriana. El desdoblamiento del anillo p-lactámico a menudo disminuye el pH (15); el ácido peniciloico es más ácido que la penicilina, por eso se encuentra un pH ácido y un cambio de color. Hidrólisis de la penicilina por la acilasa y la p-lactam asa (15, 35, 92, 106)

Anillo P-lactámico

Cadena lateral

Anillo tiazolidina

R— C- NH — HC-

-H C ' —

Sitio de acción de la amidasa

'c:

ch3

I -CH3 CH— COOH

N -

Sitio de acción de la p-lactamasa (penicilinana) Y

Penicilina (ácido 6-aminopenicilánico (6APA))

Acilasa

H2N — HC — HC' RCOOH +

. c^

ch 3

H,0

-CH — COOH

R— C — NH — CH— HC/ S ^ C C f CH3

0= c

| | ^ ch3 HN-------- CH— COOH

OH\ v Anillo p-lactámico abierto Ácido 6-aminopenicilánico

Ácido peniciloico

Cefalosporinas Todas las cefalosporinas se originan a partir de la cefalosporina C; son activas contra S. aureus subesp. aureus resistente a la penicilina, pero son más activas contra las bacterias gramnegativas (52) (para ejem plos de cefalosporinas véase la figura siguiente).

Prueba de (3-lactamasa 241 C efalosporinas representativas (22, 52, 77, 92)

F¡1 De 1a generación

Nombre

Cefalotina

Cefaloridina

Cefapirina

N = C — CH2—

-O C O — CH3

Cefacetril

Cefazolina

De 2a y 3a generación

Cefamandol

Cefuroxima

Cefotaxima

Cefoperazona

C2H5

242

Pruebas bioquímicas individuales

Las cefalosporinas se parecen a las penicilinas, pero difieren de ellas en que el núcleo central es el áci do 7-aminocefalosporánico y el anillo de tiazolidina de cinco átomos está reemplazado por un anillo dihidrotiazina de seis átomos y por un segundo grupo radical (R2) en la posición 3. H idrólisis de la cefalosporina por la acllasa y la p-lactamasa (15, 92)

Cadena lateral

Anillo P-lactámico

Anillo dihidrotiazina

Grupo en la posición 3

R , - C - -NH — CHSitio de acción' de ia amidasa

T2 H £—O— C — CH3

, y C- C

Sitio de acción de la (S-lactamasa (cefalosporinasa)

I COOH

Cefalosporina (ácido 7-aminocefalosporánico)

RCOOH

i COOH Ácido "'-aminocefalosporánico

Ácido cefalosporoico

El mecanismo de acción es comparable al de la penicilina, incluidas la unión a receptores y la inhibi ción de la transpeptidación final del peptidoglucano de la pared celular bacteriana (35). La mayoría de las p-lactamasas comunes tienen un mecanismo basado en la serina, como se ve en la penicilinasa estafilocócica, en los tipos TEM y SHV y en la clase I de enzimas de las bacterias gramnegativas; todos operan con este mecanismo (55): 1. El hidroxilo libre del residuo del anillo P-lactámico se asocia primero de forma no covalente con el anti biótico. 2. Forma el éster acilo covalente con el anillo P-lactámico abierto. 3. A continuación tiene lugar la hidrólisis del éster. Las acilasas microbianas, producidas por muchos microorganismos, degradan las cadenas laterales aci lo de las penicilinas y cefalosporinas susceptibles (102). Las P-lactamasas hidrolizan las uniones amida del anillo P-lactámico de las penicilinas y cefalospori nas susceptibles; tienen un papel importante en la resistencia microbiana a los antibióticos p-lactámicos (15). Los métodos de ensayo microbianos se basan en la pérdida de la actividad antibacteriana después de la hidrólisis del anillo P-lactámico (97). Sin embargo, las P-lactamasas no actúan exclusivamente so bre las penicilinas o cefalosporinas; muchas muestran un predominio de actividad de penicilinasa o de ce falosporinasa (75, 97, 98).

Prueba de [3-lactamasa 243 p-lactamasa de S ta p h y lo co c cu s -Jrlfcas cepas resistentes producen sólo una clase de enzimas (1, 41). Los estafilococos tienen tres P-lactamasas diferentes (42); pueden ser inducibles o constitutivas y están en plásmidos (42). Las P-lactamasas no son activas contra las penicilinas o cefalosporinas resistentes a las penicilinasas (42). Diversos estudios (6, 9, 26, 27,46-51, 72, 85) han dem ostrado que la oxacilina, la meticilina, la nafcilina y la cefalotina son sólo parcialm ente resistentes a la hidrólisis por P-lactamasas estafilocócicas, y el aum ento de la producción podría causar aumento de la resistencia (60). La m eticilina es la penicilina resistente a penicilinasas menos activa (7). L a resistencia a la penicilina se asocia con alte raciones de la pared celular o de las proteínas ligadoras de penicilina (PBP), no con la producción de P-lactamasa (92). La resistencia múltiple norm alm ente es determ inada por plásmidos y adquirida por transducción (92). La composición del medio de desarrollo puede afectar en gran medida cuánta enzima es extracelular (60). Coles y Gross (17) informaron que el fosfato inorgánico libera la enzima ligada a la célula. Kim y Chipley (40) informaron que 5-10% de sal (NaCl) estimula óptimamente la síntesis constitutiva e induci da de p-lactamasa. La liberación de p-lactamasa en el caso de los estafilococos no se debe a daño celu lar; la concentración alta de sal también favoreció la liberación de p-lactamasa (40).

P-lactamasa de Neisseria gonorrhoeae N. gonorrhoeae productora de penicilinasa está ampliamente distribuida (42). En 1976 se informó acer ca de cepas productoras de P-lactamasa mediada por plásmidos en los Estados Unidos (78). En la actua lidad, N. gonorrhoeae productora de penicilinasa (PPNG) es endémica en ciertas regiones de los Estados Unidos (70). Las cepas resistentes producen sólo una clase de enzimas (4). La PPNG produce P-lactamasas de tipo TEM codificadas por plásmidos idénticas a las de los miembros de la familia Enterobacteriaceae y de H. influenzae resistente a la ampicilina (92). En 1983 se informó un brote debido a N. gonorr hoeae resistente mediada cromosómicamente (CMRNG) (33). A diferencia de la PPNG, la CMRNG no puede detectarse por pruebas cromógenas, yodométricas o acidométricas (14, 30, 68, 74).

P-lactamasa de Moraxella catarrhalis Informadas por primera vez en 1977 (57), la mayoría de los aislamientos clínicos de M. catarrhalis producen una P-lactamasa (% 2 3 ,5 6 ,6 1 ,9 5 ) en pequeñas cantidades, la cual permanece fuertemente aso ciada a la célula (24, 32, 36, 45). Es constitutiva y mediada cromosómicamente (20, 23, 32). Las P-lactamasas de M. catarrhalis pertenecen a uno de dos tipos: tipo Ravisio y tipo 1908 (41, 67). El tipo BRO-1 (o tipo Ravisio) es el más común y es constitutivo, positivo con nitrocefina e inhibido por el ácido clavulánico y el sulbactam (20, 31). El tipo BRO-2 (o tipo 1908) se produce en cantidades m e nores, pero es positivo con nitrocefina. M. catarrhalis produce significativamente más actividad contra nitrocefina que contra penicilina o am picilina (32, 96). La prueba de nitrocefina es el procedimiento de elección para la sensibilidad a la peni cilina y a la ampicilina (19, 20, 23, 24, 43, 71, 82, 105); el ensayo cromógeno produce la menor cantidad de resultados falsos negativos. La enzima es más activa contra la penicilina que contra la cefalosporina (20, 23, 32) y es inhibida por el clavulanato (23, 31, 32).

p-lactamasa de Enterococcus faecalis Los enterococos resistentes a la penicilina, descubiertos por primera vez a principios de la década de 1980 (65), son consecuencia de la producción de una P-lactamasa mediada por plásmidos (70). Las cepas producto ras de P-lactamasa parecen fabricar una enzima similar a la enzima mediada por plásmidos encontrada en Staphy lococcus aureus subesp. aureus. Este plásmido es autotransferible, de tal forma que existe la posibilidad de di seminación (62,65,66,76,89,93). Los plásmidos de las P-lactamasas enterocócicas son heterogéneos. La enzima constitutiva ligada a la célula se detecta fácilmente por la prueba de nitrocefina (62,64,76,77).

P-lactamasa de Haemophilus influenzae La mayoría de las cepas resistentes produce sólo una clase de enzima; una p-lactamasa del tipo TEM-1 (94,100) y. con menos frecuencia, ROB-1 (68). Las cepas resistentes a la ampicilina producen P-lactamasas

244

Pruebas bioquímicas individuales

potentes, que son mediadas por plásmidos e idénticas a las encontradas en otras bacterias gramnegativas (92). Cerca de 20-40% de H. influenzae del tipo b producen P-lactamasa (22); sin embargo, debe probar se cualquier aislamiento considerado patógeno. La P-lactamasa de H. influenzae se detecta fácilmente por las pruebas acidométrica (30), yodométrica (14) y cromógena (70, 74).

P-lactamasa del grupo Bacteroides fragilis/Prevotella Bacteroides/Prevotella producen una variedad de enzimas con diferentes especificidades de sustrato: Prevotella melaninogenica y P. oralis son específicas para las penicilinas (penicilinasas) (88) y el grupo B .fragilis para las cefalosporinas (18). El grupo B. fragilis, P. melaninogenicus y P. oralis son los más resistentes de los anaerobios (8). La resistencia a los fármacos P-lactámicos es mediada principalmente por P-lactamasas contra las cefalosporinas; también tienen una capacidad importante para hidrolizar las penicilinas (8).

Inhibidores La mayoría de los inhibidores de P-lactamasas son compuestos P-lactámicos que compiten por la en zima con los antibióticos P-lactámicos (106). El ácido clavulánico, un producto natural de Streptomyces clavuligerus (69, 80), inhibe la actividad de la P-lactamasa estafilocócica, de la mayoría de las p-lactamasas mediadas por plásmidos de los baci los gramnegativos (7) y de algunas enzimas cromosómicas (p. ej., las del grupo B. fragilis con poca acti vidad bacteriana intrínseca). El sulbactam es una sulfona de 6-desaminopenicilina semisintética con actividad antibacteriana dé bil (5, 28) y poca actividad bacteriana intrínseca. Inhibe eficazmente ciertas p-lactamasas mediadas por plásmidos y cromosómicas (7) y es activo contra muchas P-lactamasas de bacterias gramnegativas y grampositivas. Es menos activo que el ácido clavulánico y se considera menos capaz de penetrar en las célu las que el ácido clavulánico. El tazobactam es activo contra P-lactamasas mediadas por plásmidos de bacterias gramnegativas. No existe ninguna diferencia significativa entre el clavulanato y el tazobactam, salvo sus espectros de activi dad. El tazobactam es superior al sulbactam. Inhibidores de las p-lactamasas (106) c h 2oh

COOH

Ácido clavulánico

Estos compuestos son inhibidores irreversibles (28, 80, 81, 83) que forman complejos enzimáticos a d iados irreversibles con la P-lactamasa, lo que lleva a la pérdida de actividad de la enzima (7). Por lo ge neral, estos compuestos no inhiben las bacterias por sí mismos (60).

IV. MÉTODOS DE ENSAYO RÁPIDOS {Nota: Los métodos de ensayo microbiológico se basan en la pérdida de la actividad antibacteriana después de la hidrólisis del anillo P-lactámico (97).) Dado que los antibióticos p-lactámicos inhiben o compiten por la p-lactamasa, la velocidad de form a ción de color es inversamente proporcional a la concentración del antibiótico (7). A. Prueba de la cefalosporina cromógena nitrocefina (63, 74, 104) 1. Principio: en presencia de P-lactamasa y de apertura del anillo p-lactámico, aumenta la conjuga ción del grupo dinitroestirilo en la posición 3 con el anillo dihidrotiazina, con un cambio de color de amarillo a rojo (104). Desplazamiento de electrones en una cefalosporina cromógena (104). 2. Es el más sensible de los tres métodos.

p rueba de (3-lactamasa 245 S o l u c io n e s d e r e a c tiv o s a. B u f f e r d e f o s f a to s , p H 7 F o sfato m o nopotásico, 1/15 M , K H 2P 0 4 F osfato disódico, 1/15M , N a ,H P 0 4 ■ 12H 20 b.

39,2 m L 60,8 m L

S o l u c ió n a c tiv a N itro cefin a en p olvo o PADAC D im etilsu lfó x id o (D M S O ), (C H 3)2SO B u ffer de fosfatos, 0,1 m ol/L , p H 7

5 mg 0,5 m L 9,5 m L

La nitrocefina es una cefalosporina cromógena 87/312 (Glaxo, LTD; Greenford, Middlesex, Inglate rra). Los discos impregnados con nitrocefina están disponibles en el comercio como Cefinase de BBL. La nitrocefina tiene el espectro más amplio de susceptibilidad y sensibilidad de todos los (3-lactámicos dis ponibles en el comercio. No se conoce que reaccione con otras enzimas microbianas y es eficaz para la detección de todas las |3-lactamasas conocidas, incluidas las penicilinasas estafilocócicas (63, 74, 94). c. D iso lv er la n itro cefin a en el d im etilsulfóxido y llevar a 10 m L co n buffer de fosfatos; con cen tració n final 3 00 m g/niL . d. D istrib u ir en alícuotas de 0,2 m L en tubos de ensay o peq u eñ o s (13 x 100 m m ) e. C o n serv ar a -2 0 °C .

Una cefalosporina cromógena alternativa es la PADAC, piridina-2-azo-dimetilanilina cefalosporina (70) (Calbiochem-Behring), desarrollada por Schindler y Huber (90). La PADAC, una cefalosporina cromófora 3-sustituida, cambia de color, de púrpura a amarillo (indicador de pH, púrpura de bromocresol) por acción de la (3-lactamasa (90). La PADAC tiene poca actividad antimicrobiana contra las bacterias gramnegativas, pero buena actividad contra S. aureus, comparable a la nitrocefina (36). Disponible como tiras sumergibles (Behringwerke, Alemania) o polvo y discos (Calbiochem-Behring). Piridin-2-azo-dim etilanilina cefalosporina (37)

Color púrpura

B-lactamasa

ch3

N \

ch3

246

Pruebas bioquímicas individuales

4. Procedimiento; dos opciones a. Método 1 (1) Saturar un disco de papel de filtro W hatman No. 1 (de 7 cm de diámetro) con nitrocefina. (2) Colocar el disco en una placa de Petri cerrada para evitar la desecación. (3) Untar una pequeña ansada o una suspensión densa de una colonia pura del microorganis mo sospechoso sobre el disco impregnado. b. Método 2 (1) Agregar 2 gotas de nitrocefina/cubeta de una placa de microdilución. (2) Inocular cada cubeta con el(los) microoorganismo(s) de prueba. (3) Sellar la placa con tiras de cinta adhesiva de celofán para prevenir la evaporación. 5. Incubación; a temperatura ambiente (22-25°C): la mayoría de las reacciones ocurre dentro de los 30 seg, pero la lectura final del disco debe hacerse a los 15 min a temperatura ambiente (22-25°C) o a la hora a 37°C (15, 34); la reacción puede necesitar hasta 6 h (7). 6. Interpretación a. Positivo (+): presencia de (-lactamasa (1) Nitrocefina: color rojo que se oscurece a un borgoña intenso en 10-30 min. La reacción dé bil tiene un color anaranjado oscuro. (2) PADAC: color púrpura b. . Negativo (-) (1) Nitrocefina o PADAC: el color permanece amarillo. (2) Ausencia de (3-lactamasa. (3) Comprobar los resultados negativos después de la inducción con meticilina; una ansada de un desarrollo de 18 a 24 h alrededor del disco de meticilina (5 (g) (34) o cefoxitina (108). B.

Prueba yodométrica en portaobjeto (86, 104) 1. Principio: el almidón y el yodo reaccionan en solución produciendo un color púrpura. La P-lactamasa hace que el anillo |3-lactámico se abra, con la producción de ácido peniciloico, que reaccio na con el yodo, impidiendo su reacción con el almidón. La presencia de P-lactamasa se indica por la decoloración (o la ausencia de formación) del complejo almidón-yodo (73). La penicilina intac ta (activa) no se une al yodo, en tanto que el ácido peniciloico sí lo hace (54). El ácido peniciloi co actúa como un agente reductor para reducir el yodo en el complejo (15). 2. La prueba es menos sensible que la prueba con nitrocefina cromógena y requiere una muestra de prueba grande. 3. Reactivos a. Solución de almidón (1) 0,4%: disolver 0,4 g de almidón en 100 mL de agua desionizada (2) Autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min, y conservar en el refrigerador (4-10°C). b. Tintura de yodo; dos opciones (1) Opción 1 (a) Buffer de fosfatos, 0,1 mol/L, pH 6,4: 60 mL de buffer pH 6 y 40 mL de buffer pH 7. (b) Ingredientes Y oduro de po tasio (K I) C ristales de yodo (I) B u ffer d e fosfatos, 0,1 m o l/L

1,5 g 0,3 g 100 m L

(2) Opción 2: yodo de Gram (solución usada para la coloración de Gram) Y oduro de po tasio (K I) C ristales de yodo (I) A g u a d esio n izad a

2 g 1g 100 m L

c. Solución de penicilina (1) Agregar a un frasco ampolla de 106 unidades de penicilina 1 mL de agua estéril. (2) Retirar todo el volumen y congelar en alícuotas de 0,15 mL en frascos ampolla pequeños (de 1 dracma). 4. Procedimientos (14) a. Procedimiento 1 (1) Agregar 1,1 mL de tintura de yodo a un frasco ampolla con solución de penicilina. (2) Sobre un portaobjeto de vidrio flameado, emulsionar el microorganismo a ser probado en una gota de la solución de penicilina-yodo; hacer una suspensión densa.

Prueba de (S-lactamasa 247 (3) Agregar 1 gota de solución de almidón, b. Procedimiento 2 (1) Discos impregnados con penicilina-almidón (a) Sumergir los discos de penicilina-almidón en una solución de yodo de Gram hasta que se tom en de un color púrpura intenso uniforme. (b) Eliminar el exceso de líquido y colocar sobre toallas del papel hasta que pierdan su brillo. (2) Colocar el disco impregnado sobre una placa de agar chocolate de aislamiento primario con colonias aisladas del microorganismo sospechoso; asegurar el contacto con la superficie del agar durante 10 min. (3) Quitar el disco que contiene la impronta de las colonias adherida en la parte inferior del pa pel de filtro. Poner en la placa de Petri para observar el aclaramiento del color púrpura. 5. Interpretación: inicialmente, la solución de todas las muestras tomará color púrpura. a. Positivo (+) (1) Solución: aclaramiento del color púrpura a blanco en 5 min; leer a los 1, 10 y 30 min. No es necesario que se decolore toda la mezcla; el aclaramiento de grumos o áreas definidas es suficiente para denotar un resultado positivo. (2) Discos: aclaramiento del color púrpura dentro de 1 min en la vecindad inmediata del aisla miento gonocócico sospechoso. b. Negativo (-): ningún aclaramiento de la solución; la mezcla permanece de color púrpura, lo que indica la formación de un complejo almidón-yodo; el disco permanece de color púrpura. C. Prueba acidométrica (42, 101, 104) 1. Principio: el ácido peniciloico, producido por la apertura del anillo P-lactámico, es más ácido que la penicilina. La alteración (disminución) al pH ácido se detecta usando rojo fenol en presencia de un nuevo grupo carboxilo. 2. La prueba es menos sensible que el método cromógeno con nitrocefina. 3. Reactivo: indicador de pH rojo fenol a. Solución al 0,5%. b. D iluir 2 mL de rojo fenol al 0,5% con 16,6 m L de agua desionizada. 4. Procedimiento: agregar a un frasco ampolla que contenga 20 millones de unidades (106) de peni cilina G (penicilina G potásica tamponada, USP). a. Solución de rojo fenol, 2 mL. b. NaOH, 1 mol/L, gota a gota (0,5 mL) exactamente hasta que la solución vire al rosa, pH 8,5. Se usa una concentración alta de penicilina G para detectar cepas de Staphylococcus aureus subesp. aureus, que son productoras de cantidades bajas de penicilinasa (72). c. Guardar alícuotas a -20°C hasta 1 semana. Los tubos descongelados pueden mantenerse a 4°C durante todo el día de trabajo; los periodos de almacenamiento más largos no son aconsejables debido a la posible hidrólisis de la penicilina. A medida que la penicilina es hidrolizada, en presencia o en ausencia de penicilinasa, el color de la so lución cambia del violeta o rojo profundo (forma básica del rojo fenol) al amarillo (forma ácida). El color de la solución indica adecuadamente la conveniencia de usar las soluciones después del almacenamiento. 5. Procedimientos; opciones a. Método 1 (1) Sumergir el extremo de un tubo capilar (tubo capilar para coagulación de punta azul, 0,50,9 mm de diámetro) en la solución de rojo fenol; llenar el tubo hasta una altura de 1 cm por capilaridad. (2) Raspar con el extremo lleno del tubo capilar una colonia pura de bacterias a ser probadas. D e be formarse un tapón en el extremo del tubo. Tener cuidado de que no quede aire atrapado en tre las bacterias y la solución. El tapón formado debe estar en contacto con la solución. (3) Incubar a temperatura ambiente (22-25°C) durante 1 h en posición vertical, sin que el extre mo del tubo que contiene el tapón de bacterias esté en contacto con ninguna superficie sólida. b. M étodo 2 (1) Discos o tiras (3-lactámicos impregnados con penicilina y el indicador de pH púrpura de bromocresol; disponibles en el comercio.

248

Pruebas bioquímicas individuales

(2) Rehidratar los discos/tiras con una sola gota de solución fisiológica estéril (NaCl) al 0,85% (pH 7,0); seguir las instrucciones del fabricante. (3) Transferir 3-5 colonias aisladas sobre la superficie de los discos/tiras con palillos de madera. (4) Incubar a temperatura ambiente (22-25°C), 1, 10 y 30 min. 6. Interpretación a. Positivo (-i ): cualquier método, color amarillo (acidez); producción de P-lactamasa (penicilinasa) y, por ende, resistente a la penicilina. b. Negativo (-) (1) Rojo fenol: permanece de color rojo. (2) Púrpura de bromocresol: permanece de color violeta-púrpura. V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD Moraxella catarrhalis Neisseria gononhoeae Staphylococcus aureus subesp. aureus

ATCC 43617, 1-3618, 43628 ATCC 49226 ATCC 25923, 29213

VI. PRECAUCIONES A. Generales 1. La interpretación de los ensayos para (3-lactamasas debe tener en cuenta lo siguiente: a) la sensi bilidad de la prueba para las diferentes clases de enzimas p-lactamasa, b) los tipos de (3-lactama sas producidos por los diferentes grupos taxonómicos de microorganismos y c) las especificidades de sustrato de las diferentes (3-lactamasas (79). 2. La prueba de (3-lactamasa debe realizarse para todos los aislamientos clínicamente importantes de H. influenzae y de N. gonorrhoeae. Cada vez se encuentran más cepas productoras de (3-lactama sas resistentes a la penicilina y deben detectarse antes de comenzar el tratamiento antibiótico (42). 3. En cada batería de pruebas deben incluirse cepas de control. 4. Aunque las (3-lactamasas microbianas no actúan exclusivamente sobre las penicilinas a cefalosporinas, muchas muestran un predominio de actividad de penieilinasa o de cefalosporinasa (75, 97, 98); por consiguiente, los métodos químicos o microbianos que usan una penicilina sola o una cefalosporina sola pueden dar resultados falsos negativos para la actividad de (3-lactamasa (3, 25, 29, 38, 53, 59, 87). 5. La importancia de las enzimas producidas por muchas bacterias entéricas (Enterobacteriaceae) es menos clara y estas bacterias no deben probarse para (3-lactamasa (42). B. Prueba de la cefalosporina cromógena nitrocefina 1. Esta prueba debe usarse para Moraxella catarrhalis (42). 2. L a incubación con suero humano puede causar cambio de color con la nitrocefina (74); por consi guiente, la nitrocefina no es conveniente para detectar P-lactamasa en presencia de ciertos líqui dos corporales (15). La T'ADAC no es afectada de manera adversa (no hay cambio de color rela cionado con la enzima) por el contenido de proteína de las muestras (37). O ’Callaghan y col. (74) demostraron resultados falsos positivos con nitrocefina cuando el reac tivo se agregó a cultivos en caldo que eran muy alcalinos (pH 10,0) o que contenían suero, albú mina, fióles, cisterna, glutatión, mercaptoetanol o dimercaprol y recomendaron cautela al probar colonias obtenidas de medios de cultivo que contengan cualquiera de estas sustancias. 3. Los cambios de color con la PADAC ocurren más lentamente que con la nitrocefina (37). 4. La PADAC es un mal agente antimicrobiano contra especies gramnegativas (37). C. Prueba yodométrica en portaobjeto 1. U na vez que se mezclan las soluciones de penicilina y yodo, deben usarse dentro de 1 h para evi tar los resultados falsos positivos (104). 2. La prueba es menos sensible que el método cromógeno y requiere una muestra de prueba grande. D. Prueba acidométrica 1. Prueba menos sensible que el método cromógeno (42). 2. La prueba puede ser incapaz de detectar p-lactam asa presente en cantidades pequeñas y muy liga da a la célula, como la p-lactamasa producida por Staphylococcus saprophyticus. Para estos m i croorganismos es mejor la solución de nitrocefina (7).

Prueba de (3-lactamasa 249 3. La separación de la cadena lateral acilo de los antibióticos (3-lactáinicos a menudo disminuye el pH y reduce la actividad antibiótica; por ende, los métodos acidométricos no pueden diferenciar la actividad de P-lactamasa de la actividad de acilasa (99). 4. Guardar las alícuotas a (20°C hasta 1 semana. Pueden conservarse los tubos descongelados a 4°C durante todo el día de trabajo; los períodos de almacenamiento más largos no son aconsejables de bido a la posible hidrólisis de la penicilina. E. S ta p h y l o c o c c u s 1. Estudios previos han demostrado que la P-lactamasa estaíilocócica, cuando está presente en can tidades suficientes durante el tiempo suficiente, hidroliza lentamente las penicilinas resistentes a la penicilinasa (PRP) y las cefalosporinas (6, 9, 26, 27,46-51, 72, 85). Algunos S. aureus subesp. aureus producen grandes cantidades de P-lactamasa, que puede inactivar lentamente las denomi nadas PRP (60). Es necesario el agregado de cloruro de sodio para estimular el desarrollo y la de tección posterior de estafilococos heterorresistentes, pero esta sal puede estimular al mismo tiem po la producción y la liberación de P-lactamasa (60). 2. Aunque la inmensa mayoría de los estafilococos resistentes a la penicilina deben su resistencia a su capacidad de producir penicilinasa (16), algunas cepas son resistentes por otras razones (91). 3. Siempre hay que hacer una prueba que dependa de la inhibición del desarrollo para estar seguro de que no se está trabajando con una cepa resistente a una meticilina rara. 4. La P-lactamasa inducida por la exposición a las penicilinas no es activa contra cefalosporinas ni contra las penicilinas resistentes a la penicilinasa, como la meticilina y la nafcilina, a menos que se produzca en grandes cantidades (42). 5. Generalmente las P-lactamasas producidas por S. aureus subesp. aureus sólo inactivan la penicili na, no las cefalosporinas (52). F. N e is s e r ia g o n o r r h o e a e 1. En 1983 hubo un brote de gonorrea debido a N. gonorrhoeae resistente m ediada por cromosom a (CM RNG) (33). A diferencia de la PPNG, la CM RNG no p u ed e detectarse por screening para P-lactamasa (33). 2. Todo aislamiento clínico de V. gonorrhoeae en zonas donde se están usando tratamientos diferen tes de la cefhiaxona debe controlarse en lo que respecta a la resistencia a la penicilina (70). Koneman y col. (42) recomiendan probar todo aislamiento clínicamente significativo. 3. Algunas cepas son resistentes a la penicilina por mecanismos no enzimáticos (84) y también de ben realizarse las pruebas de sensibilidad si el tratamiento falla (42). G. H a e m o p h il u s in f lu e n z a e 1. Cuando se realizan pruebas para P-lactamasa, es sumamente importante probar más de una colo nia (alrededor de 10 colonias) de la placa de cultivo, ya que pueden recuperarse cepas p-lactama sa positivas y P-lactamasa negativas simultáneamente de una m isma muestra (44). 2. La prueba de P-lactamasa debe hacerse para todo aislamiento considerado patógeno (42). 3. Los informes ocasionales de cepas no productoras de P-lactam asa deben com probarse contra ampicilina por medio de una prueba de sensibilidad por difusión o por dilución (10). Las cepas P-lactamasa negativas no necesariamente son sensibles a la ampicilina, ya que por lo menos un porcentaje pequeño de cepas de H. influenzae son resistentes a la ampicilina por un mecanismo di ferente de la producción de P-lactamasa TEM-1 (68). H. M o r a x e lla c a ta r r h a li s 1. La prueba de nitrocefina no puede diierenciar las cepas de tipo BRO-1 (tipo Ravisio) de las de ti po BRO-2 (tipo 1908); todas las cepas productoras de P-lactamasa deben interpretarse e informar se como resistentes a la penicilina (70). 2. El ensayo cromógeno tiene la proporción más baja de resultados falsos negativos. 3. La P-lactamasa de M. catarrhalis se produce en cantidades pequeñas y permanece fuertemente aso ciada a la célula (32,45); los ensayos convencionales para detectar la actividad de P-lactamasa en aislamientos clínicos podrían conducir a resultados falsos negativos (24, 36). Algunos estudios mostraron 36% de resultados falsos negativos con la prueba yodométrica, 31 % con la PADAC y la más exacta (4%) fue la prueba de nitrocefina (24). No todas las cepas productoras de P-lactamasa de M. catarrhalis son igualmente reactivas en cada uno de los ensayos para P-lactamasas (24). En lo que respecta al tiempo necesario para detectar resultados positivos, la sensibilidad de la nitrocefina en tubo es igual a la del disco; nitrocefina > disco de PADAC > acidométrica en disco> acidométrica en caldo > prueba yodométrica (24).

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Pruebas bioquímicas individuales

I . E n te r o c o c c u s f a e c a l i s 1 Ciertos aislamientos de enterococos productores de fS-lactamasas no se detectan de manera con fiable por las pruebas de sensibilidad de rutina (7). 2. E. faecalis es moderadamente sensible a las penicilinas y casi totalmente insensible a la mayoría de las cefalosporinas (52).

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CAPI TULO

Prueba de lecitinasa

I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de los microorganismos para producir la enzima lecitinasa, evidenciada por la aparición de opacidad en la yem a de huevo (12, 21) o de turbidez en el suero (20,22).

II. OBJETIVO

____

(Véanse también caps. 43 y 44) A. Identificación de anaerobios: principalm ente útil en la identificación de especies de C lostridium : C. perfringens (+), C. bifermentans (+), C. sordellii (+), C. baratii (+), C. haemolyticum (+), C. ghoni (+), C. limosum (+) y C. novyi A y B (V, variable, por lo general +) de otras especies de Clostridium aisladas con mayor frecuencia (-) con esporas subterminales (1, 1 2 ,1 3 ,1 6 , 20). B. Ayudar en la identificación de especies de Bacillus: diferenciación de B. anthracis (+), B. cercus (+), B. mycoides (+) y B. licheniformis (+) de otras especies de Bacillus (-) (17). C. Ayudar en la identificación de la mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus subesp. aureus tipificables por fa*gos (10). Las bacterias no fom entadoras productoras de lecitinasa activa son hemolíticas para los eritrocitos humanos (23).

III. BIOQUÍMICA Hayward (12) fue la prim era en reconocer el valor de la opalescencia en la identificación de Clos tridium perfringens (antes C. welchiiy, esta autora se refirió a la prueba como reacción de Nagler. La prueba de N agler es una prueba para la antitoxina de C. perfringens. M acFarlane y Knight (19) dem os traron que la a-to x in a de C. perfringens es una lecitinasa, que ellos denominaron lecitinasa C (EC 3.1.4.3), responsable de la reacción de lecitinasa en agar yem a de huevo y del halo turbio de hem olisis en agar sangre.

Lecitinas Las lecitinas se clasifican como fosfoglicéridos o fosfátidos (fosfolípidos), un grupo de compuestos que contienen ácidos grasos, ácido fosfórico, glicerol y colina (14). Son ásteres de glicerilo (diglicéridos) de dos moléculas de ácidos grasos de cadena larga (R y R ’) unidas en su tercer carbono al éster de colina del ácido fosfórico (ácido fosfatídico, H3P 0 4), que a su vez está unido por una unión éster a una base nitrogenada, la colina (un alcohol aminado); CH2(R)CH(R’)CH2O PO(OH)0(CH2N(OH)(CH2))3 (11,14,31).

Lecitinasa C Willis (28) demostró acciones de cuatro tipos de lecitinasa; sin embargo, la lecitinasa C es la produci da habitualmente por las bacterias. La lecitinasa C (también llamada fosfolipasa C, fosfatidasa D o fosfatidilcolina-colinafosfohiderolasa) pertenece a la clase general de enzimas conocidas como fosfodiéster hidrolasas (16). Las lecitinasas (o fosfolipasas) A, B y D también degradan la lecitina, pero la hidrolizan en sitios diferentes de la molécula, con la producción resultante de sustancias diferentes de la fosforilcolina

Pruebas bioquímicas individuales

255

y el diglicérido (16, 27). La lecitinasa C hidroliza la lecitina y otros f^sfolípidos como esfmgomielina, fosfatidiletanolamina, cefalina y tromboplastina (26). La fosfatidasa D actúa sobre las moléculas del fosfátido lecitina e hidroliza uniones éster específicas; el grupo fosforilcolina es eliminado de la posición 3 para producir un 1,2-diglicérido (a.fl-diglicérido) (11). Hidrólisis de la lecitina (3,1 1)

O h 2c — o

—c —r

o —c — H

- Fosfatidasa D

H2C L-a- lecitina (fosfatidilcolina)

Lecitinasa C (fosfatidilcolina colinafosfohidrolasa)

h 2c — o

O II

—c —r

h 2c o h

1,2-Diglicérido (a.p-diglicerido, a grasa)

Fosforilcolina

Factor de la yema de huevo La lecitina es un componente normal de la yem a de huevo; el componente lipoproteico de la yem a de huevo, la lecitovitelina (LV) puede obtenerse como un líquido amarillo límpido mezclando yema de hue vo con solución fisiológica (5). Cuando la combinación yema-solución fisiológica se mezcla con ciertas toxinas o lecitinasas bacterianas, el líquido se tom a opalescente y a continuación puede haber floculación y separación de una cuajada espesa de grasa (5). La lecitinasa, o factor de la yem a de huevo, actúa sobre el componente lipoproteico de la yema de hue vo; la hidrólisis de la lecitina libera fósforo y colina en etapas y la precipitación de grasas insolubles (diglicéridos) produce la opalescencia (23). Un halo opapo rodea las colonias que crecen en medios que con tienen yem a de huevo (2). Willis y Gowland (29) estudiaron el mecanismo de producción de opacidad y demostraron que la opa lescencia se debía a una combinación de tres factores: 1. Las grasas (diglicéridos) producidas por la degradación de la lecitina. 2. Las grasas libres de la emulsión de la yema de huevo después de la degradación de la lecitina (que estabiliza la emulsión dé la yema de huevo). 3. Las proteínas insolubles en agua de la yema de huevo (vitelina y vitelenina) que precipitan las grasas libres.

256

Pruebas bioquímicas individuales

MacFarlane y col. (20) afirman que la opalescencia causada por la a-to x in a (lecitinasa C) se debe a la liberación de grasa libre a partir del suero o de la lecitovitelina; la reacción con la lecitovitelina es más rápida y más sensible que con el suero.

IV.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

(Nota: existe una cantidad de medios de cultivo con agar yema de huevo (EYA) que están disponibles; la elección depende de la preferencia del laboratorio y/o de los microorganismos a probar.) Cualquier medio de desarrollo conveniente (p. ej., tripticasa soja agar (TSA), agar infusión de cerebro y corazón (BHI), agar soja caseína) enriquecido con 10% de yema de huevo puede ser usado para las bac terias aerobias (23). A. Emulsión de yema de huevo 1. Preparación desde el principio a. Limpiar y luego sumergir huevos de gallina libres de antibióticos en etanol al 95% (alcohol etí lico) durante 1 hora. b. De manera aséptica aspirar o separar la yema de huevo. c. Agregar 1 yem a de huevo a 500 mL de agar base. d. Con una pipeta estéril, revolver para hom*ogeneizar la suspensión. 2. Existe emulsión de yema de huevo disponible en el comercio.

B. Agar anaerobio de lecitina-lactosa (agar de lecitina-lactosa para anaerobios) 1. Fórmula modificada de Ellner y O ’Donnell (8). 2. Es selectivo debido a los inhibidores azida sódica y sulfato de neomicina. Inhibe las bacterias gramnegativas; bacilos grampositivos aerobios. Los cocos grampositivos se atenúan notablemente (sus pendidos). Diferenciación por la capacidad de fermentar la lactosa y/o producir lecitinasa; princi palmente para las especies histotóxicas de Clostridium. 3. Ingredientes a. Solución de calcio-cisteína Cisterna . HC1 Cloruro de calcio, CaCl2 • 2H20 Agua desionizada Acidificar con ácido acético glacial, CH3COOH, 99, 4%, USP

..5 g 0,5 g 100 mL 1gota

Emulsión de lecitina Lecitina de huevo Agua desionizada

3,3 g 100 mL

Ajustar a pH 7 con NaOH 0,1 N c. Agar base Columbia, pH 7,4 ± 0,2 (24) Digerido pancreático de caseína Digerido péptico de tejido animal Extracto de levadura Extracto de carne Almidón de maíz Cloruro de sodio, NaCl Agar Agua desionizada

12 g 5g 3g 3g 1g 5g 13 g 1.000 mL

4. Fórmula original (8), pH 6,7 ± 0,2: a 1 L de agar base Columbia (46,6 g/L) agregar Lactosa Azida sódica, NaN3 Púrpura de bromocresol (solución alcohólica (etanol) al 1,25%)

10 g 0,2 g 2 mL

Después de la esterilización enfriar y agregar: Sulfato de neomicina, estéril Solución de calcio-cisteína, estéril Emulsión de lecitina, estéril 5. Fórmula alternativa (24), pH 6,8 + 0,2

0,15 g 10 mL 20 mL

Prueba de lecitinasa 257 Digerido pancreático de caseína Digerido péptico de tejido animal Digerido pancreático de músculo cardíaco Extracto de levadura Almidón de maíz Cloruro de sodio, NaCl Lactosa Azida sódica, NaN3 L-Cisteína • HC1 Cloruro de calcio, CaCl • 2PLO Agar Lecitina de huevo Púrpura de bromocresol (BCP) Agua desionizada

12,65 g 5,5 g 3,3 g 3,85 g Ug 5,5 g 10 g 0,2 g 0,5 g 0,05 g 15 g 0,66 g 25 mg 1.000 mL

Agar anaerobio de lecitina-lactosa, modificado a. Fórmula de Ellner, Granato y May (7) b. Ingredientes, pH 7 ± 0,2 Peptona de caseína/came (50/5d)) Peptona de caseína/levadura (50/50) Peptona de corazón Lactosa Almidón de maíz Cloruro de sodio, NaCl Azida sódica, NaN3 L-Cisteína • HC1 Cloruro de paladio, PdCl2 Ditiotreitol Sulfato de.magnesio, MgS04 • 7H20 Tris (hidroximetil) aminometano Tris (hidroximetil) aminometano • HC1 Cloruro de calcio, CaCl2 • 2H20 Lecitina Púrpura de bromocresol (BCP) Agar Agua desionizada

10g 10g 3.0g 10g 1g 5g 0,2 g 0,5 g 0,33 g 0,1 g 0,01g 1,66 g 5,75 g 0,01 g 0,66 g 0,025 g 13,5 g 1000 mL

Después de la esterilización, enfriar y agregar: Sulfato de neomicina, estéril

0,015 g

{Nota: el PdCl2 (cloruro paladioso, dicloruro de paladio) y el ditiotreitol, también conocido como reacti vo de Cleland, son agentes reductores. El tris (hidroximetil) aminometano (THAM; 2-amino-2-hidroximetil -1,3-/-1 ,3-propanodiol; buffer de tris amina) es (CH2OH)3CNH2.) C.

Agar anaerobio de lecitina-lipasa (agar de lecitina-lipasa para anaerobios, agar de McClungToabe modificado) 1. M odificación del agar de McClung y Toabe (21). 2. Objetivo: aislamiento y diferenciación de especies de Clostridium por su capacidad de producir le citinasa y/o demostrar actividad de lipasa; el medio más ampliamente usado para la detección de la actividad de lecitinasa (21); apoya el buen desarrollo de diversos clostridios y da halos más in tensos de opacidad que los medios de cultivo con suero 3. Ingredientes, pH 7,6 ( 0,2 Peptona de caseína Extracto de levadura Glucosa (dextrosa) Cloruro de sodio, NaCl Fosfato monopotásico, KH2P 04 Posfeto disódico, Na2HP04 • 12HzO Sulfato de magnesio, MgSG4 • 7H20 Agar Agua desionizada

40 g 5g 2g 2g 1g 5g ' 0,1 g 25 g 1.000 mL

D espués de la esterilización, enfriar y agregar: Suspensión de yema de huevo

100 mL

258 D.

Pruebas bioquímicas individuales Agar para Clostridium difficile (agar cicloserina-cefoxitina-fructosa-yema de huevo (CCFA))

1. Fórmula de George, Sutter, Citron y Finegold (9). 2. Es selectivo debido a los inhibidores antimicrobianos cicloserina y cefoxitina, que inhiben espe cies de Bacillus y de Pseudomonas, la mayoría de los cocos (excepto Enterococcus faecalis), la mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae, los clostridios (excepto C. difficile) y los bacilos anaerobios gramnegativos no formadores de esporas. 3. Con yema de huevo: diferencia por la capacidad de producir lecitinasa y lipasa. 4. Ingredientes, pH 7,2 + 0,2 (24) Digerido péptico de tejido animal Fructosa Fosfato monopotásico, KH2P04 Fosfato disódico, Na2HP04 Cloruro de sodio, NaCl Sulfato de magnesio, MgS04 • 7H20 Rojo neutro (NR) Agar Agua desionizada

32 g 6g 1g 5g 2g 0,1 g 0,03 g 20 g 1.000 mL

Después de la esterilización, enfriar y agregar: Cicloserina (C), estéril Cefoxitina (C), estéril Suspensión de yema de huevo en solución fisiológica, 50%, estéril,

500 (g/mL 16 (g/mL 5 mL

Agar yema de huevo de McClung-Toabe modificado por los CDC (1) 1. Fórmula de Lombard, Thompson y Armfield (6) de los Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, GA, EE.UU 2. Agar no selectivo de enriquecimiento usado para el aislamiento primario de la mayoría de las bacterias anaerobias de muestras clínicas. 3. Ingredientes, pH 7,4 ± 0,2 Digerido pancreático de caseína Extracto de levadura D-Glucosa (dextrosa) Cloruro de sodio, NaCl Fosfato de sodio, Na2HP04 • 12H20 Sulfato de magnesio, MgSÓ4 • 7H20, solución acuosa al 5% Agar Agua desionizada Suspensión de yema de huevo

40 g 5g 2g 2g 5g 0,2 mL 25 g 900 mL 100 mL

{Nota: el agar con tripticasa y soja (TSA), 72 g/L, puede sustituir el digerido pancreático de caseína y el extracto de levadura.) E. Método de esterilización 1. Base: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. 2. Solución de calcio-cisteína, emulsión de lecitina con suspensión de yema de huevo: filtración (Millipore). G. Distribuir: en placas de Petri, 15-20 mL/placa (15 (1 0 0 mm). H. Aspecto del medio terminado sin sembrar 1. Agar anaerobio de lecitina-lactosa: medio en placa de color púrpura. 2. Agar anaerobio de lecitina-lipasa: medio en placa de color amarillento. 3. Agar para C. difficile: medio en placa de color anaranjado. I. Conservación 1. Los m edios de cultivo, la solución de calcio-cisteína y la em ulsión de lecitina: en refrigerador, 2-8°C; con placas invertidas (tapas hacia abajo). 2. Fecha de vencimiento a. Agar anaerobio de lecitina-lactosa: medio terminado, aproximadamente a las 2 semanas (8). b. Agar anaerobio de lecitina-lipasa: aproximadamente a las 2-4 semanas. c. Agar para C. difficile con cicloserina y cefoxitina: no más de 5-7 días (30). d. Agar de las CDC: aproximadamente a las 6-8 semanas. J. Inoculación 1. Reducir previamente las placas por incubación con GasPak durante 24 h. 2. Desarrollo de un cultivo puro.

Prueba de lecitinasa 259

Directa; estriar en cuatro cuadrantes para el aislamiento máximo. Incubación: en anaerobiosis, 35°C, 48-72 h; placas invertidas (tapas abajo).

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD Probar cada lote nuevo de placas de agar yema de huevo (EYA) (2) (cuadro 20-1).

Cuadro 20-1. Microorganismos utilizados para el control de calidad Especies

ATCC

638 13124 9689 6008 3584

Clostridium bifcrmentans Clostridium perfringens Clostridium difficile Clostridium septicum Closl'idium spomgenes

Lecitinasa

Lactosa

Lipasa

+ +

No inoculado VI. RESULTADOS Véanse figuras. 20-1 y 20-2 -Apéndice 1) para los resultados en fotográficos color. Vil. INTERPRETACIÓN (Véase cuadro 20-2)

A. Actividad de lecitinasa 1. Positiva (+): halo opaco, opalescente (blanco lechoso) que rodea algunas colonias; el precipitado insoluble se ve mejor al trasluz (1,17). 2. Negativa (-): ningún halo opaco en el medio de cultivo. B. Fermentación de la lactosa 1. Positiva (A): halo amarillo que rodea las colonias; condición ácida. 2. Negativa (-): ningún cambio de color en el medio que rodea las colonias. C. Lipasa positiva (+): brillo iridiscente en la superficie del desarrollo (véase cap. 22, Prueba de lipasa).

Cuadro 20-2. Especies de Clostridium: reacciones de lecitinasa, lipasa y lactosa en medios de cultivo con vema de huevo______________________________________________________ Especies

Lecitinasa

Lecitinasa, lactosa, lipasa negativos — C. aminovalericum C. argentinense? — C. cadaveris C. difficile C. glycolicum — C. hastitoime C. histolyticum C. malenominatum C. novyi C. putrefaciens C. putriticum C. symbiosurrP -

Lecitinasa positivos/lactosa positivos/lipasa C. perfringens C. baratiP6

Lactosa

Lipasa

—

A A

—

— —

— +

negativos

+ +

Lecitinasa positivos/lactosa n e g a W o s/lip asa variable + C. bifermentansP + C. ghoni + C. haemolyticum + C. limosum + C. novyi A + C. novyi B

— -

— —

(cont.)

260

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 20-2 Especies de Clostridium: reacciones de lecitinasa, lipasa y lactosa en medios de cultivo con yem a de huevo (cont.) Especies

Lactosa

Lipasa

Lecitinasa negativos/lactosa negativos/lipasa positivos C. cochlearium C. sporogenes

+ +

Lecitinasa negativos/lactosa positivos/lipasa negativos C. bijerinckii C. butyricum — C. celatum C. chauvoei C. dostridioformeP C. indolis C. oroticum C. paraputrificum — C. ramosum C. sartagoforme C. septicum C. sphenoides C. spiroforme C. tertium

A A A A A A A A A A A A Aw A

— -

V V+ V V

C. sordelliF

Lecitinasa +

Lecitinasa, lactosa, lipasa variables V C. botulinum C. carnis C. fallax C. innocuum C. leptum V C. subterminale C. symbiosum C. tetani

_ -

V, variable; V+, variable, por lo general positivo; A, producción de ácido; Aw, producción de ácido débil. aAntes C. botulinum G, algunos C. hastiforme no tóxicos y C. subterminale. b Antes Fusobacterium symbiosum. c Nagler positivo. dAntes C. barti, C. perenne, C. paraperfringens. eAntes C. clostrídiiforme.

VIII. PRECAUCIONES A. Generales 1. Un aclaramiento ligero alrededor de la marca del inoculo es resultado de la proteólisis y debe ig norarse (15). 2. La reacción puede inhibirse agregando ciertos sueros antitóxicos o antilecitinasa a la superficie del medio antes de la siembra (5). Los huevos deben provenir de gallinas que no reciben antibióticos, para evitar la inhibición del desarrollo (26). 3. Al probar no termentadores para la actividad de lecitinasa, se debe tener presente la relación de temperatura del microorganismo; por ejemplo, Pseudomonas fluorescensy Acinetobacterhaemolyticus crecen más rápido y con mayor abundancia a temperatura ambiente (22-25uC) que a 35°C; en tanto que la relación inversa es cierta para Pseudomonas aeruginosa y P cepacia (23). 4. MacFarlane y Knight (19) determinaron un pH óptimo para la enzima de 7-7,6; la actividad es es timulada por los iones de calcio. 5. Los microorganismos lipolíticos pueden producir pequeños halos de opacidad (4). 6. La capa lipasa positiva, iridiscente, “perlada” en el borde del desarrollo debe ignorarse y no regis trarse porque la actividad es inconstante dentro de 'as especies (23). 7. Los clostridios y las especies de Bacillus producen halos grandes (4-5 mm) de opacidad que se ex tienden desde el borde del desarrollo; los no Termentadores producen halos pequeños (1-2 mm) de opacidad (23), 8. El factor lecitinasa de los clostridios es una a-to x in a, que se demuestra en forma óptima cuando el medio se complementa con iones magnesio (Mg); por ejemplo, MeClung-Ttíabe EYA, que con tiene magnesio usado por aerobios y anaerobios (23).

Prueba de lecitinasa 261 B. Staphylococcus 1. La mayoría de las cepas de S. aureus subesp. aureus producen una reacción en la yem a de huevo, pero alrededor de una cuarta parte de los estafilococos coagulasa negativos también lo hacen; por consiguiente, la opacidad no es de gran valor para los estafilococos (23). 2. El agregado de yema de huevo al medio Staphylococcus 110 no distingue estafilococos coagulasa negativos de coagulasa positivos (18). C. Agar anaerobio de lecitina-Iactosa 1. A veces son necesarias 24 horas de incubación adicional para que se produzcan reacciones bien definidas (8). 2. En ocasiones, los cocos grampositivos crecen como colonias puntiformes sin reacción ni cambio de color en el agar salvo un color amarillo que a veces se ve alrededor de las colonias de enterococos atenuadas (8).

D. Agar para Clostridium difficile (agar CCFA) 1. La morfología típica de Gram de C. difficile en la coloración de Gram puede no ser evidente en es te medio; puede ser necesario hacer varios pasajes en agar sangre (BA) para lograr una morfolo gía compatible con C. difficile. Los antimicrobianos cicloserina y cefoxitina producen una m arca da elongación de las células y la pérdida de las esporas en la coloración de Gram (9). Habitualmente un solo pasaje en BA restaura la morfología característica (9). 2. El desarrollo de C. difficile puede ser inhibido por algunas cepas de lactobacilos y enterococos (25). Asimismo, la presencia de C. difficile puede inhibir algunos Bacteroides, Peptococcus y Peptostreptococcus (25). 3. C. difficile es negativo para las actividades de lecitinasa y de lipasa; por consiguiente, no se ha es tablecido la necesidad del agar yema de huevo en un medio selectivo para el aislamiento de C. dif ficile (30).

REFERENCIAS 1. Balows A, Hausler WJ Jr, Herrmann KL, et al Manual of Clinical Microbiology, ed 5 Washington, DC:Ame rican Society for Microbiology 1991:431,498,500, 1236. 2. Baron EJ, Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnostic Microbiology,, ed 8. St Louis: CV Mosby, 1990:494. 3. Blazevic DJ, Ederel GM. Principles of Biochemi cal. Tests in Diagnostic Microbiology NewYork: J ohn Wiley & Sons, 1975:69-71. 4. Branson D. Methods in Clinical Bacteriology, Springfield, IL: Charles C Thomas, 1972:28-29. 5. Cowan ST. Cowan & Steel’s Manual for the Identi fication of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: Cam bridge University Press, 1974:37. 6. Dowell VR Jr, Lombard GL, Thompson FS, Armfield AY. Media for isolation characterization and identification of obligately anaerobic bacteria. CDC Laboratory Manual, publ no. CDC-530-009/64745. Atlanta, GA: Centers for Disease Control, reprinted 1987. 7. Ellner PD, Granato PA, May CB. Recovery and identification of anaerobis: Á system suitable for the routine clinical laboratory. Appl Microbiol 1973;26(6):904-913. 8. Ellner PD, O’Donnell ED. A selective diferential medium for histotoxic Clostridia. Am J Clin Pathol 1971 ;56(2): 197-200. 9. George WL., Sutter VL., Citron D, Finegold SM. Selective and differential medium for isolalion of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 1979;9(2): 214-219. 10. Graber CD, Boltjes BH, Morillo M. Comparison of the slide and coagulase-manuitol agar methods for adducing staphylocoagulase. Am Med Technol 1968;34(4):211-214.

11. Harrow B, Mazur A. Textbook of Biochemistry, ed 9. Philadelphia: WB Saunderes, 1966 :277, 279-280. 12. Hayvard NJ. Rapid identification of Cl. welchii by the Nagler reaction. Br Med J 1941; 1:811-814. 13. Hayward N. The rapid identification of Cl. welchii by the Nagler tests in plate cultures. J Pathol Bacte rid 1943;55:285-293. 14. Holum JR. Elements of General and Biological Chemistry, ed 4. New York: John Wiley & Sons, 1975:340. 15. Howard BJ, Klaas JII, Rubin SJ, et al. Clinical and Pathogenic Microbiology. St. Louis: CV Mosby, 1987:339, 346. 16. Ispolotovskaya MV. Type A Clostridium perfringens toxin. In: Kodis S, Montie TC, Ají SL, eds. Mi crobial Toxins, vol 2A New York: Academic Press, 1971: 109-158. 17. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, • ed 4. Philadelphia: JB Lippincott, 1992:476-477, 546, 592. 18. Koskitalo LD, Milling ME. Lack of correlation bet ween egg yolk reaction in Stuphylococcus medium 110 supplemented with egg yolk and coagulase ac tivity of staphylococci isolated from cheddar chee se. Can J Microbiol 1969;15: 132-133. 19. MacFarlane MG, Knight BCJG The biochemis try of baterial toxins. 1. The lecithinase activity of Cl. welchii toxins. Biochem J 1941 ;35(8):884902. 20. MacFarlane RG, Oakley CL, Anderson CC Hae molysis and the production of opalescence in serum and lecitho-vitellinby the a-toxin of Clostridium wel chii. J Pathol Bacterid 1941;52: 99-103.

262

Pruebas bioquímicas individuales

21. McClung LS, Toabe R. The egg yolk plate reaction for the presumptive diagnosis of Clostridium sporogenes and certain species of the gangrene and botulinum groups Bacteriol 1947;53(2): 1 39-147. 22. Naglel FP. Observations on a reaction between the lethal toxin ol Cl. welchii (type A) and human semm. Br J Exp Pathol 1939;20(6):473-485. 23. Oberhofer TR. Manual of Nonfermenting Gram-Ne gative Bacteria. New York: John Wiley & Sons. 1985:73-77. 24. Power DA, McCuen PJ. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures, ed 6. co*ckeysville, MD: Becton Dickinson Microbiology Systems, 1988: 135,137,175. 25. Rolfe RD, Helebian S, Finegold SM. Bacterial in terference between Clostridium difficile and normal fecal flora. J Infect Dis 1981;143(3):470-475.

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CAPÍ TULO *

►

Prueba de leucina aminopeptidasa (leucina arilamidasa) (LAP) I.

PRINCIPIO Detectar la presencia de la enzima leucina aminopeptidasa (LAP).

II.

OBJETIVO

Caracterización preliminar presuntiva de cocos grampositivos, catalasa negativos, de los géneros de estreptococos, de enterococos y de microorganismos similares a los estreptococos (4). La LAP se usa a menudo junto con la PYR y otras pruebas bioquímicas (cuadro 21-1).

Cuadro 21-1. C a ra c te rís tic a s Streptococcus

Streptococcus, Enterococcus y

H id ró lisis de esculina

D e sa rro llo en N a d a ! 6,5%

Vancom icin a

+ +

s s s

+ -

V V

+ +

M ic ro o rg a n is m o

C a talasa

B e ta (p) Streptococcus S. pneum oniae S. pyogenes, grupo A

Otras especies de (b) Streptococcus Especies de Enterococcus, grupo D Aerococcus A. viridans A. urinae Alloiococcus otitis Gemella G. hemolysans G. m orbillorum Globicatella sanguis Helcococcus kunzii Especies de Lactococcus Especies de Leuconostoc

d e m ic ro o rg a n is m o s s im ila re s a

LAP

PYR

+ + +

V+

s s

+ + +a

_l_wb

+ + -

+ + +

V V

+ +

+ + + -

s s s

+ + -

V -

s s

Estreptococos variantes desde el punto de vista nutricional Abiotrophia adiacens Abiotrophia defectiva Especies de Pediococcus Especies de Tetragenacoccus Especies de Vagacoccus

+ NR

(Datos de la referencia 2.) NR, ningún resultado; +w, positivo débil; S, susceptible (sensible); R, resistente. a Puede necesitar 2-7 días. b Deben usarse inóculos abundantes.

V NR

S S

264 III.

P ruebas bioq uím icas individuales

ENZIMA/SUSTRATO

Enzima La leucina aminopeptidasa (LAP) (leucina arilamidasa) es una exopeptidasa que hidroliza una unión peptídica adyacente a un grupo amino libre. Se denomina leucina aminopeptidasa porque reacciona más rápidamente con los compuestos de la leucina (6).

-NH-

Leucina-aminopeptidasa

R es una leucina u otra cadena lateral alifática. Las aminopeptidasas requieren un gmpo NH 2 terminal libre y dependen de iones metálicos para su ac tividad; la degradación de la cadena libera el aminoácido (hidrólisis) (1). La desaminación inicia la de gradación del aminoácido; empieza con la adición de agua (H20 ). La leucina aminopeptidasa es una peptidasa activada por metales (Mn2+ o M g2+). Los iones metálicos se unen firmemente y son necesarios para la actividad enzimática. El metal forma un puente entre el sustrato y la enzima.

IV.

REACTIVO p-DIMETILAMINOCINAMALDEHÍDO (DMACA)________________________

(Nota: El mismo reactivo se usa para la prueba de pirrolidonil-P-naftilamida (PYR) (cap. 37).) A. Propiedades 1. El p-dimetilaminocinamaldehído (DMACA) es un análogo vinflico del p-dimetilaminobenzaldehído (DMABA). 2. No es un colorante ni una tinción, pero es un reactivo acoplado que forma una base de Schiff cuan do se combina con aminas en condiciones ácidas. 3. Solución ácida; concentración, 1% en ácido clorhídrico (HC1) concentrado al 10% 4. Preparar nuevo cada 2 meses.

B. Química de acción del reactivo El reactivo LAP es una solución ácida que contiene un detergente que forma una base de Shiff roja con la P-naftilamina libre. La P-naftilamina no es reactiva porque el gmpo amino está incluido en la unión amídica. 1. Paso 1 La leucina-P-naftilamida es hidrolizada por la leucina aminopeptidasa, para dar P-naftilamina libre. 2. Paso 2 El color aparece cuando se produce el gmpo azo cromóforo -N = N - como resultado de la unión de los ñafióles o de la naftilamina liberados enzimáticamente (3). PASO 1 leucina aminopeptidasa

Leucina-p-naftilamida—

----------------- w Leucina +

...___

P-naftilamina libre

hidrólisis enzimática

Sustrato

C5H130 2N Incolora

C10H7NH2 Incolora

PASO 2 ligador del

(S-Naftilamina + Sustrato Incoloro

p-D¡metilaminoe!namalaühído Reactivo LAP/PYR

colorante diazo

- * Color rojo Base Schiff

P r u e b a d e le u c in a a m in o p e p t id a s a ( le u c in a a r ila m id a s a ) ( L A P )

265

Los compuestos diazo se combinan con aminas aromáticas o fenoles (p ej., (3-naftilamina). El grupo azo - N = N - (o el grupo diazo si un N está ligado a un elemento diferente del carbono) produce un com puesto coloreado (3).

SISTEMAS DE PRUEBA COMERCIALES

A. Pruebas de mancha en disco; discos con los reactivos 1. Fabricantes; seguir las instrucciones del fabricante. a. Disco LAP: REMEL (5). b. LAP (LAPNA): Key Scientific. c. Leucine Minitek: BBL. 2. Procedimiento (2, 5) a. Rehidratar el disco; dos métodos (1) Humedecer con agua destilada estéril. (2) Colocar el disco sobre la superficie del agar; por ejemplo, agar con sangre de oveja (SBA). b. Con un palillo de madera o con un ansa de inoculación untar abundantemente varias colonias puras de una placa de agar de 18 a 24 h sobre el disco. Si el aislamiento es de desarrollo len to, incubar 2-3 días para obtener inoculo suficiente. c. Incubar a temperatura ambiente (22-25°C) durante 5 min. d. Después de la incubación, agregar 1 gota de reactivo de detección al disco; esperar 1 min el desarrollo de color.

B. Ensayo para la enzima incluido en los sistemas en equipo (2) 1.

Fabricantes a. API Rapid Strept; bioMérieux. b. Bacti Card Streptococcus Test; REMEL. (1) El sistema consiste en pruebas PYR, LAP e hidrólisis de esculina. (2) La tarjeta, usada junto con sensibilidad a la vancomicina, proporciona las características preliminares deAerococcus, Enterococcus, Gemella, Globicatella, Lactococcus, Leuconostoe y Pediococcus. C. Conservación: discos y sistemas a 2-8JC.

VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Positivo (+) Enterococcus faecalis

ATCC 29212

B. Negativo (—) Aerococcus viridans

ATCC11563

Vil. RESULTADOS Véase figura 21-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII.

INTERPRETACIÓN

A. Positivo (+): color rojo. B. Positivo débil (+w): color rosa. C. Negativo (-): ningún cambio de color; amarillo.

IX.

PRECAUCIONES*2

A. Generales L La publicación DHEW No. (NIH) 76-000 consigna las ¡3-ñaftilaminas de aminoácidos como car cinógenos conocidos. Se debe tener cuidado durante la preparación y el almacenamiento dél sus trato para LAP. 2. Preferentemente, los aislamientos clínicos de estreptococos deben probarse antes de las 48 h de in cubación o subcultivai'sc antes de la prueba.

266

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

3. Antes de realizar la prueba LAP, confirmar que el microorganismo es un coco grampositivo y catalasa negativo.

B. Discos REMEL (5) 1. Guardar los discos en el recipiente original a 2-8°C; no congelar ni exponer a temperaturas altas. Dejar a temperatura ambiente antes del uso; no incubar. 2. El desarrollo de color después de 1 min no debe tomarse en cuenta. 3. Puede haber resultados falsos negativos si se usa un inoculo inadecuado. 4. Para la identificación definitiva pueden ser necesarias pruebas bioquím icas y serológicas adi cionales.

REFERENCIAS_________________________ 1. Doelle HW: Bacterial Metabolism. New York: Aca demic Press, 1969:403. 2. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, ed 5. Philadelphia: B Lippincott,1997:606-629. 3. Lillie RD. H. J. Conn’s Biological Stains, ed 9. Bal timore: Williams & Wilkins, 1977:200. 4. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yol-

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CAPÍ TULO s

Prueba de lipasa

PRINCIPIO

Determinar la capacidad de microorganismos para producir la enzima lipasa, que cataliza la hidrólisis de triglicéridos y diglicéridos a ácidos grasos y glicerol, evidenciada por un brillo aceitoso, iridiscente, sobre las colonias y alrededor de ellas en el medio en placa.

II.

OBJETIVO (Véanse también caps. 43 a 45)

A. Ayudar a la identificación de bacilos gramnegativos anaerobios obligados 1. Fusobacterium necrophorum (+) de otras especies de Fusobacterium (-) (20). 2. Propionibacterium acnés (V, variable) y P. granulosum (V) de P. avidurn ( -) y P. propionicus (-) ( 20 ).

B. Ayudar a la identificación de especies de Clostridium: C. botulinum (+), C. sporogenes (+), C. novyi A (+), C. ghoni (+), C. cochlearium (+) y C. leptum (V, normalmente - ) de otras especies de Clostri dium ( -) (véanse también cap. 20, Prueba de lecitinasa, cuadro 20-2). C. Pseudomonas aeruginosa (+) (6, 15) y Burkholderia cepacia (antes Pseudomonas cepacia) (+) de otras especies de Pseudomonas ( -) (2, 8, 15, 24, 27, 29, 32, 34). D. Ureaplasma urealyticum (+) de otras especies de Ureaplasma (-). E. Mycoplasma hominis (+) (30), Mycoplasma mycoides (+) (7) y Acholeplasma laidlawii (+) (37). F. Corynebacteriumpseudotuberculosis (+) y C. ulcerans (+) de otras especies de Corynebacterium (-) (3). G. Actividad de lipasa específica entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae 1. Serrada fonticola (—) de otras especies de Serrada (por lo común +); único en la familia Enterobac teriaceae que es lipasa, gelatinasa y DNasa positivos (18, 20, 21). 2. Proteus vulgaris (V, por lo general +), P. myxofaciens (+) y P. penneri (V) de P. inconstans (-), es pecies de Providencia (-) y biogrupos 1 y 2 de Morganella morganii (-1-). 3. Especies de Cedecea (V, por lo común +). H. Otra bacteria lipasa-positiva: Staphylococcus aureus subesp. aureus (18, 21).

III.

BIOQUÍMICA_______________________________________________________________

Lípidos Lípido es un término abarcativo para describir un grupo de grasas o derivados de las grasas. Los lípidos se clasifican en tres grupos principales: a) las grasas simples (neutras), que por hidrólisis producen ésteres de ácidos grasos y alcohol; b) las grasas compuestas, que por hidrólisis dan productos diferentes de los alcoholes y los ácidos grasos (p. ej., fosfolípidos y glucolípidos), y c) derivados grasos, que se obtienen por la hidrólisis de lípidos simples o compuestos. Las grasas neutras son ésteres de glicerol y de ácidos gra sos de cadena larga. R es una cadena carbonada de ácidos grasos (cadena lateral alquílica de ácidos grasos) esterificada al glicerol (glicerina), un alcohol trihidratado (polihídrico). Los fosfolípidos son ésteres comple jos de alcohol, ácido graso, ácido fosfórico y una base nitrogenada. La colina es sólo uno de los alcoholes que

268

Pruebas bioquímicas individuales

pueden estar presentes; otros son etanolamina, senna e inositol (16). Los glucolípidos son lípidos comple jos que contienen esfingosina, un ácido graso y un azúcar, pero no ácido fosfórico; un residuo de azúcar di ferente de la D-manosa pueden ser la galactosa, la glucosa o un oligosacárido (16).

ch 2— o

—c —

o I II CH — O — C —R I 0 I II CH, —0 —C —R

Lípido

0 II C H , —- 0 C —C — R Fosfolípido

0 CH — O — C — R

O I C H , —- OC

— C — R

Glucolípido

CH — O — C — R C H ,O H

/° — CH, — 0 -

\0 H

k, OH/

D-manosa

(

16)

Las bacterias contienen una cantidad considerable de lípidos como constituyentes de sus sistemas de membrana, sobre todo fosfolípidos y glucolípidos.

Ácidos grasos Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos; el precursor de los ácidos grasos es la acetil coenzima A (CoA). La mayoría de los ácidos grasos presentes en los lípidos contienen 16-18 átomos de carbono; es tán saturados o rienen una (raramente más) ligadura doble entre los átomos de carbono en la cadena alquílica. Los tres grupos hidróxilo (OH) del glicérol (C3H5(OH)3) ofrecen muchas combinaciones para la formación de éSteres con áSidos grasos. A lguno^ácidos grasos no saturados también son constituyentes importantes de los fosfolípidos (p. ej., palmitoleato y cis-vaccenato en Escherichia coiiy (16).

Glicéridos Los glicéridos son moléculas grandes con grupos ester; por ejemplo, triglicéridos, diglicéridos y monoglicéridos. El término “grasas” normalmente se refiere a los triglicéridos. Los triglicéridos son una mezcla

Prueba de lipasa 269 de ácidos grasos de cadena larga y glicerol, donde R, R ’ y R” son las cadenas laterales alquílicas de áci dos grasos saturados y no saturados. Son el componente principal de grasas y aceites (p. ej., en los acei tes vegetales, los aceites de oliva y de maíz). Las grasas y los aceites, independientemente de su origen, son mezclas de m oléculas de diferentes glicéridos (19); no hay ninguna diferencia química entre la gra sa y el aceite. 0 II C— R 0 II C — R' 0 C — R"

1 o a (saturado)

2 o p (no saturado) 3 o a 1 (saturado)

Triglicérido (grasa)

Hidrólisis La enzima lipasa actúa sobre los ésteres emulsionados de glicéridos y/o lípidos. Los triglicéridos (triacilgliceroles) son hidrolizados a monoglicéridos (monoacilgliceroles), glicerol y una variedad de diferen tes ácidos grasos saturados o no saturados. La lipasa es específica para las cadenas a y oq de triglicéridos. H idrólisis de un trig licé rid o

O II

,'CH),— 0 — C — R

' HOIH

CH2OH

0 J-„ ÍCH\— 0 — C — R1 + , ' HOIH ---- ------- .- CHOH I 0 i ,'CH).— 0 — C — R" ,' HOIH c h 2oh

L-trig licé rid o

Agua

Glicerol

0 I

HO — C — R

H O - C — R1 +

HO — C

3 Á c id o s g ra so s d ife re n te s

Cuando se hidrolizan, las uniones éster (ligaduras carbonil-ooxígeno) se rompen y elementos del agua se combinan con los fragmentos (19). Cuando las uniones éster de los glicéridos son hidrolizadas, los áci dos grasos se comportan como ácidos carboxílicos comunes (19) y son insolubles en agua.

Fosfolipasas Muchas lipasas se producen constitutivamente, aunque su producción puede estar influenciada por las condiciones nutritivas y [físicas del cultivo (22). El papel físico de las lipasas extracelulares probablemen te es nutritivo; algunas pueden hidrolizar triglicéridos exógenos para proporcionar ácidos grasos libres que pueden usarse como fuente de energía (26). Son enzimas catabólicas importantes en el metabolismo de los fosfolípidos; su mecanismo de acción en el proceso infeccioso no se conoce bien (9). Las fosfolipasas A, y A2 hidrolizan fosfolípidos a lisofosfolípidos y ácidos grasos (11). La fosfolipasa A2 está involucrada en la resíntesis de fosfolípidos vía desacilación-reacilación (23) y en la producción de precursores de las prostaglandinas (36). La fosfolipasa C es una fosforil hidrolasa que libera 1,2-diglicéridos y fosforiléster (9, 36). La activi dad de fosfolipasa C se ha informado como fosforilhidrolasa segregada en muchas especies bacterianas (1,9). Su secreción puede tener un papel en los efectos fisiológicos de la infección, pero la función de las fosfolipasas como toxinas segregadas en la infección perinatal todavía no está aclarada (11), La fosfoli pasa C cataliza la hidrólisis de la fosfatidilcolina (un fosfolípido presente en las membranas de células animales) a fosforilcolina y diglicérido (diacilglicerol) (15).

270

Pruebas bioquímicas individuales H idrólisis de un diglicérido

CH2 —O —C —R

c h 2oh

11 CH —O —C —R' +

lipasa 2H20 — -------- »- CHOH

CH2OH

D-oc—p-triglicérido (1,2-diglicérido)

Glicerol

Ácido graso (variedad saturada)

Yema de huevo La yema de huevo (en suspensión) es un indicador de la actividad de lipasa (o lecitinasa) en medios de cultivo. La yema de huevo es una mezcla de lípidos, fosfolípidos, lipoproteínas y otros componentes complejos. Así, la reacción con la yem a de huevo puede ser causada por una cantidad de enzimas que ac túan sobre una variedad de sustratos (26). Las grasas libres en la yema de huevo son degradadas por la li pasa a glicerol y ácidos grasos.

Ureaplasma/Mycoplasma/Acholeplasma Las especies de Ureaplasmaposeen fosfolipasas A,, A2 y C; sin embargo, la actividad A2 varía entre las serovariedades estudiadas (10). La variación en los niveles de actividad específica o las características enzimáticas peculiares pueden ser las responsables de las diferencias de virulencia entre serovares de Ureaplasm a (11). La fosfolipasa C de U. urealyticum difiere de la presente en la mayoría de las bacterias en que está unida a la membrana; la mayoría de las bacterias la segrega hacia el medio de cultivo (1,9). Las fos folipasas endógenas se localizan principalmente en la membrana plasmática de células en fase exponen cial (11); otros investigadores han hecho las mismas observaciones en M. hominis (31), A. laidlawii (37) y M. m ycoides (7). Los m icoplasm as se adhieren a las células huésped y su enzim a puede interactuar con la membrana celular (25). Las fosfolipasas localizadas en la membrana son importantes para producir el mecanismo de patogenia (11); funcionan como factores de virulencia en la infección (5, 9).

Staphylococcus aureus subesp. aureus La lipasa puede ayudar a la diseminación del microorganismo en los tejidos cutáneos y subcutáneos (20). S. aureus subesp. aureus produce una lipasa que puede favorecer la colonización de la piel al hidrolizar los lípidos de las superficies epiteliales de los seres humanos (38). S. aureus subesp. aureus contiene dos fosfo lipasas: una hidroliza el fosfatidil inositol y el lisofosfatidil inositol; la otra hidroliza la esfingomielina (13).

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

_______________________

A. Agar para aislamiento de C. botulinum (inhibitorio) (CBI) (12, 20) 1. Fórmula de Dezfulian, McCroskey, Hatheway y Dowell (12); medio selectivo. a. Aislamiento cuantitativo y cualitativo rápido de C. botulinum de los tipos A, B y F y de C. argentinense (antes C. botulinum de tipo G) a partir de heces humanas; suprime el desarrollo de otros anaerobios obligados y de unas pocas especies de Clostridium. Resultados comparables a los obtenidos con agar yema de huevo (EYA). b. Ayuda a diferenciar C. botulinum de los tipos A, B y F (lipasa +) de C. argentinense y otros clostridios que crecen en CBI (lipasa - ). 2. Suspensión de yem a de huevo: 5(5% en solución fisiológica (NaCl). 3. Soluciones madre a. Cicloserina (C, Ciclo): al 1%, disolver en agua destilada. b. Sulfametoxazol (S, SMX): al 1,9%, disolver en agua destilada; agregar NaOH 10% en cantidad suficiente para disolución. c. Trimetoprima (T, TMP): al 0,1%, disolver en agua destilada; agregar HC1 0,05 N en cantidad suficiente para disolución.

Prueba de lipasa 271 4.

Medio, pH 7,4 ± 0,2 Peptona de tripticasa Extracto de levadura D-Glucosa (dextrosa) Fosfato disódico, Na2HP04 • 12H20 Sulfato de magnesio (al 5% en solución acuosa) Cloruro de sodio, NaCl Agar Agua desionizada

40 g 5g 2g 5g 0,2 mL 2g 20 g 900 mL

Después de la esterilización, enfriar y agregar: Suspensión de yema de huevo, estéril Cicloserina (C), estéril Sulfametoxazol (S), estéril Trimetoprima (T), estéril

100 mL 250mg/mL 76mg/mL 4mg/mL

B. Medio selectivo para botulismo (BSM) 1. Fórmula de Mills, M idura y Amon (28); modificación del medio inhibitorio para C. botulinum (CBI) (12). 2. Recuperación rápida, cuantitativa, de C. botulinum lipasa positivo en el botulismo infantil y en el bo tulismo por intoxicación alimentaria, junto con una coloración de Gram y la detección de toxina fecal. 3. Soluciones madre de antibióticos a. Cicloserina: 25 mg/mL en agua destilada. b. Sulfametoxazol: 15 mg/mL en hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N. c. Trimetoprima: 50 mg (1) Disolver en 5 mL de H C10,05 N a 55°C. (2) Agregar agua destilada hasta un volumen final de 50 mL; concentración final, 1 mg/mL. 4. Suspensión de yema de huevo: 50% de yema de huevo en solución fisiológica (NaCl 0,85%). 5. Medio, pH 7,4 ± 0,2 Caldo infusión de corazón (HIB) Agar Agua desionizada

25 g 20 g 1.000 mL

Después de la esterilización, enfriar y agregar: Suspensión de yema de huevo, estéril Cicloserina, estéril Sulfametoxazol. estéril Trimetoprima, estéril Timidina fosforilasa, estéril

30 mL 250 mg/mL 76 mg/mL 4 mg/mL 100 UI

{Nota: la tim idina fosforilasa suprime la flora fecal no botulínica.) C. Véase capítulo 20, Prueba de lecitinasa, para los medios de agar yem a de huevo adicionales (EYA) que también pueden ser usados para la prueba de lipasa y para la preparación de yema de huevo desde el principio. Los antibióticos C-S-T también pueden agregarse al medio de EYA modificado por los CDC.

D. Agar lipasa manitol salado (LSM) (agar de yema de huevo manitol salado, agar manitol salado para (la prueba de) lipasa) 1. Fórmula de Gunn, Dunkelberg y Creitz (17) y O ’Brien y Lewis (30). 2. Aislamiento primario y diferenciación de S. aureus subesp. aureus (V+) de Staphylococcus epidermidis (—). 3. Ingredientes, pH 7,4 ± 0,2 Peptona de caseína/came (50/50) Extracto de came D-Manitol Cloruro de sodio, NaCl Rojo fenol Agua desionizada

10 g 1g 10 g 75 g 0,025 g 1.000 mL

Después de la esterilización, enfriar y agregar: Suspensión de yema de huevo, al 2%, estéril

20 mL

272

Pruebas bioquímicas individuales

E. Método de esterilización 1. Medios de cultivo básales con agar: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. 2. Antibióticos (C-S-T), timidina l'osforilasa y suspensión de yema de huevo: filtración (Millipore). F. Distribuir: en placas de Petri; 20 mL/placa (15 x 100 mm). G. Conservación 1. En refrigerador, 4-10°C; sellar herméticamente en las bolsas originales con las placas invertidas (tapas hacia abajo). 2. Fecha de vencimiento: no m ás de 2 semanas. H. Inoculación 1. Anaerobios: mantener las placas en la caja para anaerobiosis desde 4 h an tes del uso; si se demo ra, colocar en jarras con flujo de nitrógeno. 2. M uestra directa; estriar en cuatro cuadrantes para el aislamiento máximo. I. Incubación: en aerobiosis/anaerobiosis, según de los microorganismos a probar; 35°C; placas inverti das (tapas hacia abajo). 1. Anaerobios: 48 h. 2. Estafilococos: 24-36 h.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD_____________ Positivo (+): Clostridium sporogenes Staphylococcus aureus subesp. aureus

ATCC 3584 ATCC 12600

Negativo (-): Clostridium petfringens Staphylococcus epidermidis No inoculado

VI.

ATCC 13124 ATCC 14990

RESULTADOS J é a s e figura. 22-1 (Apéndice 1) p a ra los resultados fotográficos en color.

Vil. INTERPRETACIÓN A. Medios de cultivo para botulismo 1. Positivo (+) a. Brillo iridiscente (como nácar) en la superficie de las colonias y en el agar inmediatamente al rededor del desarrollo bacteriano o como una capa de “aceite en agua” en la superficie que cu bre las colonias y puede extenderse más allá del borde de la colonia o como un halo opaco di rectamente por debajo de las colonias (4). b. Para ver mejor el fenómeno de “aceite en agua”, colocar la placa en ángulo con una fuente de luz (4); usar luz reflejada (20). c. Si los resultados son dudosos, agregar unas gotas de agua y buscar una película que flota enci m a del agua (20). d. Un aclaramiento del medio indica proteolisis, no un resultado positivo para lipasa. 2. Negativo (-): ningún cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo.

B. Agar lipasa manitol salado (LSM) 1. Lipasa positivo (+) a. Halo opaco alrededor de las colonias amarillas; actividad lipovitelina-lipasa b. S. aureus subesp. aureus, 90,4% (17); según Gunn y col. (17), el LSM se correlaciona con la producción de coagulasa en 94,7% de los cultivos probados. 2. Lipasa negativo (-): ningún halo alrededor de las colonias; S. epidermidis.

Prueba de lipasa 273 VIII. PRECAUCIONES A. La producción de fosfolipasa C por P. aeruginosa es suprimida por el fosfato inorgánico (6). B. Puede ser necesario reincubar las placas hasta 2 semanas para detectar productores lentos de lipasa (4). C. l'odos los clostridios, las especies de Bacteroides pigmentarios y las fusobacterias deben probarse pa ra la producción de lipasa (4). D. La enzima que hidroliza Tween 80 hidrosoluble no es una verdadera lipasa (39) sino una esterasa y debe tratarse por separado. Los microorganismos que poseen lipasas no necesariamente degradan Tween 80 (14, 33). E. Dezfulian y col. (12) recomiendan el uso simultáneo de CBI selectivo y del medio de EYA no selec tivo para el aislamiento de C. botulinum a partir de muestras primarias y, si es necesario, a partir de los cultivos enriquecidos, para evitar pasar por alto las cepas sensibles a fármacos, como C. botulinum de tipo E (35). F. Para observar m ejor el halo opaco en LSM, sacar una colonia con un hisopo; de esta manera, pueden observarse halos que de otra forma podrían tardar en aparecer.

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Pruebas bioquímicas individuales

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CAPÍ TULO *

Prueba de leche tornasolada

I. PRINCIPIO Diferenciar los microorganismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio con leche.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 y 44) Medio diferencial utilizado sobre todo para el estudio de microorganismos selectivos, por ejemplo, gramnegativos no fermentadores, clostridios y enterococos (16). A. Ayudar en la diferenciación, de especies en especial dentro del género Clostridium (cuadro 23-1) B. La m ayoría de las especies de Enterococcus reduce la leche a un color blanco cuando se utiliza el tor nasol como aceptor de electrones (19) en presencia de enzima preformada. C. Streptococcus bovis (crece) de 5. equinus (no crece). D. Ayudar en la diferenciación de las cepas cutáneas de Propionibacterium acnés (+) y P. avidum (+) de P. granulosum ( -) (20) (véase procedimientos de prueba alternativos). E. Junto con otras pruebas (esculina, producción de cápsula, reacción en caldo con cloruro de sodio y ac tividad sobre los hidratos de carbono arabinosa, melibiosa, rafinosa y trehalosa) ayuda en la diferen ciación de Leuconostoc lactis (ácido/coágulo) y L. pseudomesenteroides (ácido/coágulo) de L mesentem ides (— ; excepción ocasional) y L. citreum ( -) (1).

III. BIOQUÍMICA La leche tornasolada es un medio diferencial utilizado para determinar diversas funciones metabóli cas de un microorganismo: a) fermentación de la lactosa, b) caseólisis y c) coagulación de la caseína (6). El tornasol incorporado en la leche indica tanto pH como Eh (oxidación-reducción); por eso, el medio puede denotar diversas funciones metabólicas. La leche sola contiene exclusivamente el hidrato de car bono lactosa junto con tres proteínas principales: caseína, lactoalbúmina y lactoglobulina (4). Por consi guiente, un microorganismo puede exhibir una o varias propiedades metabólicas en la leche tornasolada, cada una específica para una especie particular, hecho que ayuda a la identificación bacteriana: a) fermen tación de la lactosa, b) reducción del tornasol, c) formación de un coágulo, d) peptonización (digestión) y e) formación de gas.

Fermentación de la lactosa (acidificación) El tornasol como indicador de pH es rojo en una solución ácida (pH 4,5) y azul en condiciones alca linas (pH 8,3). La leche tornasolada muestra un color azul purpúreo (pH 6,8) cuando no está inoculada, pero si un microorganismo fermenta la lactosa, produce so b re todo ácido láctico, un medio ácido que ori gina cambios en el medio a un color rosa-rojo. En ocasiones, el producto final de la fermentación de la

276

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 23-1. R e a c c io n e s e n le c h e to rn a s o la d a d e la s e s p e c ie s d e Clostridium a is la d a s c o n m á s fre c u e n c ia ______________________________________________________________________ Digestión/coagulación (DC)a C. cadaverís C. perfringens

(GS)

Coagulación/digestión (CD)b C. haem olyticum C. septicum

Coagulación (C) C. novyi A C. oioticum C. paraputrificum C. ram osum C. sartagoforum C. sphenoides C. spiroform e C. sym biosum e C. tertium

C. barati'F C. beijerinckii C. butyricum (GS) C. celatum (cuajo leve) C. chauvoei C. dostridioformeF C. fallax C. indolis

Digestión (D) C. lim osum C. novyi B9 C. putrefaciens C. putrificum C. sordellii C. sporogenes C. subterminaleh

C. argentinense (variable)* C. biferm entans C. botulinum C. gh o ni C. hastiform e C. histolyticum

Sin reacción/negativo C. carnis C. cochlearium C. difficile C. glycolicum C. innocuum

C. leptum C. malenominatum C. novyi C C. tetani'

a) Prioridad de la digestión sobre la coagulación, b) Prioridad de la coagulación sobre la digestión, c) Antes C. barti, C, perenne, C. paraperfringens, C. peronnet. d) Antes C. clostriidiforme. e) Antes Fusobacterium symbiosum y Fusobacterium biacutus f) Antes C. botulinum G, algunos C. hastiforme no tóxicos y C. subterminale. g) C. novyi B informa varia ble y muy tardío h) Lento, i) C. tetani informa variable y muy tardío.

lactosa es el ácido butírico (3). Ciertas bacterias formadoras de álcalis no fermentan la lactosa, pero ac túan sobre las sustancias nitrogenadas presentes en la leche, lo que ocasiona la liberación de amoníaco (3) y en consecuencia origina un pH alcalino evidenciado por el color púrpura azulado. Lactosa----- «-Glucosa + galactosa ácido láctico Glucosa

Acido pirúvico -

ácido butírico

CO2 + H2 Reducción del tornasol El tornasol es un indicador de pH (indicador ácido-base) y simultáneamente un indicador de oxida ción-reducción (indicador de Eh). Los niveles de reducción de oxígeno a menudo acompañan la form a ción de ácido en la profundidad del tubo; la profundidad de la capa superior depende de la proporción de reducción, no de la oxidación por el aire (16). Ciertos microorganismos pueden reducir el tornasol a una leucobase (blanca).

Formación del coágulo y digestión (licuefacción y peptonización de la caseína) Las enzimas proteolíticas (caseasas) hidrolizan las proteínas de la leche, las que coagulan la leche; la principal enzima responsable de la formación del coágulo es la quimosina del cuajo (rennina) (3, 9). La formación de un coágulo en el medio de leche tornasolada se produce por la precipitación de la caseína

Prueba de leche tornasolada 277 mediante la formación de ácido o por la conversión de caseína en paracaseína por acción de la renina. La peptonization puede ser acom ñafiada por la alcalinización observada como una capa púrpura clara en la su perficie de la leche (16). La caseína, una fosfoproteína compleja, es la principal protema presente en la le che (4,17). Es una proteína globular soluble en agua o en soluciones acuosas de ácidos, bases o sales (8).

Alcalinización La moderada actividad sobre la caseína puede producir productos alcalinos (16). La alcalinización se observa en la superficie de la leche como un anillo purpúreo debido a una desviación hacia el lado bási co en el pH del tornasol en presencia del cuajo (16).

Formación de un coágulo ácido La precipitación de la caseína por los ácidos orgánicos a partir de la lactosa (3) en condiciones ácidas produce un coágulo firme, gelatinoso, que no se retrae de los lados del tubo y que se disuelve con facili dad en medios alcalinos. La leche fresca posee un pH de 6,6-6,9 debido a la presencia de fosfatos ácidos. Cantarow y Schepartz (4) establecieron que la caseína “se presenta tal vez como una sal (caseinato de cal cio) y precipita con la acidificación como leche cortada (fermentación del ácido láctico)”. La acidifica ción de la leche a un pH 4,5 desintegra la proteína compleja caseína para dar un precipitado (17). La fer mentación de la lactosa con el indicador tornasol exhibe un color rojo rosado a pH 4,5. La fermentación de la lactosa produce ácido láctico y otros ácidos orgánicos como productos finales de la glucólisis, los que a su vez se combinan con la sal soluble en agua caseinato de calcio para producir caseinógeno, el cual precipita como un coágulo insoluble. Lactosa----- *- Ácido láctico Ácido láctico + caseinato de calcio (Ambiente ácido)

caseasa

Caseinógeno

(Sal de caseína) (soluble)

(insoluble)

precipitado

Según Burrows y col. (3), la hidrólisis enzimática de la caseína produce la conversión final del preci pitado caseinógeno a un líquido claro, un proceso denominado peptonización. La peptonization se m a nifiesta por un aclaramiento acuoso del medio causado por la digestión del precipitado (coágulo) y de las proteínas de la leche por las enzimas proteolíticas. Sin embargo, la peptonización sólo ocurre cuando las bacterias que desarrollan en la leche tornasolada contienen caseasas (3) Con mucha frecuencia a la pep tonización se la denomina digestión.

Formación de un cuajo (coágulo) Otra forma de coagulación es la formación de cuajo de la leche mediante la conversión de la caseína en paracaseína por la acción de las enzimas digestivas rennina (rennasa), pepsina o quimotripsina (quimosina) (4). La principal enzima conocida es la rennina (rennet) (17), la cual, según Cantarow y Sche partz (4), es segregada como prorrennina y luego activada por los iones hidrógeno (H+). Se dispone de un extracto desecado comercial de rennina (rennet). La rennina produce la cuajada de la leche (un coágulo rennet) al convertir la sal de caseína soluble (caseinogenato de calcio) a una paracaseína insoluble (caseinato de calcio), que es el cuajo (4, 8). El cuajo contiene calcio y fosfatos de calcio. La caseína fue considerada la principal proteína de la leche, pero en realidad es un agregado coloidal compuesto por diversas proteínas identificables, junto con fósforo y cal cio (10), un complejo heterogéneo denominado caseinato de calcio. rennina

Caseína-------------► Paracaseína Ca++

(Sal caseinogenato de calcio) (soluble)

cuajo (Caseinato de calcio) (insoluble)

278

Pruebas bioquímicas individuales

Según Oser (17), la actividad de rennina “hidroliza una unión peptídica en 10.000 dentro de la caseí na”. Harrow y M azur (9) establecieron que la acción de la rennina tal vez se deba a la eliminación inicial de una unión peptídica en la caseína, seguida por la formación de un coágulo o cuajo; el calcio presente como sal actúa como un agente estabilizante. Sin embargo, Cantarow y Schepartz (4) afirmaron que la caseína es hidrolizada a paracaseína soluble que con el calcio se convierte en caseína insoluble, paracaseinato de calcio, para formar el “cuajo de la leche”. Caseína — «(soluble)

Par?ca' sema

—

(soluble)

—*- Caseína I cuajo (Paracaseinato de calcio) (insoluble)

La paracaseína precipita como paracaseinato de calcio (4,17) a un pH por encima de 4,5. Este cuajo es blan do, insoluble y no se disuelve en condiciones alcalinas; se retrae de los lados del tubo después de unas pocas horas, dejando un líquido claro de color grisáceo o amarillento (paja) denominado “suero de la leche” (4,5). Registrar la formación del coágulo con el proceso enzimático involucrado no es importante para los fines de identificación. Simplemente registrar la presencia o la ausencia de un coágulo.

Formación de gas y fermentación tormentosa A partir de la fermentación de la lactosa pueden producirse gases (C 0 2 y H2). La fermentación tor mentosa resulta cuando el abundante gas presente rompe un coágulo ácido (acidificación y coagulación de la caseína). Cuando las proteínas de la leche son coaguladas por el ácido, el cuajo se separa por la pro ducción de gas durante la fermentación. Esto puede ocurrir con ciertas especies de Clostridium anaero bias (C. perfringens y C. butyricum) y es de suma importancia para la identificación de las especies. Las bacterias proteolíticas pueden hidrolizar la leche por un mecanismo enzimático para formar un coágulo (cuajo) o producir una reacción alcalina (3). Algunos microorganismos producen la enzima lipasa, que cataboliza las grasas presentes en la leche a un líquido claro amarillo transparente (3). Con un único aislamiento bacteriano puede ocurrir una de estas reacciones metabólicas o una varie dad de combinaciones. Ácido, coágulo, gas, fermentación tormentosa (ACGS) Ácido solamente (A) Ácido con gas (AG) Ácido con coágulo (AC) Ácido, coágulo, gas (ACG) Ácido, digestión (AD) Alcalino (Ale) Coágulo, digestión (CD) Coágulo, gas (CG) Coágulo (C) Digestión (D) Sin cambios, negativo (NC/-) Reducción (Rojo) Para registrar todas las reacciones metabólicas que ocurren en la leche tornasolada se utilizan símbo los o abreviaturas estándar. Ácido, A Alcalino, Ale or K Coágulo, C Digestión, D Gas, G Fermentación tormentosa, S (stormy) Reducción, R o Rojo Sin cambios, NC, - , o neg

IV. INDICADOR (SOLUCIÓN DE TORNASOL)_____________ (Nota: El tornasol, un indicador vegetal, un producto no sintético, o la azolitmina, una sustancia comer cial aislada a partir del tornasol natural, pueden ser utilizados en el medio con leche.)

Prueba de leche tornasolada 279 A.

Ingredientes (5) T ornasol, g ranular E tan o l (alcohol etílico) al 40% , C 2H 5O H

250 g 1.000 m L

B. Método de preparación del solvente etanol, 40% 1. Stock: etanol al 95% 2. Cálculos a. % requerido/% stock = v/cantidad requerida b. 40/95 = jt/100 mL c. 4.000/95 = 42,1 mL de etanol al 95% 3. Cantidad deseada de una solución al 40% a. 100 m L = 42,1 mL de etanol al 95% llevado a 100 mL con agua destilada b. 1.000 mL = 421 mL de etanol al 95% llevado a 1.000 mL con agua destilada C. Método de preparación: solución de tornasol 1. M oler el tornasol como un polvo fino. 2. En un frasco de 2 L agregar 500 mL de etanol al 40% y el tornasol molido. 3. Hervir 1 min. 4. Con cuidado, decantar el sobrenadante (líquido) en otro frasco de 2 L. 5. Agregar los 500 mL restantes de etanol al 4(¡).% al sedimento en el frasco inicial. 6. Hervir de nuevo durante 1 min. 7. Con cuidado, decantar el sobrenadante en el frasco que contiene la primera porción de 500 m L de líquido hervido. 8. Centrifugar el sobrenadante y decantar en una probeta graduada de 1 L. 9. Ajustar el volumen a 1.000 mL con etanol al 40%. 10. Gota a gota, agregar HC1 (ácido clorhídrico) 1 N hasta que la solución se tom e p ú rp u ra . D. Comprobación control de la reacción de tornasol (5) 1. Hervir 10 mL de agua destilada. 2. Enfriar. 3. Agregar 1 gota de solución de tornasol y mezclar bien. 4. Si se preparó de m anera apropiada, el agua se tom a malva. 5. La concentración del indicador tornasol es de alrededor de 2,5% (5). El tornasol (liquen azul) es un producto natural cuya com posición quím ica sólo se conoce en for m a parcial; la principal sustancia con propiedades colorantes es un derivado de 7-hidroxi-2-fenoxazona con sustituyentes en la posición 3,6 (14); es sim ilar al indofenol desde el punto de vista estruc tural (11). L a azolitm ina no es la sustancia colorante total del tornasol; el tornasol puede contener varios constituyentes (11). El lím ite de pH del tornasol es 4,8-8,3 (13) y el de la azolitm ina, 5-8/4,58,3 (12, 13).

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: MEDIO DE LECHE TORNASOLADA, pH 6,8 (6)

{Nota: Para preparar el medio con leche tornasolada puede utilizarse leche de vaca fresca desnatada o le che desnatada deshidratada comercial (2).) A.

Ingredientes: tres opciones 1. Con tornasol; pH 6,8 ± 0,2 a. Fórmula 1 L ech e d esnatada, d eshidratada T ornasol en polvo A g u a d esionizada

Fórmula 2 L ech e desnatada P ep to n a T io su lfato de sodio de sodio H S C H 2C O O N a 0,5 g tornasol A g u a d esionizada

100 g 5g 1.000 m L

Con azolitmina, pH 6,5 ± 0,2

100 g 10 g 5g 1.000 m L

280

Pruebas bioquímicas individuales L ech e desnatada, p o h o d eshidratado S ulfito de sodio, N a 2S 0 3 • 7H 20 A zo litm in a A g u a desio n izad a

100 g 0,5 g 0,5 g 1.000 m L

3. Controlar el pH; ajustar a 6,8 por el suave agregado de más tornasol o azolitmina, controlando des pués de cada agregado. 4. Puede agregarse una solución líquida de tornasol en lugar de polvo. Si es así, rehidratar la leche desnatada con agua destilada y luego agregar suficiente solución de tornasol (Sección IV) para ob tener un color azul purpúreo (pH 6,8) (5). B. Indicador de pH: tornasol 1. Acido: color rojo, pH 4,5. 2. Alcalino: color azul, pH 8,3. 3. No inoculado: pH 6,8; color azul purpúreo. C. Método de preparación 1. Pesar una cantidad exacta como indica el rótulo del envase. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada; calentar el agua a 50°C antes del uso para la rehidratación, 3. Calentar con suavidad en la solución. 4. M ezclar bien para obtener una solución hom*ogénea. 5. Fraccionar alrededor de 5 mL por tubo con tapa a rosca; las tapas deben quedar flojas. D. Método de esterilización 1. Autoclave 2. Habitual: 121°C, 15 Ib, 15 min. a. Difeo (6) recomienda 121°C, 15 Ib, 15 min. b. BBL (18) recomienda 113-115°C, 20 min. c. Baron y Finegold (2) recomiendan 10 Ib, 10 min. d. Cowan (5) recomienda dos métodos: (1) Autoclave: 115°C, 10 min. (2) Vapor fraccionado (tindalización) 30 min en 3 días consecutivos. Durante la esterilización en autoclave, la leche tornasolada es reducida a una base blanca; sin em bar go, con el enfriamiento, el oxígeno es absorbido y retom a el color azul purpúreo original. E. Enfriar antes del uso, apretar las tapas y conservar en refrigerador (4-10°C). F. Inoculación 1. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h; agar con hierro de Kligler (KIA) u otro medio sólido apropiado. 2. Si se sospecha Clostridium, agregar al tubo hierro estéril (p. ej., hierro en polvo, clips de papeles, limaduras metálicas). G. Incubación 1. Habitual: 35°C; 18-24 h; pueden ser necesarios períodos más prolongados de hasta 14 días (5); re gistrar las reacciones a diferentes intervalos durante la incubación. 2. Seudomónadas fluorescentes: 25°C; examinar a los 4 y 7 días de incubación (15). 3. Anaerobios: agregar una capa de vaselina estéril sobre el medio de cultivo (18).

VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD AC ACGS A ALC R O JO D NC N o inoculado

Lactobacillus acidophilus Clostridium perfringens Clostridium butyricum Escherichia coli Alcaligenes faecalis Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris

A T C C 314 A T C C 3624 A TC C 859 ATCC 25922 A T C C 8750 A T C C 29212 A T C C 10145 A T C C 13315

Prueba de leche tornasolada 281 Vil. RESULTADOS

VIII. INTERPRETACIÓN A. Rojo rosado (A) 1. Reacción ácida. 2. Lactosa y/o glucosa (dextrosa) fermentadas. 3. Puede haber fermentación tormentosa; intensa evolución de gas por ciertas cepas de clostridios. 4. A medida que la lactosa es convertida a ácido láctico, la subsuperficie cambia primero a un color rosa pálido, mientras la capa superficial permanece rosa-púrpura. Cuando se produce más ácido, la capa su perior se toma rosa claro y la porción rosa del fondo se decolora al blanco. A medida que sigue produ ciéndose más ácido, aparece la formación de cuajos (coagulación ácida), lo que se manifiesta por una banda angosta o collar de color rosa en la parte superior debido a la disminución de la oxidación (16). Puede formarse un coágulo firme que resiste el flujo originado con la inclinación del tubo (16).

B. Azul purpúreo (NC/-) 1. Sin fermentación de la lactosa. 2. Sin cambios del indicador de pH tornasol; igual que el tubo no inoculado. C. Azul (Alc/K) 1. Reacción alcalina; capa púrpura clara en la superficie de la leche (16). 2. Sin fermentación de la lactosa. 3. Los microorganismos atacan las sustancias nitrogenadas presentes en el medio; actividad sobre la lactoalbúmina con producción de amoníaco (NH3) o aminas básicas (18). D. Blanco (reducción) 1. Reducción del tornasol en todo el tubo a una leucobase blanca cuando el tornasol actúa como un aceptor de electrones. 2. La acción de las reductasas elim ina el oxígeno para form ar com puestos leucotornasolados in coloros (18). E. Formación de coágulo o cuajo (C) a partir de la proteína de la leche por uno de dos procesos. 1. Precipitación por el ácido producido a partir de la lactosa. El coágulo no se retrae y es soluble en álcalis (5). 2. Conversión de la caseína en paracaseína por acción de la rennina (16). El coágulo rennet es blan do y se retrae y produce un líquido claro de color grisáceo o amarillento (paja) denominado “sue ro de la leche” en la parte superior del tubo coagulado. La formación de suero ocurre cuando la caseína se transforma en cuajo y la formación rápida del coágulo se acompaña de la separación de un líquido claro de color paja (16). El coágulo es insoluble en álcalis. El proceso puede continuar con la peptonización o digestión del coágulo (5). F. Digestión (D) (peptonización) 1. Proteína de la leche digerida. 2. Medio claro. 3. Digestión (disolución) del cuajo o de las proteínas de la leche por enzimas proteolíticas. Los mi croorganismos proteolíticos o aquellos que producen sustancias alcalinas por lo general no coagu lan la leche; sin embargo, se forma un coágulo blando denominado cuajo rennina (16). Esto es se guido por la hidrólisis de la caseína (disolución del coágulo rennina) por enzimas proteolíticas extracelulares, con conversión de las proteínas de la leche a compuestos solubles (16). G. Gas (C 0 2 e H2) (G) 1. Burbujas en el medio. 2. Puede romperse el coágulo. H. Fermentación tormentosa (S): el coágulo ácido se rompe por una producción abundante de gas.

IX. PRUEBAS ALTERNATIVAS A. Agar con leche tornasolada (LMA) 1. Procedimiento de Webster y McGinley (20).

282

Pruebas bioquímicas individuales

2. Identificación presuntiva de las especies cutáneas de Propionibacterium; especies grampositivas anaerobias, no formadoras de esporas. 3. Medio a. Agregar 1,5% de agar al medio con leche tornasolada al 5% (BBL) (véase Sección V para la preparación). b. Verter en placas de Petri hasta una profundidad aproximada de 14 mm. 4. Inoculación: pueden probarse hasta 5 microorganismos por placa; el área sembrada con el hisopo para obtener un desarrollo máximo debe tener cerca de 4-5 mm de diámetro. 5. Incubación a. 35°C, posición invertida (tapas hacia abajo). b. En anaerobiosis (GasPak, BBL); 7 días. 6. Interpretación a. Positivo (+) (1) Zona de aclaramiento, tamaño de la zona de 1,5-2 cm de diámetro (2) Hidrólisis de la caseína; P. acnés o P. avidum (3) No existe correlación entre el serotipo dentro de la especie y el tamaño de la zona. b. Negativo (—): no se observa una zona de aclaramiento; P. granulosum.

B. Prueba de la caseolisis rápida para Enterococcus (19) 1. Estudios realizados por Schierl y Blazevic (19) mostraron que 83% de los enterococos reduce el tornasol en el curso de 4 h. 2. Volumen disminuido de leche con el aumento del tamaño del inoculo a. Fraccionar 0,5 mL de medio/tubo (13 x 100 mm o 6 x 50 mm); tubos tapados. b. Inoculo proveniente de un cultivo de 18 a 24 h en agar con sangre de oveja (SBA); inoculo gran de; crecimiento recogido con un ansa bacteriológica. 3 Incubación: bloque calentado a 37°C, leer a los 30 min y luego a cada hora hasta un total de 4 h. 4. Interpretación a. Positivo (+): blanco; reducción. b. Negativo (-): rosa; producción de ácido.

X. PRECAUCIONES A. La formación del coágulo simplemente se registra como coágulo (C). No intentar diferenciar entre coágulo o cuajo. B. La leche tornasolada debe tener un pH de 6,8. Para asegurarse acerca de las reacciones correctas que ocurran en el medio, realizar controles antes del uso general del medio. C. La leche hom*ogeneizada no es adecuada para preparar el medio con leche tornasolada (5). Si no se dispone de leche desnatada, colocar la leche fresca en el refrigerador (4-10°C) y dejarla reposar to da la noche; luego retirar la capa de leche desnatada evitando la capa de crema. Colocar al vapor du rante 1 h, enfriar a 4-10°C, filtrar y medir el filtrado (5). A la leche desnatada agregar suficiente solu ción de tornasol para obtener un color azul purpúreo (pH 6,8) (5). Fraccionar en tubos, esterilizar y utilizar del mismo modo que la leche deshidratada desnatada. D. El tornasol es reducido durante la esterilización a una leucobase incolora; tom a color a medida que el medio se enfría y absorbe el oxígeno. El sobrecalentamiento durante la esterilización carameliza los azúcares de la leche y esto debe evitarse (5, 16). E. Las reacciones observadas en la leche tornasolada no son suficientes para determinar las especies; de ben llevarse a cabo pruebas bioquímicas y serológicas adicionales. F. La azolitmina no reemplaza de modo exitoso al tornasol, aun cuando las diferencias en las variacio nes de pH son pequeñas; no representa lo relevante del color completo del tornasol (11). G. Los estreptococos del grupo viridans pueden reducir la leche tornasolada durante una incubación pro longada (7); una prueba para enterococos no debe leerse después de las 4 h.

Prueba de leche tornasolada 283 REFERENCIAS 1. Balows A, Hausler WJ Jr, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. Manual of Clinical Microbio logy, ed 5. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1991:254. 2. Baron EJ, Finegold SM. Bailey Scott’s Diagnos tic Microbiology, ed 8. Philadelphia: CV Mosby, 1990:A19. 3. Burrows W, Lewert RM, Rippon JW. Textbook of Microbiology. The Pathogenic AHcroorganisms, ed 19. Philadelphia WB Saunders, 1968:324. 4. Cantarow A, Schepartz B. Biochemistry, ed 3. Phi ladelphia: WB Saunders, 1962: 273,792-793. 5. Cowan ST. Cowan : Steel’s Manual for the Identifi cation of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: Cam bridge University Press, 1974:138, 152, 176. 6. Difco Manual, ed 9. Detroit: Difco Laboratories, 1953: 192-193. 7. Facklam RR Physiological differentiation of viridans streptococci. J Clin Microbiol 1977;5(2): 184201. 8. Fieser LF, Fieser M. Organic Chemistry, ed 3. New York: Reinhold, 1956:417, 461. 9. Harrow B, Mazur A. Textbook of Biochemistry, ed 9. Philadelphia: WB Saunders, 1966:355. 10. Hawley GG. The Condensed Chemical Dictionary, ed 10. New York: Van Nostrand Reinhold, 1981:203.

11. Lillie RD. HJ Conn’s Biological Stains, ed 9. Balti more: Williams & Wilkins, 1977:374,403-404. 12. Long C. Biochemist’s Handbook. Princeton, NJ: Van Nostrand, 1961. 13. Stecher PG, ed. Merck Index, ed 7. Rahway, NJ: Merck and Co. 1960. 14. MussoH, Kramer H. Oberorceinfarbstoffe. X. LichtabsorptionundchromophordesLackmus.ChemBer 1959;92:751-753. 15. OberhoferTR. Manual of Nonfermenting GramNegativeBacteria. NewYork: John Wiley Sons, 1985:77. 16. Oberhofer TR. Manual of Practical Medical Micro biology and Parasitology. New York: John Wiley Sons, 1985:199. 17. Oser BL, ed. Hawk’s Physiological Chemistry, ed 14. New York: McGraw-Hill, 1965:374. 18. Power DA, McCuen PJ. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures, ed 6. co*ckeysvUle, MD: BectonDickinsonMicrobiology Systems, 1988:177178. 19. Schierl EA, Blazevic DJ. Rapid identification of en terococci by reduction of litmus milk. J Clin Micro biol 1981; 14(2):227-228. 20. Webster GF, McGinley KJ. Use of litmus milk agar for presumptive identification of cutaneous propionibacteria. J Clin Microbiol 1977;5(6): 661 -662.

CAPÍ TULO # i

Prueba de sensibilidad a la lisostafina 1. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo para producir la enzima endopeptidasa lisostañna, que d iv a los puentes pentapeptídicos con alto contenido de glicina en el peptidoglucano de la pared celular estafilocócica (13, 26), lo que vuelve a las células sensibles a la lisis osmótica (17).

II. OBJETIVO (Véase también cap. 43) Prueba para la detección rápida de la diferenciación de Staphylococcus aureus subesp. aureus y otras especies de Staphylococcus de las especies de Micrococcus (26); útil en los hemocultivos. A. Baker (1) encontró que la mayoría de los aislamientos probados de S. aureus subesp. aureus fueron lisados por la lisostafina, pero la lisis.no era uniforme con los estafilococos coagulasa negativos. B. Sabath y col. (20) informaron una lisis disminuida en S. aureus subesp. aureus meticilina-resistente (methicillin-resistentes (MRSA); si bien Seligman (25) informó un incremento de la lisis de M RSA por la lisostafina. Schleifer y Kloos (16, 23) y Heddaeus y col. (11) encontraron una considerable va riación entre las cepas con respecto a la sensibilidad de los estafilococos a la lisostafina. C. Zygmunt y col. (28, 29) m ostraron que no existe una resistencia natural de las cepas de S. aureus subesp. aureus a la lisostafina y también encontraron que más de 400 cepas de S. aureus subesp. au reus con resistencia múltiple pero sensibles a la meticilina (MSSA) fueron lisados por la lisostafina.

III. BIOQUÍMICA_________ _____________________________________________________ Peptidoglucano La pared celular bacteriana (cubierta externa rígida) debe su resistencia a una capa compuesta por una sustancia denominada mureína, mucopéptido o peptidoglucano (todos sinónimos) (15). Uno de los obje tivos de la pared celular es conferir protección osmótica. Las bacterias grampositivas contienen peptidoglucano como principal componente de su pared celu lar, alrededor de 80-90% (8); otros componentes son los ácidos teicoicos. El peptidoglucano es un polí mero complejo de polisacáridos y polipéptidos altamente entrecruzados (15). Los polisacáridos contie nen tres partes: a) un esqueleto de secuencias alternadas de aminoazúcares, ÍV-acetiIglucosamina y ácido A-acetilmurámico relacionados por uniones (3-1,4; b) un conjunto de cadenas laterales de tetrapéptidos idénticos adheridos al ácido V-acctilmurámico y c) un conjunto de puentes cruzados idénticos (8, 15).

Prueba de sensibilidad a la lisostafina 285 A.

Segmento de peptidoglucano de Staphylococcus aureus

(N-Acetil glucosamina)

(Péptido del ácido N-Acetilmurámico)

(N-acetil glucosamina)

(Péptido del ácido N-Acetilmurámico) c h 2oh

6CH2OH

-o / V

\ K V 0

ch3 ch- co

\ [V 0 /

\ K

IV . V

/ \

ch3

NH-COCH,

\j /

CH-CO

NH-COCH, (a NH)

I L-Alanina

D-lsoglutamina

L-Usina

D-Alanina (a COOH)

L-Alanina

D-lsoglutamina

I L-Usina

D-Alanina (oc COOH)

Representación esquem ática del enrejado de peptidoglucano form ado por enlaces cruzados

[GLYls

[GLY]5

[GLYls

[GLY]5

(Redibujado de Jawetz E., Melnick J. L., Adelberg E. A. R e vie w o f M e d ic a l M icrobiology, 17ed, p. 16,1987, con autorización de Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut.)

286

Pruebas bioquímicas individuales

Los enlaces cruzados de las cadenas peptídicas entre los polisacáridos dispuestos en paralelo forman un enrejado. Los puentes compuestos de cadenas peptídicas de pentaglicina (GLY) conectan el carboxilo a del residuo de D-alanina terminal de una cadena con el grupo amino de un residuo de L-lisina de la cadena siguiente (15). NH3CHCOO~'; I \ > 1 \ CH3 \

NH2CHCOO“ | (CH2)3

j H2 ' í NH3) Alanina

Lisina

La rigidez final impartida a la pared celular por los enlaces cruzados de las cadenas adyacentes se lo gra por la oclusión de los puentes entre algunas de las unidades de péptidos (8) por un proceso de transpeptidación (8). El entrecruzamiento por transpeptidación ocurre fuera del citoplasma (8) y está m edia do por diversas enzimas (15). La especificidad de la lisostafina parece estar basada en su acción peptidolítica sobre los entrecruzamien tos de pentaglicina característicos de las paredes celulares estafilocócicas (14). Dado que todas las cadenas de peptidoglucano están entrecruzadas, cada capa de peptidoglucano es una única molécula gigante (15). Las bacterias grampositivas presentan una gran variación en la composición de sus peptidoglucanos (8). Reacciones de cruzamiento de puentes existen en las células en fase de crecimiento pero, no en las células en reposo (8). Existen significativas diferencias en las cadenas laterales de los tetrapéptidos y en los puentes peptídicos entrecruzados; varían entre las especies (15). También existen significativas dife rencias entre diversas especies de Staphylococcus', en consecuencia, algunas especies son más sensibles a la lisostafina que otras (4,18). S. aureus subesp. aureus, S. simulans, S. xylosus y S. cohnii son más sen sibles a la lisostafina (18). S. saprophyticus, S. haemolyticus, S. hominis son menos sensibles que S. au reus subesp. aureus debido a la presencia de serina en el puente interpeptídico (19); la sensibilidad de las diversas cepas de estafilococos depende de los contenidos de los puentes interpeptídicos (19). Las pare des celulares de Staphylococcus aureus subesp. aureus y S. epidermidis difieren en las cantidades relati vas de glicina y serina en los pentapéptidos de los puentes interpeptídicos (6, 7, 27, 29).

Lisostafina La lisostafina es una mezcla de enzimas: peptidasas y lisozima. El componente más activo es una endopeptidasa lítica que d iv a los puentes entrecruzados pentapeptídicos del peptidoglucano (3, 14); d iv a los puentes glicina-glicina. La endopeptidasa estafilolítica (lisostafina) d iv a los puentes interpeptídicos de pentaglicina (19) y la liberación de glicina y alanina N-terminal causa la lisis. Los estafilococos son sensibles a la peptidasa, pero resistentes a la lisozima. La lisostafina lisa los estafilococos pero es inacti va contra la mayor parte de los otros microorganismos (5, 18, 21). Los micrococos carecen de puentes interpeptídicos tanto en el peptidoglucano como en los ácidos teicoicos (2).

Medios de crecimiento La composición de los medios de crecimiento es un factor importante. El crecimiento de estafiloco cos en un medio con alto contenido en serina aumenta el contenido de serina de la pared celular (22), lo que le confiere a las células más resistencia a la lisostafina (3). En los medios de cultivo complejos, la fuente de peptona influye en la concentración de aminoácidos (AA) (23). La peptona preparada a partir de la came posee un alto contenido de glicina y una cantidad relativamen te baja de serina; la peptona preparada a partir de la caseína posee una cantidad mucho más baja en glicina y relativamente alta en serina (22). Para maximizar la sensibilidad a la lisostafina, las bacterias a ser probadas deben ser cultivadas en medios líquidos con extracto de carne (12). La sensibilidad de las cadenas interpeptídicas del peptidoglucano depende del contenido de aminoácido del medio de cultivo (12). Según las especies y la cantidad relativa de glicina presente en el medio de crecimiento, algunos residuos de glicina pueden ser sustituidos por L-serina o L-alanina (2). Las paredes celulares de los estafilococos que

P r u e b a d e s e n s ib ilid a d a la lis o s ta fin a

287

crecen en un medio con alto contenido de serina son más resistentes a la lisostafina que aquellos estafi lococos que crecen en un medio con alto contenido de glicina (23).

IV.

REACTIVOS

A. Buffer fosfato, 0,02 M, pH 7,3 ± 0,2 (12, 26) F o sfato m onosódico, 0,2 M , N aH 2P 0 4 1 H 20 F o sfato disódico, 0,2 M , N a 2H P 0 4 * 1 2 FI20 A g u a d estila d a

9,5 m L 40,5 m L 100 m L

B. Solución stock de lisostafina (lOx) (12) (Nota: La lisostafina (Sigma) con actividad específica de 287 U/mL se utiliza para todos los procedimien tos de lisostafina.) 1. Método de Hájek (10) 2. Ingredientes, pH 7,4 ± 0,2 L iso stafin a (S igm a B u ffer fosfato C lo ru ro de sodio, N aC l

10 g

40 mL 0,4 g

3. La concentración final de la lisostafina en la mezcla es de 250 pg/mL. 4. Fraccionar alícuotas de 1 mL /tubo de prueba (13 x 100 mm). 5. Conservación:—20°C hasta que se reconstituye en la solución de buffer fosfato (14) C. Solución de trabajo de lisostafina (25 pg/mL) (12) 1. Ingredientes: a un tubo de 10 mL que contiene 1 mL de solución stock de lisostafina, agregar 9 mL de buffer fosfato. 2. M ezclar de manera vigorosa. 3. Conservación a. Refrigerador, 4-10°C, no más de 2 días. b. -20°C, menos de 30 días (26). c. -70°C, períodos prolongados.

PROCEDIMIENTOS

A. Prueba con disco 1. Disco; procedimiento de Poutrel y Caffin (18) a. Impregnar discos de papel estériles de 6 mm con una solución de lisostafina de 10 pg/m L con actividad específica de 287 U/mL. b. Esterilizar por filtración; filtro de 0,20 pm. c. Liofilizar; conservar en ambiente seco a 4°C hasta que sea necesario. 2. Inocular placas de agar de Muller-Hinton (M-H) con los microorganismos de prueba;*estándar de turbidez de McFarland 0,5 (17). Con un hisopo tomar una porción de la placa para obtener un de. sarrollo denso; se pueden inocular hasta 4 microorganismos de prueba por placa. 3. De manera aséptica, colocar un disco sobre cada inoculo. 4. Incubar: 35°C, 24 h; placas verticales (tapas hacia arriba). B. Equipo para la prueba de solución de lisostafina comercial (REMEL); seguir las indicaciones del fabricante (19). C. Cubiertas de agar; dos opciones: 1. Procedimiento 1 (12) a. Agar P; ingredientes P ep to n a E x tracto de levadura G lu co sa (dextrosa) C lo ru ro d e sodio, N aC l A g ar A g u a d esionizada

(1) Esterilizar: autoclave, 121°C. 15 Ib. 15 min.

10 5 1 5 15

g g g g g

1.000 mL

288

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

(2) Fraccionar 10-20 mL/placa de Petri (15 x 100 mm) Cubierta, prueba de la mancha (1) Agregar 0,1 m L de suspensión en solución fisiológica (alrededor de 107 unidades formadoras de colonia/mL) del microorganismo de prueba al tubo que contiene 3 m L de agar P blando, líquido. (2) M ezclar y verter sobre la superficie de placas de agar P blando solidificado. (3) Colocar 1 gota de solución de lisostafina estéril (200 (tg/mL) sobre el agar inoculado. La lisostafina difunde con rapidez en el medio (18). (4) Incubar a 35°C, 24-48 h. 2. Procedimiento 2 (12) a. Inoculo (1) Caldo infusión de corazón (HIB). (2) Incubar a 35°C no más de 18-24 h. b. Agitar el cultivo y agregar 5 gotas a cada uno de los dos tubos (prueba y control). c. Agregar 5 gotas de buffer fosfato al tubo control (C). d. Agregar 5 gotas de lisostafina al tubo de prueba (T). e. 35°C, en baño de agua; examinar a los 30, 60 y 120 min. b.

VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Sensible (susceptible, sens, S, +) Staphylococcus aureus subesp. aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus

ATCC25923 ATCC14990 ATCC15305

B. Resistente (R, — Micrococcus luteus

ATCC 4698

Vil. RESULTADOS

VIII. INTERPRETACIÓN A. ’Sensible (susceptible, sens, S) 1.Inhibición completa del crecimiento alrededor del disco o del inoculo en mancha o aclaramiento de la suspensión en la solución. 2. Especies de Staphylococcus. B. Resistente (Res, R) 1. F a lta de inhibición del crecimiento alrededor del disco o del inoculo en mancha; crecimiento visi ble o ausencia de aclaramiento de la suspensión en la solución. 2. Especies de Micrococcus.

IX.

PRECAUCIONES

A. Debe considerarse la acción de la lisostafina dependiente del medio cuando se utiliza la prueba de sen sibilidad a la lisostafina para distinguir las especies de Staphylococcus Je las especies de M icrococ cus (9). Para obtener resultados óptimos, el aislamiento de prueba debe crecer en un medio con base de peptona de carne con alto contenido de glicina más que en peptona de caseína (17). El factor críti co es el contenido de glicina en el medio ya que la glicina es una’parte importante de la pared celular estafilocócica y es esencial para la acción de la lisostafina (17). El medio hecho con caseína necesita ser complementado con 0,2-0,3% de glicina para la prueba de lisostafina (23). B. Algunas cepas de Micrococcus luteus, Kocuria rosea (antes Micrococcus roseus), Arthrobacter agilis (antes Micrococcus agilis) y Kytococcus sedentarius (antes Micrococcus sedentarius) demuestran sen sibilidad a la lisostafina, tal vez debido a los niveles de contaminación de la actividad de endo-P-A-acetilglucosaminidasa (2). Alrededor de 10% de Micrococcus resultaron sensibles o débilmente sensibles

P r u e b a d e s e n s ib ilid a d a la lis o s ta fin a

D. E.

F. G.

289

a la lisostafina y cepas ocasionales de S. epidérmidis, S. haemolyticus, S. wameri, S. capitis y S. hominis mostraron una leve resistencia (23, 24). Según Gunn y col. (9), la prueba de la lisostafina como única prueba para distinguir estafilococos y micrococos puede variar de acuerdo con la fuente de aislamiento, el método de comprobación y los criterios utilizados para evaluar la sensibilidad. Hájek (10) sugirió que 50% o más de la reducción en la turbidez después de 2 h de incubación es considerada positiva para la sensibilidad. Sin embargo, Gunn y col. (9) mostraron que el hecho de utilizar la interpretación de Hájek podría causar una iden tificación errónea de muchos estafilococos. Gunn y col. (9) encontraron que 83% de los estafilococos y 4% de los micrococos probados eran sensibles a la lisostafina. En la prueba del disco, el tiempo requerido para la lectura de los resultados es independiente del tiempo de incubación; el diámetro de la zona de inhibición no difiere después de 6 ,16 o 24 h de incubación (18). El agregado de solución de lisostafina al medio sólido disminuye la actividad de lisostafina con el tiempo; la solución debe prepararse en el momento en que se necesita o debe ser conservada en frac ciones congeladas (18). Las reacciones de cruzamiento de puentes existen en las células en fase de crecimiento, pero no en las células en reposo (8). Cuando surgen problemas con la prueba de la lisostafina para la identificación de estafilococos, deben utilizarse la prueba de oxidación-fermentación (OF) de la glucosa y el crecimiento facultativo en agar semisólido con tioglicolato (THIO) (9). La mayoría de las cepas de estafilococos que son resistentes a la lisostafina producen ácido a partir del glicerol (23). Los micrococos débilmente resistentes a la lisostafina o sensibles a la lisostafina no pro ducen ácido a partir del glicerol y son sensibles a la lisozima (23).

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290

Pruebas bioquímicas individuales

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CAPÍ TULO >

Prueba de malonato

I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 a 45) A. Diferenciar entre especies de Enterobacteriaceae. 1. Salmonella choleraesuis subesp. arizonae (+) y Salmonella choleraesuis subesp. diazonae (+) de otras especies de Salmonella (-). 2. Enterobacter asburiae (-), E. cloacae (V, variable) y E. sakazakü (V, por lo común - ) de otras es pecies de Enterobacter (+) (10). 3. Escherichia blattae (+), E. fergusonii (V) y E. vulneris (V, por lo común +) de otras especies de Escherichia (por lo común - ) (10). 4. Citrobacter amalonaticus ( -) y C .freundii (V, por lo común - ) de C. koseri (+) (10). 5. Klebsiella pneum oniae subesp. ozaenae (-) de otras especies de Klebsiella (+) (10). 6. Edwardsiella hoshinae (+) de otras especies de Edwardsiella (-) (10). 7. Serrada rubidaea (+) y S. fonticola (V, por lo común +) de otras subespecies de Serrada (10). 8. Salmonella choleraesuis subesp. salamae (+) de otras subespecies de S. choleraesuis. (10). 9. Pantoea agglomerans (+) (antes Enterobacter agglomerans) de P. dispersa (10). 10. Cedecea davisae (+), C. lapagei (+) y C. neteri (+) de las especies 3 y 5 de Cedecea (-). 11. Erwinia cacdcida (+) y E. persicinus (+) de otras especies de Erwinia (-). B. Ayudar en la diferenciación entre géneros: Leclercia adecarboxylata (+) (antes Escherichia adecarboxylata) de Escherichia cotí ( -) y Pantoea agglomerans (V) (antes Enterobacter agglomerans) (11). C. Otras especies entéricas malonato-positivas: especies de Kluyvera (V, por lo común +) (11), Rahnella aquatilis (+), grupo entérico 64 (+), Hafnia alvei, del Hafnia alvei del biogrupo 1 (V) y Budvicia aquatica (V).

III. BIOQUÍMICA El malonato es un inhibidor enzimático (9 ,1 5 ,1 7 ). Quastel y Woodridge (17) demostraron por prime ra vez que el ácido malónico (malonato) interfería con la oxidación del ácido succínico a ácido fumárico mediante la inhibición de la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa. El ácido malónico inactiva la enzima por un proceso denominado inhibición competitiva. La succínico deshidrogenasa trans fiere hidrógeno a un aceptor apropiado en la conversión de ácido succínico a ácido fumárico (2, 8, 9,15), pero esta reacción puede ser inhibida por un compuesto orgánico similar desde el punto de vista estruc tural al sustrato natural, el ácido succínico (15). El ácido malónico presenta una estructura similar al áci do succínico y compite por los sitios en la enzima. El ácido malónico difiere en su com posición quím ica del sustrato porque es un ácido dicarboxílico de 3 carbonos m ientras que el ácido succínico es un ácido dicarboxílico de 4 carbonos (1, 15).

292

Pruebas bioquímicas individuales COOH

COOH

CH2

(CH2)2

3*COOH

4*C 00H

Ácido malónico (malonato)

Ácido succínico

El ácido malónico se une a la enzima y ocupa los sitios activos; así, la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico, y se bloquea la oxidación del ácido succínico (15). Es necesa rio un complejo enzima-sustrato para la activación del sustrato, y si se bloquea la activación, no se forma el producto nuevo (ácido fumárico): E + S

Complejo ES —

E + P

Bloqueado por el malonato

donde E es la enzima, S es el sustrato y P es el producto. El grado de inhibición presenta una relación inversa a la razón de la concentración del inhibidor con la del sustrato (1, 2). El ácido malónico inhibe el ácido succínico porque es un análogo del metabolito normal, el ácido succínico, y este antagonismo metabólico inhibe el crecimiento (1, 2, 17). Sin embargo, la inhibición competitiva es reversible (17). Si se agrega al medio la concentración normal del sustrato (succinato) y está presente de un aceptor de hidrógeno (17), el malonato se libera de la enzima, la cual se encuentra libre para catalizar la oxidación del ácido succínico a ácido fumárico. La inhibición por el malonato de la succínico deshidrogenasa frena la enzima estequiométricamente (8) y se acumula ácido succínico (8, 13). De acuerdo con la concentración del malonato, se puede retar dar la velocidad de oxidación del ácido succínico o lograr la completa inhibición. En el ciclo de Krebs, sobre cada compuesto ácido independiente actúan enzimas específicas; una m o lécula se usa y una se forma de un modo progresivo. Si se suprime la formación de un único ácido (p. ej., ácido fumárico) y éste no es reemplazado, el ciclo de Krebs cesa de funcionar (1). Dado que mucha energía para el metabolismo bacteriano es proporcionada por el ciclo de Krebs (1), la célula bacteriana debe contar entonces con el ciclo del ácido glioxflico para producir los intermedia rios, para la biosíntesis ulterior incluida en el metabolismo continuo. Mediante el ciclo del ácido glioxílico, la célula bacteriana regula la cantidad de acetil coenzima A (acetil-CoA) introducida en el ciclo pa ra su continuación, la cual es controlada por la actividad de la enzima isocitratasa (1). Sin embargo, el aumento de la concentración del ácido succínico también inhibe la isocitratasa, lo cual produce una au sencia de ácido glioxílico yib rm ació n de ácido acético (1). Piruvato

Acetil CoA

Malato

cis- Acó rntato

Isocitrato

Fumarato

Succinato

a-Cetoglutarato

t Inhibición del malonato Ciclo de Krebs abreviado

P r u e b a d e m a lo n a to

293

La mayoría de las bacterias pueden sintetizar una pequeña cantidad de isocitrato en ciertas condicio nes, pero esta síntesis es inhibida por el agregado de ácido succínico al medio de cultivo (1). 2 Ácido acético + Ácido oxalacético

Isocitratasa Ácido succínico Ciclo del ácido glioxílico (1) En consecuencia, la acumulación de ácido succínico a causa de la inhibición de la succínico deshidrogenasa interrumpe el ciclo de Krebs, lo que priva a algunos microorganismos de su fuente de energía y también interfiere con el ciclo del ácido glioxílico, lo que detiene la ulterior producción de intermedia rios requeridos para la biosíntesis de los nuevos compuestos necesarios para el metabolismo. El resulta do final es que los microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentar (12) o utilizar (18) el malonato de sodio como única fuente de carbono. Si esta reacción es esencial para la ac tividad metabólica de una bacteria, entonces el inhibidor malonato exhibe actividad antibacteriana. Leifson (12) describió la prueba de malonato de sodio como una fermentación, mientras que Shaw (18) la denominó utilización. Leifson (12) también mostró una correlación entre la producción de acetilmetilcarbinol (acetoína) y la fenuentación del malonato de sodio por Escherichia coli y el grupo Klebsiella-Entcrobacter. Esta correlación no pertenece a otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (11) (cuadro 25-1). Cuadro 25-1. R e su lta do s de m a lo n a to y a ce to ín a de E sch e rich ia -K Ie b sie U a -^n te ro b a cte r

Escherichia coli Acetoína (VP) Malonato de sodio

—

G rupos

Klebsiella-Enterobacter + +

IV MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS A.

Caldo para malonato modificado (caldo para malonato, Ewing) (4, 6 ,1 2 ,1 6 ) 1. Modificación de la fórmula original de Leifson (12) por el agregado de extracto de levadura y glu cosa realizada por Ewing, Davis y Reavis (7) 2. Ingredientes, pH 6,7 ± 0,2 Extracto de levadura Sulfato de amonio, (NH4)2S04 Fosfato dipotásico, K2HP04 Fosfato monopotásico, KH2P04 Cloruro de sodio, NaCl Malonato de sodio Glucosa (dextrosa) Azul de bromotimol (BTB) Agua desionizada

1g 2g 0,6 g 0,4 g 2g 3g 0,25 g 0,025 g 1.000 mL

3. Indicador de pH: azul de bromotimol (BTB) a. Ácido: color amarillo, pH 6. b. Alcalino: color azul de Prusia oscuro, pH 7,6. c. Medio no inoculado: pH 6.7; color verde. Los fosfatos presentes en el medio corrigen el pH a 6,7 (levemente ácido), por lo que el medio es ver de con el indicador de pH BTB (4, 12, 16).

294

Pruebas bioquímicas individuales

B. Caldo para malonato con fenilalanina. 1. M edio de Shaw y Clarke (19)

2. Agregar DL-fenilalanina, 0,2%; 2 g/L a la base de malonato antes de la esterilización de la base. Si se utiliza L-fenilalanina, usar sólo 1 g/L (3).

3. Después de interpretar los resultados del malonato, agregar directamente al tubo.

C. D. ,

E. F. G.

a. HC1N/10: 5 gotas. b. Solución de cloruro fénico, 8%: 3-5 gotas. c. Véase capítulo 34, Prueba de fenilalanina desaminasa, para la interpretación. Discos de malonato: disponibles en el comercio por BBL; seguir las directivas del fabricante. Método de preparación; cualquier medio. 1. Pesar la cantidad exacta como indica el rótulo. Las diferentes compañías pueden mostrar leves di ferencias. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada. 3. Calentar la solución suavemente. 4. Fraccionar alrededor de 3 mL por tubo con tapa a rosca (13 x 100 mm). Método de esterilización: autoclave; 121°C, 15 Ib, 15 min. Enfriar antes del uso y refrigerar para la conservación (4-10°C) hasta 3 meses (14). Inoculación 1. Crecimiento a partir de un cultivo puro de 18 a 24 h: agar con hierro de Kligler (KIA) u otro m e dio apropiado. 2. Inoculo liviano. Incubación: 35°C; 24-48 h; observar la presencia de crecimiento al final de cada período (6).

Tanto la glucosa como el malonato sirven como fuente de carbono (20). Sin embargo, la alcalinización espontánea causada por el crecimiento bacteriano es amortiguada por la fermentación de la glucosa y por los fosfatos incorporados al medio (5). El extracto de levadura, la fuente de vitamina, y las trazas de gluco sa, la fuente de carbono mínima, pueden ser eliminados en la fórmula, pero son necesarios para estimular el crecimiento de algunos microorganismos (3), en especial Salmonella (20). Los microorganismos que no pue den utilizar las sales de amonio o el malonato como fuente de carbono pueden crecer en estos medios.

V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Positivo Enterubacter aerogenes Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

ATCC 13048 ATCC 13883

Escherichia coli

ATCC 25922

B. Negativo

No inoculado

VI.

RESULTADOS Véase fig u ra 25-1 (A péndice 1) p a ra los resultados fotográficos en color.

Vil. INTERPRETACIÓN A.

Malonato 1. Positivo a. Reacción alcalina. b. Color azul pálido, a color azul Prusia oscuro en todo el medio. 2. Negativo (-): sin cambios de color (verde) o amarillo (sólo fermentación de la glucosa). En el medio de malonato diseñado por Leifson (12), el malonato de sodio es la única fuente de car bono disponible. Si un miemorganismo utiliza malonato de sodio como su fuente de carbono en el mismo momento que utiliza el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, la alcalinidad aumenta

Prueba de malonato 295 debido a la formación de hidróxido de sodio (NaOH) y bicarbonato de sodio (NaH C03) (14). Dado que todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae fermentan la glucosa, aquellos que no pue den utilizar el malonato acidifican el medio (20); el azul de bromotimol vira al color amarillo.

B. Fenilalanina 1. Positivo (+): color verde oscuro. 2. Negativo (-): sin cambios; el medio permanece de color azul pálido.

VIII. PRECAUCIONES

_______________

A. Según Oberhofer (14), la prueba de malonato comprueba técnicamente la alcalinización más que la utilización. B. Algunos microorganismos malonato-positivos producen sólo una leve alcalinidad, lo cual hace difícil interpretar los resultados. Si se duda, comparar con un tubo de malonato sin inocular. Cualquier traza de color azul denota una prueba positiva al final de 48 h de incubación. Una interpretación final nega tiva no debe realizarse hasta que los tubos hayan sido incubados durante 48 h. Se debe tener cuidado cuando se interpretan los resultados después de una incubación prolongada. Puede notarse un leve azulado (azul-verde) y puede aparecer una reacción positiva débil, pero deben ignorarse (14). C. Algunas cepas malonato negativas producen un color amarillo. Esto se debe a que la fermentación de la glu cosa sólo aumenta la acidez, lo cual produce un cambio del indicador de pH al amarillo a un pH de 6. D. E. coli y los grupos Klebsiella-Enterobacter no requieren en absoluto enriquecimientos con extracto de levadura y glucosa; sin embargo, la incorporación de estas dos sustancias en el medio con malona to se recomienda para la diferenciación de las especies de Salmonella.

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CAPÍ TULO

Prueba de reducción de la leche del azul de metileno para enterococos I. PRINCIPIO Diferenciar microorganismos por su capacidad enzimática para reducir el azul de metileno en un m e dio con leche.

II.

OBJETIVO

(Véase también cap. 43) Esta capacidad enzimática se utiliza sobre todo para diferenciar especies de Enterococcus de estrep tococos del grupo D y de otras especies de Streptococcus. Las especies de Enterococcus del grupo D in cluidas antes en el género Streptococcus y las especies de Streptococcus del grupo D se muestran aquí. Especies de Enterococcus del g ru p o D (antes incluidas en el género Streptococcus) (2, 6-8, 10, 12, 13, 17, 19.-21, 23, 25, 26) E. E. E. E. E.

asini E.columbae avium E. dispar casseliflavus E. durans cecorum faecalis (antes subespecies: Streptococcus faecalis subesp. liquefaciens, S. faecalis subesp. zymogens y S. faecalis subesp. faecalis. no más reconocidas, se agrupan en una especie, Ente rococcus faecalis (3, 18)) E. faecium (antes Streptococcus faecium subesp. casseliflavus, en la actualidad una especie separa da de Enterococcus (7, 29)) E. flavescens E. pseudoavium E. gallinarum E. rafñnosus E. hirae E. saccharolyticus E. malodoratus E. solitarius E. mundtii E. sulfureus (.Enterococcus seriolicida, ahora Lactococcus gervieae) Especies de Streptococcus del gru p o D S. S.

III.

bovis equinus

BIOQUÍMICA

El sistema citocromo oxidasa activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular (28), el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de elec trones (22, 28). Cuando existen condiciones aerobias (presencia de oxígeno atmosférico), el oxígeno es el aceptor final de hidrógeno, que produce agua o peróxido de hidrógeno (H20 2) según la especie bacteriana y su sistema enzimático. El sistema de citocromo por lo común sólo está presente en los microorganismos aerobios (4), lo que les permite utilizar el oxígeno como aceptor final de hidrógeno para reducir el oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno, el cual, se incorpora en la cadena de la respiración aerobia (4,14).

Prueba de reducción de la leche del azul de metileno para enterococos 297 Los sustratos artificiales, como el azul de metileno, pueden sustituir el aceptor natural de electrones en cualquier parte dentro de la cadena de transporte de electrones, donde actúan como reductores del citocromo c del sistema de citocromo oxidasa (5, 15, 22, 27). El azul de metileno, una sal básica, es un in dicador de oxidación-reducción que, cuando se incorpora en el medio, denota cambios en el potencial de oxidación-reducción. Ciertos microorganismos pueden utilizar el oxígeno disuelto en un medio y en con secuencia pueden reducir el potencial de oxidación-reducción; la reducción es catalizada por la enzima reductasa (16, 22), una enzima respiratoria involucrada en la oxidación celular. Cuando se agrega el colorante sintético reducible azul de metileno al medio que contiene microorga nismos metabolizantes, los electrones producidos a partir de un sustrato oxidable se desvían de su vía metabólica normal (si se produce reductasa) y son utilizados para reducir el colorante (27). En anaerobiosis, el azul, forma oxidada del azul del metileno, es reducido por el microorganismo a un compuesto azul de leucometileno, incoloro, hidrogenado (16, 24, 27). Esta reducción ocurre en presencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) (difosfopiridín nucleótido; DPN o DPNH) o de succinato junto con el sis tema de oxidasa apropiado (24). La reductasa se clasifica como una deshidrogenasa, ya que se transfie ren dos liidrógenos de su sustrato normal al aceptor de electrones artificial azul de metileno sin el com promiso del oxígeno molecular (15). A continuación se muestra la reducción del azul de metileno (22).

N(CH3)2

(CH3)2N

Azul de metileno (MeB) (estado oxidado)(color azul)

Azul de leucometileno (MeB-H2) (estado reducido) (incoloro) MeB + 2 H+

rleductasa

Estado oxidado

Meb-H2 Estado reducido

En aerobiosis, el azul de leucometileno reducido es oxidado de modo espontáneo y el oxígeno m ole cular actúa como aceptor terminal de hidrógeno (16, 27). La oxidación del azul de metileno reducido pro duce peróxido de hidrógeno como producto final (15, 27). MeB-H2 -------- MeB Estado reducido

H2 O2

Estado oxidado

Peróxido de hidrógeno

Por consiguiente, en presencia de oxígeno atmosférico, el azul de metileno interviene en el transpor te de electrones; el sistema de citocromo es evitado y tiene lugar la fosforilación no oxidativa (27). En el sistema de transporte de electrones, la transferencia de electrones involucra una flavoproteína (coenzima: flavina adenina dinucleótido, FAD) (27).

Sustrato— J L)PN(NADH)

citocromos

h 2o

de mgtüeno

H2Q2

FAD

298

Pruebas bioquímicas individuales

La mayoría de los microorganismos contiene la enzima catalasa que degrada el peróxido de hidróge no (4), ya que su acumulación es tóxica. Sin embargo, las especies de Streptococcus no producen catala sa y ocurre la muerte si se deja que se acumule el peróxido de hidrógeno. Las especies de Enterococcus por lo común son todas capaces de reducir el azul de metileno a su estado incoloro; las especies de Strep tococcus fallan en decolorar el medio de leche del azul de metileno (MBM).

IV. MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: MEDIO CON LECHE, pH 6,4____________________ A. Ingredientes, base (1) Leche desnatada, deshidratada Agua desionizada

100 g

1.000 mL

B. Método de preparación, base 1. Pesar la cantidad según las directivas del rótulo. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada, con preferencia calentada con anterioridad a 50°C. 3. Calentar con suavidad la solución; evitar la caramelización de la leche. C. Preparación del indicador de oxidación-reducción: colorante azul de metileno 1. Agregar una concentración al 1% de colorante (10 g/L) al medio con leche desnatada rehidrata do o 100 mL de una solución acuosa al 1% por 900 mL de base (1). a. Estado oxidado: azul. b. Estado reducido: incoloro. 2. Medio no inoculado, pH 6,4; color azul, estado oxidado. D. Fraccionar el medio con leche y azul de metileno, alrededor 10 mL por cada tubo con tapa a rosca (16 x 125 mm). E. Método de esterilización: autoclave; 113-115°C, 8-10 Ib, 20 min. F. Enfriar antes de utilizar, con las tapas a rosca hacia abajo y conservar refrigerado (4-10°C); el venci miento es aproximadamente a los 6 meses. G. Inoculación 1. Inoculo denso. 2. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h; una única colonia en medio sólido o un cultivo de caldo de una especie confirmada de Enterococcus o Streptococcus (cocos grampositivos catalasa negativos, dispuestos en forma aislada, en pares o en cadenas; patrón hemolítico va riable; insoluble en bilis y resistente a la optoquina). 3. Agitar el tubo con suavidad para suspender las bacterias. H. Incubación: en aerobiosis, 35°C; 18-24 h.

V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD______________ A. Positivo (+, R, Reducción): Enterococcus faecalis, B. Negativo (-, NR, sin reducción): 1. Streptococcus pyogenes, 2. No inoculado

VI.

RESULTADOS

ATCC 29212 4TCC 19615

________________________ Véase figura 26-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos color.

Vil. INTERPRETACIÓN A. Positivo (+) 1. Reducción (R); medio incoloro. 2. Por lo común, una especie de Enterococcus. B. Negativo (-) 1. Sin reducción (NR); el medio permanece azul. 2. Especies de Streptococcus.

Prueba de reducción de la leche del azul de metileno para enterococos 299 VIII. PRECAUCIONES A. Otros microorganismos además de los enterococos pueden reducir el azul de metileno. En consecuen cia, el microorganismo que se está probando debe ser confirmado como una especie de Enterococcus antes de utilizar este procedimiento para diferenciar dentro del género. Asimismo, dentro de los mi croorganismos del grupo D, otros microorganismos distintos de los enterococos mostraron en ocasio nes reducir la MBM. Facklam (9) mostró que todos los enterococos del grupo D podrían reducir la MBM a su estado incoloro, mientras que entre los estreptococos del grupo D no enterococos, S. equinus fue incapaz de reducir la MBM. Alrededor de 60%jde las cepas de S. bovis redujeron la MBM, lo que determina que la reacción sea variable y esto lim ita la utilidad de la MBM como un medio para diferenciar entre los enterococos del grupo D y los m icroorganism os del grupo D no enterococos (S. equinus y S. bovis) o entre los enterococos del grupo D y otras especies de Streptococcus que no son del grupo D. Los estreptococos lácticos, grupo N, también reducen la MBM, como lo hacen algu nas cepas de los grupos E y G (11). Sin embargo, Facklam (9) recomienda la no reducción de la MBM como un medio para identificar S. avium (grupo Q, pero también reacción débil para el grupo D), da do que desde el punto de vista fisiológico es similar a E. faecium . Para identificar los enterococos y no enterococos del grupo D y para diferenciar entre ellos y los estreptococos que no son del grupo D, Facklam y M oody (11) recomiendan la prueba de bilis y esculina como la prueba de elección, seguida por el caldo S. faecalis (SF) y luego las pruebas de la M BM y de tolerancia a la sal. La realización de una combinación de pruebas o de los cuatro procedimientos de prueba reforzaría en gran m edida la diferenciación p resu n tiv a entre los estreptococos del grupo D y los que no son del grupo D y la diferenciación entre especies de enterococos y de no enterococos dentro del grupo D. B. El tiempo requerido para la reducción del azul del metileno se relaciona de modo directo con la can tidad de bacterias presentes (4); cuanto más denso es el inoculo de un microorganismo positivo, más corto es el tiempo necesario para la reducción. No es raro que la reducción ocurra en el curso de po cas horas de incubación. REFERENCIAS 1. Baron EJ, Finegold SM. Bailey & Scott’s Diagnos tic Microbiology, ed 8. Philadelphia: CV Mosby, 1990:A19. 2. Bridge PD, Sneath PHA. Streptococcus gallinarum sp. nov. and Streptococcus oralis sp. nov. Int J Syst Bacteriol 1982132:410-415. 3. Bridge PD, Sneath PHA. Numerical taxonomy of Streptococcus. J Gen Microbiol 1983;129:565-597. 4. Burrows W, Lewert RM, Rippon JW. Textbook of Microbiology. The Pathogenic Microorganisms, ed 19. Philadelphia: WB Saunders, 1968:110-111,326. 5. Cantarow A, Schepartz B. Biochemistry, ed 3. Phi ladelphia: WB Saunders, 1962:385. 6. Collins MD, Farrow JAE, Jones D. Enterococcus mundtii sp nov. Int J Syst Bacteriol 1986;36(1):812.

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CAPÍ TULO

Prueba de rojo de metilo

PRINCIPIO

A. Probar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos finales áci dos a partir de la fermentación de la glucosa y para vencer la capacidad buffer del sistema. B. Ésta es una prueba cuantitativa para la producción de ácido (determinación de pH); algunos microor ganismos producen más ácidos que otros.

II.

OBJETIVO

________

(Véanse también caps. 43 a 45) Los resultados del rojo de metilo son características valiosas para la identificación de especies bacte rianas que producen ácidos fuertes a partir de la glucosa (13) A. Ayudar a la diferenciación entre géneros o a la diferenciación de especies dentro de un género de la familia Enterobacteriaceae. La prueba de rojo de metilo es parte de la batería de pruebas del IMViC (indol-rojo de metilo-Voges-Proskauer-citrato). 1. Escherichia coli (MR+) de Enterobacter aerogenes (M R -) y Enterubacter cloacae (M R -). 2. Especies de Yersinia (V, variable, por lo común +) de otros bacilos gramnegativos no entéricos (M R -). 3. Diferenciar Edwardsiella ictaluri (M R -) de E. hoshinae (MR+) y E. tarda del biogrupo 1 (MR+) ( 11).

4. Diferenciar Leminorella richardii (M R -) de L grimontii (MR+) (11). 5. Diferenciar Klebsiella oxytoca y K. pneum oniae subesp. pneumoniae (ambas V, por lo común M R -) y K. terrigena (V) de otras especies o subespecies de Klebsiella. (MR+) (11). 6. Budvicia aquatica (MR+) de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae con resultados KIA/TSI Ácido/Ácido, HS2. B. Otros microorganismos que son rojo de metilo positivos. 1. Aerococcus urinae (MR+) de A. viridans (M R -) 2. Todas las especies de Shigella (MR+) 3. Ewingella americana (MR+) 4. Especies de Kluyvera (MR+) 5 Leclercia adecarboxylata (MR+) 6. Especies de Citrobacter (MR+) 7. Buttiauxella agrestis (MR+) C. Las pruebas de rojo de metilo y Voges-Proskauer se utilizan para ayudar en la identificación de 1. Aerom onas hydrophila 420 pg/mL) (64), lo que conduce a un resultado falso negativo. El pH puede estar au mentado a la alcalinidad por la producción de C 0 32- a partir del H C 0 3_ (64) o Neisseria puede uti lizar H C 0 3 como un factor de crecimiento (63). 5. El sistema mostró algunas reacciones positivas débiles de la glucosa con algunas cepas de N. ci nérea, lo cual puede producir una identificación equivocada de N. gonorrhoeae (10, 24). E. Pruebas FA 1. En la actualidad se dispone en el comercio de anticuerpos para FA sólo para N. gonorrhoeae (76). 2. Existen algunas reacciones cruzadas entre cepas de gonococos y meningococos y entre gonococos y estafilococos; diríjase al procedimiento de la prueba para la eliminación de esta reactividad cru zada. 3. El M icroTrak de Syva no está dirigido a la detección e identificación directa de los microorganis mos en los frotis de las muestras de los pacientes (53). 4. En la prueba Phadebact GC Omni, una suspensión de microorganismos más densa que la densidad especificada de McFarland puede brindar resultados falsos positivos (53). 5 En la prueba Phadebact GC Omni se informó que el uso de solución fisiológica con un pH supe rior o inferior de 7,4 produce resultados falsos positivos con algunas cepas de N. lactamica, N. ci nérea y M. catarrhalis (15, 22, 41, 51).

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CAPI TULO

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos I.

PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre.

II.

OBJETIVO

(Véanse también caps. 43-45) A . Reducción de nitratos 1. Ayudar a la diferenciación de especies a. A fp ia fe lis (+) de A. broomeae (-) y A. clevelandensis (-). b. Alcaligenes faecalis (-) de A. latus (+). c. Bartonella fe lis (+) de otras especies de Bartonella (-) aisladas con más frecuencia. d. Bordetella bronchiseptica (+) de B. avium (-), B. parapertussis (-) y B. pertussis (-). e. Capnocytophaga sputigena (+) y C. cynodegmi (Ñ, variable) de C. canimorsus (-), C. gingivalis (-) y C. ochracea (-). f. H elicobacter cinaedi (+) y H. mustelae (+) de H. fennelliae (-) y H. pylori (V). g. Kingella denitrificans (+) de K. kingae (-). h. Microbacterium lacticum (+) de M. arborescens ( - ) , M. impértale (-) y M. laevaniformens (-). i. Mobiluncus curtisii subesp. holmesii (+) de M. curtisii subesp. curtisii (-) y M. milieris (-). j. Moraxella atlantae ( - ) , M. lincolnii (-) y M. osloensis (V) de M. catarrhalis (V, por lo común +) y M. bovis (V). k. Neisjpria canis (+), N. mucosa (+), M. polysaccharea (+) de otras especies de Neisseria (-) ais ladas con más frecuencia. l. Pasteurella lymphangitis (-) de otras especies de Pasteurella (+). m. Peptostreptococcus indolicus (+) y P. prevotii (V) de otras especies de Peptostreptococcus (-) que pueden causar infecciones humanas. n. Sphingobacterium thalpophilum (+) de S. multivorum (-) y S. spiritivorum (-) . o. Vibrio harveyi (-) y V. metschnikovii (-) de otras especies de Vibrio (+) aisladas con más fre cuencia. 2. Ayudar a la diferenciación entre géneros a. Especies de Haemophilus (+), Neisseria gonorrhoeae (-), Kingella denitrificans (+) y M oraxe lla catarrhalis (V, por lo común +) (20). b. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae (+) excepto ciertos biotipos de Pantoea agglomerans y ciertas especies de Serrada y Yersinia (20). 3. Diferenciar especies de M ycobacterium. M. tuberculosis (+), M. kansasii (+), M. szulgai (+) y M. fortuitum (+) de otras especies de Mycobacterium ( - ) .

B. Reducción de nitratos y nitritos 1. Gemella haemolysans (N 0 3+ /N 0 2+) de G. morbillorum (N 0 3_/N 0 2_). 2. Diferenciación entre especies de Neisseria y especies de Moraxella de origen animal; no es de uti lidad para la diferenciación entre especies humanas (3, 19, 23) (cuadro 30-1).

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos 327 Cuadro 30-1. Diferenciación entre especies de Neisseria y Moraxella de origen animal M ic ro o rg a n is m o

n o

N e is s e ria N e is s e ria N e is s e n a M o ra x e lla M o ra x e lla M o ra x e lla

+ V + + + V

c a n is w e a v e ri ig u a n a e c a v ia l ovisecu n ic u li*

n o

V + V 4-

V V“

Datos de las referencias 3, 19, 23, 24. a Antes en el género Neisseria; especies de origen animal.

III. BIOQUÍMICA La reducción de nitrato (N 0 3- ) a nitrito (N 0 2 ) y a nitrógeno gaseoso (N2) por lo común se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales en un microorganismo produce su oxígeno del nitrato (12, 30). El oxígeno actúa como un aceptor de hidrógeno (30); es decir, el protón y el aceptor final de electro nes (35). La mayoría de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y sólo pueden reducir los nitra tos en ausencia de oxígeno (35). Esta respiración anaerobia es un proceso de oxidación en el que las sus tancias inorgánicas (sobre todo nitrato y sulfato, rara vez carbonato) producen oxígeno para actuar como un aceptor de electrones a fin de proporcionar energía (35). En la reducción de nitratos, los citocromos bacterianos transportan electrones a moléculas aceptoras específicas (17, 35). Gunsalus y Stanier (17) es tablecieron que el nitrato actúa como último oxidante en los sistemas de citocromos. La reducción de ni tratos característica de una especie particular es más o menos constante (41).

Reducción de nitratos a nitritos (35) R educción de nitratos a nitritos (24)

NO3

+ 2 é + 2 H+ —»-NO) +

Nitrato

H20

Nitrito

Las posibilidades del producto final en la reducción del nitrato son muchas: nitrito (N 0 2), amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2), óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N20 ) o hidroxilamina (R N H O H ) (6, 10, 11, 17, 25, 34). El producto formado depende de la especie bacteriana (25). El producto final más común es el nitrógeno molecular (un gas) formado por la vía de la reducción del nitrito (35). De acuerdo con las condiciones ambientales, estos productos por lo común no son oxidados con posterioridad ni asi milados en el metabolismo celular, pero son excretados en el medio circundante (25, 34). La reducción de nitrato a nitrógeno gaseoso (N2) u óxido nitroso (N20 ) se denomina desnitrificación (32, 35). El ni trato actúa como un aceptor de electrones; por cada molécula de nitrato reducido se aceptan cinco elec trones (35). 2 NO3

10 é +

12 H+ —»-N2

+ 6 H 20

Nitrato a nitrógeno molecular (35) En el proceso de desnitrificación, puede acumularse óxido nitroso (un intermediario) si la concentra ción de nitrato es alta; cuando la concentración de nitrato es baja, el óxido nitroso es reducido con poste rioridad a nitrógeno molecular (35). En la reducción de nitratos pueden ocurrir diversos procesos para la utilización de los productos finales obtenidos. El amoníaco o la hidroxilamina pueden estar asimilados en los componentes celulares que contienen nitrógeno (proteínas y ácidos nucleicos) para la síntesis de nue vos compuestos (25, 34). Por consiguiente, en la prueba de reducción de nitratos, la reducción se eviden cia por la presencia de un producto final catabólico o por la ausencia de nitrato en el medio.

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS: MEDIO NITRATO DE POTASIO, DOS VARIANTES A. Caldo nitrato: pH 7 (12). B. Agar nitrato: pH 6,8 (12).

328

Pruebas bioquímicas individuales

C. Ingredientes: cualquier medio

Extracto de carne Peptona de gelatina Nitrato de potasio, KN03, 0,1% Agar (sólo en el medio sólido), exento de nitrito Agua desionizada

3g 5g lg 12 g 1.000 mL

D. Productos comerciales disponibles: BBL, Difeo, nitrate broth (caldo nitrato). E. Método de preparación 1. Pesar la cantidad exacta como indica el rótulo. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar la solución con suavidad. 4. Fraccionar alrededor de a. Agar nitrato: 5 mL por tubo (13 x 100 mm). b. Caldo nitrato: 1 mL por tubo (13 x 100 mm) (2); agregar tubos de Durham invertidos para de tectar la producción de gas. F. Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. G. Dejar que el medio de agar nitrato solidifique en una posición inclinada. H. Enfriar cualquiera de los medios antes del uso y conservar en refrigerador (4-10°C). El vencimiento es aproximadamente a los 6 meses. I. Inoculación 1. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h en agar con hierro de Kligler o (KIA) u otro cultivo apropiado. 2. Medio líquido: inoculo denso (42). 3. Medio de agar inclinado: estría en el pico de flauta y punción en el fondo del tubo (12). 4. Deben comprobarse de manera simultánea dos controles. a. Tubo control 1: inoculado con un microorganismo conocido nitrato positivo (39). b. Tubo control 2: no inoculado, pero incubado en las mismas condiciones que los tubos inocu lados. Control para determinar si hay presencia de nitrito en el medio (39). J. Incubación: 35°C, 12-24 h (12); raras veces puede ser necesaria una incubación prolongada de hasta 5 días (10). K. Agregar reactivos de nitrato antes de intentar una interpretación. La mayor parte de los microorganis mos capaces de reducir el nitrato lo hace dentro de las 24 h. El medio de nitrato utilizado puede ser lí quido o un agar en pico de flauta. Sin embargo, ZoBell (41) y Hitchens (18) recomiendan el empleo de un medio semisólido que contenga 0,2-0,4% de agar. ZoBell (41) establece que un medio semisólido incrementa la reproducción, permite la movilidad de los microorganismos móviles, difunde con facilidad los nutrientes y productos de desecho e incrementa las actividades reductoras de los m icroor ganismos. ZoBell también establece que: a) muchos microorganismos fallan en reducir el nitrato en el medio líquido o sólido, pero lo hacen en un medio semisólido y b) algunos patógenos microaerófilos sólo se reproducen en un medio semisólido (41). ZoBell (41) encontró que la reducción de nitratos es mayor, tanto en el grado como en el porcentaje de reacciones positivas, cuando los microorganismos fueron cultivados en un medio semisólido y más bajo en un medio líquido. Hitchens (18) realizó dos observaciones acerca del uso del medio semisólido para el cultivo: a) muchos microorganismos exi gentes que fallan en reproducirse en un medio líquido o sólido, lo hacen en un medio semisólido y b) un medio semisólido retrasa la difusión del oxígeno, lo que proporciona todos los grados de aerobiosis en alguna área del tubo. Cualquier medio basal que contiene nitrato de potasio al 0,1% (K N 0 3) es satisfactorio (41), f lo r e c e el crecimiento (41) y proporciona condiciones de suficiente anaerobiosis para la enzima nitratasa sensible al oxígeno (39). Debe incubarse un tubo control no inoculado y probarse para la reducción de nitratos junto con tubos inoculados y debe realizarse una comparación antes de interpretar los resultados (12).

V. REACTIVOS EMPLEADOS A. Á cido acético, 5 N , 30%

Ácido acético glacial, CH3COOH Agua desionizada llevar a

30 mL 1.000 mL

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos 329 (N ota:

Los reactivos para nitrato fueron desarrollados por el químico alemán Griese en el siglo XIX (16).)

B. Reactivo A: dos opciones (2, 10) 1. a-Naftilamina, 0,5%: se determinó que la a-naftilam ina era carcinógena; como precaución se pre fiere el empleo de V.A-dimetil-a-naftilamina (1). 2. N,N-dimetil-a-naftilamina, 0,6% ; Eastman Chemical Company (véase Apéndice 11). a. Ingredientes A(lV-Dimetil-a-naftilaimna, C|0H7N(CH3)2 (o a-naftilamina, C10H7NH25g) Ácido acético glacial, 5 N, 30%

6g 1.000 mL

b. Método de preparación (1) Disolver cada sustancia química en menos de 1.000 mL de ácido acético 5 N por calenta miento suave. (2) Transferir la solución a un frasco graduado de 1 L y llevar a 1.000 mL con ácido acético 5 N. (3) Filtrar la solución a través de algodón absorbente lavado. (4) Conservar en botella de vidrio color caramelo con tapa (1). (5) Rotular de manera correcta. C. Reactivo B: ácido sulfanílico, 0,8% (2,10); sustancia cristalina seca, Sigma-Aldrich (véase Apéndice 11). 1. Ingredientes Ácido sulfanílico (ácido p-aminobenceno sulfónico), H2NC6H4S 03H H 20 Ácido glacial acético, 5 N, 30%

8g 1.000 mL

2. Método de preparación a. Disolver el ácido sulfanílico en menos de 1.000 m L de ácido acético 5 N. b. Transferir la solución a un frasco graduado de 1 L y llevar a 1.000 m L con ácido acético 5 N. c. Conservar en botella de vidrio con tapa (2). d. Rotular de manera correcta.

D. Reactivo de Nessler (10) 1. Disolver 5 g de yoduro de potasio (KI) en 5 mL de agua desionizada; el agua no debe contener amoníaco (NH3). 2. Agregar una solución saturada de cloruro de mercurio (HgCl2) fría hasta que aparezca un leve precipitado después de la agitación. 3. Agregar 40 mL de lúdróxido de sodio (NaOH) 9 N (véase Apéndice 6 para la preparación). 4. Diluir con agua desionizada a 100 mL. 5. Permitir que la solución repose 24 h antes del uso. Puede formarse un leve precipitado en el fon do; no agitar el sedimento cuando se utiliza el reactivo. 6. Conservar en una botella de vidrio recubierta en parafina o en una botella color caramelo; evitar la exposición a la luz. 7. Rotular de manera correcta. E. Método de uso 1. Primero, controlar la formación de gas en el tubo Durham o en el fondo del agar. a. Si el gas está presente el microorganismo es un no termentador, el resultado es positivo pa ra la desnitrificación. b. Si el gas está presente y el microorganismo es un termentador, continuar con la fase 1. c. Si no hay gas, continuar con la fase 1.

2. Fase 1 a. A un cultivo incubado de nitrato, agregar directamente reactivos; dos procedimientos (1) Preferido (a) Inmediatamente antes de la prueba, mezclar partes iguales de los reactivos A y R (26). (b) Agregar cerca de 10 gotas de la mezcla al cultivo, (2) Alternativo (a) Reactivo A: 5 gotas. (b) Reactivo B: 5 gotas. (c) Agitar el cultivo con suavidad para m ezclar los reactivos.

330

Pruebas bioquímicas individuales b. Un resultado positivo (color rojo) dentro de 1-2 min denota una prueba terminada; descartar los tubos. c. Si el resultado es negativo (no se desarrolla color), continuar con la fase 2.

3. Fase 2: método de reducción del cinc a. Al tubo que contiene los reactivos A y B, agregar directamente una pizca (alrededor de 20 mg en la punta de una espátula) de polvo de cinc (Zn) (9, 10). b. El polvo de cinc no debe contener nitrato-nitrito (9). c. Observar para la interpretación final. El color aparece dentro de 5-10 min. F. Control de calidad: ambos reactivos A y B deben probarse con cultivos conocidos, positivo y negati vo, antes de introducirlo en el uso general. G. El reactivo A se conserva en refrigerador (4°C) mientras no se utiliza; el reactivo B debe conservarse a temperatura ambiente. Estos reactivos por lo común son estables al menos por 3 meses (2). Sin em bargo, de modo periódico deben controlarse con un control de calidad y deben ser descartados cuan do demuestran una reacción negativa o débil con un microorganismo positivo conocido. H. Química de las acciones de los reactivos: la reducción de nitrato (N O j) a nitrito (NOj) se denota por el desarrollo de color cuando el nitrito reacciona con los dos reactivos: ácido sulfanflico y dim etil-anaftilamina (o a-naftilam ina). La reacción de color se debe a la formación de un compuesto diazonio (28), p-sulfobenceno-azo-a-naftilam ina (37). Reacción fase 1 (13, 37)

SO3 H

so 3h

Ácido sulfanflico (incoloro)

Ácido sulfanflico diazotizado (incoloro)

Ácido nitroso

a-Naftilamina (incolora)

Ácido sulfanflico diazotizado (sal de diazonio)

p-Sulfobenceno-azo-a-naftilamina (colorante azo rojo) (hidrosoluble)

La unión del grupo -N = N - azo brinda un compuesto coloreado (28) por medio de una reacción nitrosa (7). Los compuestos coloreados diazonio se forman por el acoplamiento a través de una unión azo de una amina aromática con un compuesto de tipo fenólico por lo común en la posición para de un grupo hidroxilo (OH) o amino (NH2) (2, 28). En este caso, el acoplamiento ocurre en la posición para de un grupo amino. Reacción fase 2 (27)

p-Sulfobenceno-azo-(-naftilamina (compuesto coloreado diazonio)

Ácido acético

Arilhidrazina (com puesto coloreado)

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos 331 La reducción de la sal diazonio por el agente reductor polvo de cinc en presencia de ácido acético pro duce un compuesto coloreado, arilhidrazina (27). El procedimiento de nitrato con ácido sulfanflico-a-naftilamina desarrollado por Conn (8) a menudo exhibe una pérdida gradual o desaparición del color en un resultado positivo (37). La pérdida gradual del color se nota por un color amarillo castaño (39). Wallace y Neave (37) encontraron que esta inestabilidad del color se correlaciona con la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), determinado por el procedimiento de la tira con acetato de plomo, el cual es bastante sensible. Estos autores establecieron que el máximo desarrollo de color cesa en los microorganismos ca paces de reducir el nitrato y de producir al mismo tiempo H2S, quizá debido a que parte de la molécula de ácido nitroso (H N 02) es destruida. Sin embargo, la producción de H2S no produce la pérdida gradual del color directamente (37). La producción de H2S es eliminada por el empleo de peptona exenta de cis terna para preparar el medio (36). La cisterna contiene puentes -S H (sulfuras) y la remoción de ellos del medio elimina la formación de H2S. n h 2— c h c o o h c h 2sh

Cisterna

Wallace y Neave (37) también notaron que la pérdida gradual del color ocurre con más facilidad con un microorganismo nitrato positivo fuerte cuando una única gota de cada reactivo dio una reacción posi tiva. Si se aumentan las cantidades de cada reactivo se mantiene el color estable. La concentración de ni trito (N 0 2) aumenta cuando se forma H2S, lo cual destruye por completo el color de la reacción. Este ex ceso de ácido nitroso destruye directamente el color porque actúa sobre el grupo p-am ino de la sal diazonio y causa una ruptura a un derivado hidroxiazo (37). Debido a los problemas que pueden ocurrir, Wallace y Neave (37) recomiendan sustituir la a-naftilamina estándar por dimetil-a-naftilamina en la reacción de acoplamiento para el desarrollo del color. La dimetil-anaftilamina no se aclara, ni es destruida en presencia de una concentración aumentada de nitrito (N 0 2) dado que el gmpo amino está protegido (37). Sin embargo, con una concentración aumentada de N 0 2, este com puesto coloreado puede precipitar, pero una pmeba positiva podrá dar un color roio (37). Una concentración baja de concentración baja de N 0 2 causa el desarrollo de color a una velocidad más lenta (37). Tanto la a-naftilam ina como la dimetil-a-naftilam ina son sensibles a 1 parte de nitrógeno del nitrito en 100 millones de partes de solución (37).

VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD_____________ A. Positivo (+) Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa N 03+/Gas+

ATCC 11775 ATCC 10145

B. Negativo (-) ATCC 15309

Acinetobacter lwoffii NO, /Gas No inoculado

Vil. RESULTADOS Véase figura 30-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII. INTERPRETACIÓN (10, 41)__________________________________________________ (Nota: Agregar reactivo para nitrato antes de intentar una interpretación.) A. Primero controlar la producción de gas 1. Positivo (G) a. Burbujas de gas en el tubo Durham, en la superficie o en todo el medio semisólido. b. Una única burbuja es significativa; registrar como producción de gas.

332

Pruebas bioquímicas individuales

c. Si el microorganismo de prueba es un no termentador (1) Prueba terminada; descartar los tubos. (2) Informar como desnitrificación. (3) Producción de N2, N 20 o productos de degradación no gaseosos distintos de N 0 2. d. Si el microorganismo de prueba es un fermentador (p. ej., miembros de la familia Enterobacteriaceae). (1) El gas es hidrógeno de modo que debe probarse con reactivos para nitrato. (2) Continuar con la fase 1. 2. Negativo (NG): ausencia de gas; continuar con la fase 1.

B. Fase 1 1. Resultado positivo (+) a. Color rosa a rojo oscuro en 1-2 min. b. Nitrato (N 0 3) reducido a nitrito (N 0 2) por el microorganismo. c. Prueba terminada. 2. Resultado negativo ( - ) . a. Falta de desarrollo de color. b. El nitrito (N 02) no está presente. c. Continuar con la fase 2 para probar la presencia de nitrato no reducido (N 0 3~). C. Fase 2: Prueba de reducción del cinc 1. Resultado positivo a. Ausencia de desarrollo del color. b. Ausencia de nitrito (N 0 2) en el medio. c. El microorganismo redujo nitrato (N 0 3) a nitrito (N O j) y con posterioridad redujo el nitrito a productos no gaseosos; desnitrificación (N2). Probar la producción de amoníaco (NH3) por el agregado de unas pocas gotas del reactivo de Nessler; resultado positivo, color naranja oscuro (14). 2. Resultado negativo a. Color rosa a rojo oscuro en 5-10 min. b. Confirma resultado negativo de fase 1. c. Nitrato presente; no reducido por el microorganismo. d. El cinc redujo nitrato (N O j) a nitrito (N 0 2).

IX.

PRUEBAS DE REDUCCIÓN DE NITRATOS PARA ESPECIES DE MYCOBACTERIUM

(Nota: Ciertas micobacterias pueden reducir los nitratos por medio de la enzima nitrorreductasa. La reacción para nitratos es la prueba clave en la identificación de M. tuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum y M. szulgai (cuadro 30-2).)

Tiras comerciales para la prueba de nitrito (15) 1. Fabricantes: Diico, Bacto-nitrito strips (tiras reactivas Bacto-nitrito). 2. Pro ;edimiento: procedimiento para nitrito modificado de Kilbum (32); utilizado sobre todo para la identificación de M ycobacterium, pero puede utilizarse con otros microorganismos a. A un tubo con tapa a rosca estéril (13 x 100 mm), agregar 0,5 mL de agua destilada estéril. b. Muestras (1) Especies de M ycobacterium (a) M uestra con 3 a 4 semanas de cultivo en medio de Lowenstein-Jensen o en medio de huevo coagulado. (b) Las especies de crecimiento rápido pueden ser probadas dentro de las 2 semanas. (c) Las especies de crecimiento lento pueden ser probadas después de 3-4 semanas de cre cimiento abundante (15). (2) Otros géneros (a) Microorganismos entéricos: crecimiento proveniente de agar con azúcar triple y hierro (TSI). (b) Otros microorganismos: tripticasa soja agar (TSA). c. Con pinzas estériles, insertar una tira reactiva de nitrito de acuerdo con las indicaciones del fa bricante. La tira de prueba debe apoyarse sólo en el fondo, no en los lados, y permanecer en posición derecha.

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos 333 Cuadro 30-2. Algunas especies de Mycobacterium: resultados de la reducción de nitratos M ic ro o rg a n is m o M. M. M. M.

fiavescens fortuitum kansasii szulgai

M. M. M. M.

therm oresistible triviale tuberculosis afrícanum Complejo M. terrae M. asiaticum Complejo M. avium M. ce latum M. chelonae M. gastri M. genavense M. gordonae M. haemophilum M. m almoense M. mariunum M. shim oidei M. simiae M. ulceraos M. xenopi

G rupo de R u nyon

1. Fotocromógeno IV. De crecimiento rápido 1. Fotocromógeno 1. Fotocromógeno, 25SC II. Escotocromógeno, 37-C II. Escotocromógeno III. No fotocromógeno De crecimiento lento De crecimiento lento III. No fotocromógeno 1. Fotocromógeno III. No fotocromógeno II. Escotocromógeno IV. De crecimiento rápido III. No fotocromógeno III. No fotocromógeno II. Escotocromógeno III. No fotocromógeno III. No fotocromógeno 1. Fotocromógeno III. Escotocromógeno 1. Fotocromógeno III. Escotocromógenos III. No fotocromógeno

R e d u cció n de n itra to s

+ + + + + + + V V -

_ -

Datos de la referencia 20.

(1) En el extremo distal (marcado por una flecha) nitrato de sodio tamponado (N aN 03). (2) Reactivos A y B en la parte superior de la tira. (3) Tira estable durante 1 año si está refrigerada (2-8°C). d. Inoculo: crecimiento suficiente para formar una suspensión densa alrededor del extremo distal de la tira; evitar humedecer la porción superior. e. Incubación: realizar un control no inoculado (agua destilada y tira solamente) junto con espe cies de Mycobacterium positiva fuerte, positiva débil y negativa (20) (véase caldo TB para la reducción de nitratos por micobacterias). f. Incubación (1) M uestra y controles: con la tapa hacia abajo ajustada, incubar en baño de agua, 35°C, 2 h, con agitación periódica suave mediante un movimiento de inclinación. (2) Al final de las 2 h, rotar el tubo con suavidad varias veces para humedecer la totalidad de la tira. (3) Al final de las 2 h, colocar el tubo en una posición inclinada durante 10 min para permitir que el líquido cubra toda la tira; esto permite que reaccione el reactivo en la porción supe rior de la tira. g. Resultados (1) Positivo (+): cualquier grado de color azul en la parte superior de la tira; el microorganis mo produjo nitrorreductasa. El color aparece sobre la tira de papel, no en el líquido. (2) Negativo ( - ) : sin cambios de color; falta de nitrorreductasa. Las tiras comerciales brindan resultados aceptables sólo con las micobacterias fuertemente nitrato posi tivas como M. tuberculosis. El tubo control de M. tuberculosis debe ser positivo intenso, de otro modo los resultados no son confiables (15). Si la tira de papel es negativa o el tubo control positivo no es positivo fuerte, el procedimiento químico (caldo) debe realizarse con controles positivos fuerte y débil (15). B. Caldo TB para la reducción de nitratos por micobacterias (35) 1. Muestra: emulsionar dos grandes grumos de un cultivo de 4 semanas de M ycobacterium en solu ción fisiológica con una turbidez lechosa. 2. Sustrato: 0,01 M en buffer fosfato M/45 (0,02 M, pH 7 ) a. Ingredientes; pH 7 Nitrato de sodio, NaN03 Fosfato potásico, monobásico, KH2P 04 Fosfato sódico, dibásico, Na ,I IP04 Agua desionizada para llevar a

0,8 g 1,17 g 1,93 g 999 mL

334

Pruebas bioquímicas individuales

b. Esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. c. Fraccionar: alícuotas de 2 mL en tubos con tapas a rosca estériles (13 x 100 mm). d. Conservación: refrigerador (2-8°Cg vencimiento, 1-2 meses. 3. Reactivos a. Sulfanilimida al 0,2%: 0,1 g en 50 mL de agua desionizada. (1) Puede ser necesario calentar a 50°C para colocarla en la solución. (2) Conservar en botellas de vidrio color caramelo (2-8°C) para evitar la acción directa de la luz; vencimiento, 1 mes. b. Diclorhidrato de N-( 1-naftil)etilendiamina (C10H 7NHCH2CH2NH2-2HC1). (1) 0,05 g en 50 mL de agua desionizada. (2) Conservar en botellas de vidrio color caramelo (2-8°C) para evitar la acción directa de la luz; vencimiento, 1 mes. c. Acido clorhídrico, HC1, concentrado; dilución 1:2 con agua desionizada. Agregar siempre el ácido al agua; nunca el agua al ácido, ya que puede haber salpicaduras que pueden producir quemaduras en la piel o en los ojos. Utilizar Pro-pipeta para medir el HC1. 4. Método de uso a. Tubos con tapa a rosca estériles (13 x 100 mm) (1) Emulsionar 1 ansada de un cultivo de M ycobacterium a ser probado (con anterioridad debe ser llevado a temperatura ambiente, 22-25°C). (2) Agregar 2 mL de la solución de caldo TB tamponado para probar la suspensión y agitar con

suavidad. 5. Incubación: 35°C, 2 h. 6. Agregar reactivos en el siguiente orden: a. 1 gota de HC1 concentrado para acidificar el cultivo; agitar con suavidad. b. 2 gotas de sulfanilamida al 0,2%. c. 2 gotas de diclorhidrato de A/-(l-naftil)etilendiamina al 0,1%. 7. Microorganismos para el control de calidad a. Positivo (+) Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium kansasii b. Negativo (-) Mycobacterium avium No inoculado

ATCC 25618 (H37R), positivo fuerte ATCC 12478, positivo débil ATCC 25291

8. Resultados a. Positivo (+): color rojo o rosado. b. Si no existe cambio de color; confirmar los resultados negativos por el agregado de una peque ña cantidad de polvo de cinc. Color rosa a rojo: nitrato reducido. La capacidad de las micobacterias para reducir los nitratos está influida por la edad de las colonias, la temperatura, el pH y los inhibidores de enzimas (15).

MEDIO DE NITRATO PARA ESPECIES DE NEISSERIA

A. Objetivo: identificación de especies de Neisseria no patógenas; si son incapaces de desarrollar en m e dios selectivos, si son de importancia clínica o si son aisladas en cultivo puro (20). B. Medios: caldo con tripticasa soja (TSB) o caldo infusión de corazón (HIB) con 0,1 % (p/v) de nitrato de potasio (K N 0 3) y 0,01% (p/v) de nitrito de potasio (KNQ2) (21, 22) C. Resultados: véase el cuadro 30-3.

XI.

MÉTODO DEL DISCO PARA ANAEROBIOS

A. Procedimiento de Wideman, Citronbaum y Sutter (38). B. Discos impregnados con 6 mg de una solución de nitrato de potasio (K N 0 3) en una solución acuosa de molibdato de sodio al 0,1% (Na2M o 0 4). C. Determina la producción de nitratorreductasa en anaerobios. D. Incubación: 48 h. E. Concordancia con el medio de indol-nitrato convencional, 89% .

Pruebas de reducción de nitratos/nítritos 335 Cuadro 30-3. Reacciones clave en la identificación de las especies de N eisseria no patógenas aisladas con más frecuencia M ic ro o rg a n is m o N. subflava biovar subflava biovar flava biovar perfiava N. sicra N. m ucosa

— — —

+ + + + +

F ructosa

S a c a io s a

—

+ + + +

—

P o lisa cá rid o de sa ca ro sa

+ + +

D atos de la referencia 20.

XII.

PRUEBAS RÁPIDAS

A. Procedimiento rápido de Blazevic, Koepcke y Matsen (5) y Schreckenberger y Blazevic (33) 1. Inocular 0,5 mL de caldo nitrato de manera intensa. 2. Incubación: baño de agua, 35°C, 2 h. 3. Agregar 1 gota de cada reactivo, A y B, directamente al tubo y agitar. 4. Interpretación similar a la de la prueba estándar (véase Sección VIII).

B. Prueba de la mancha en caldos por el procedimiento estándar 1. Transferir 0,5 mL de caldos incubados (véase Secciones IV-VIII) a la placa para la mancha (que contiene orificios o depresiones) o a tubos de prueba a pequeños. 2. Agregar 1 gota de cada reactivo, A y B. a. Realizado durante la láse de crecimiento temprano. b. Observar para resultados tentativos. c. Dejar suficientes alícuotas de caldo de cultivo en el medio de crecimiento para comprobar lue go por el procedimiento estándar si la prueba de la mancha es negativa.

C. Discos/comprimidos de nitrato 1. Comprimidos a. Fabricante: Key Scientific (véase Apéndice 11). b. Comprimidos reactivos; rehidratar para reconstituir los reactivos A y B para nitrato. ( 1 ) 1 gota de reactivo A para nitrato (ácido sulfanflico). (2) 1 gota de reactivo B (ácido de Cleve 1,6, ácido l-naftilamina-6-sulfónico). c. Medios; dos opciones (1) Aguí 'caldo estándar para nitrato. Si se utiliza este medio, agregar unas pocas gotas de áci do acético 5 N al caldo antes de agregar los reactivos para nitrato para compensar ciertos productos alcalinos. (2) Medio FMN. 2. Discos (véase Apéndice 11) a. Key Scientific Company: realizados en medios en placa o en tubo. b. BBL: Nitrate Reductase Minitek Disks (Discos M initek para nitratorreductasa). c. Positivo (+): color rosa a rojo; nitrato reducido a nitrito. Si no hay color, agregar cinc en polvo sobre el disco para confirmar un resultado negativo.

XIII.

MEDIO DE FLUORESCENCIA-DESNITRIFICACIÓN (FN)________________________

A. Objetivo: identificación de seudomónadas y otros bacilos no termentadores. B. Principio 1. Capacidad para producir pigmento fluoresceína. 2. Reducir nitrato a nitrito o nitrito por completo a gas nitrógeno. C. Medios; dos opciones 1. Medio fluorescencia-desnitrificación (FN) (20) a. Ingredientes, pH 7,2 Peptona peptona no. 3, Difeo Sulfato de magnesio, MgS04-7H20 Fosfato dipotásico hidrogenado, K2HP04 Nitrato de potasio, KN03 Nitrato de sodio, NaN02 Agar Agua desionizada

1g 0,15 g 0,15 g 0,2 g 0,05 g 1,5 g 100 mL

336

P ruebas bioquím icas individuales b. Método de preparación (1) Suspender todos los ingredientes excepto el sulfato de magnesio en agua desionizada. (2) Disolver el sulfato de magnesio en una pequeña cantidad de agua desionizada antes de agre gar al medio de agar; esto evita la formación de un precipitado insoluble.

2. Medio de nitrato con lactosa fluorescente (FLN) a. Al medio FN agregar (1) Lactosa, 2 g para ayudar a la identificación de los microorganismos fermentadores de la lac tosa. (2) Rojo fenol, 0,002 g; indicador de pH. 3. Medio para la reducción de nitratos/nitritos Caldo infusión de corazón Nitrato de potasio, KN03 Agua desionizada

25 g 2g 1.000 mL

4. Fraccionar (cualquiera de los 3 medios): 4 mL de medio FN en tubos con tapa a rosca (13 x 100 mm); dejar solidificar de modo tal que la longitud de la porción “profunda” y el pico de flauta sean iguales. 5. Inoculo: suspensión densa; sembrar por punción en profundidad y estriar del pico de flauta. 6. Incubación: 35°C, 24-48 h. 7. Microorganismos para el control de calidad a. Fluorescencia positiva/desnitrificación positiva: Pseudomonas aeruginosa A rC C 10145. b. Fluorescencia negativa (1) Desnitrificación positiva: Pseudomonas stutzeri ATCC 17588. (2) Desnitrificación negativa: Escherichia coli ATCC 11775. 8. Resultados a. Fluorescencia positiva (1) Fuente de luz ultravioleta (lámpara de Wood). (2) Color amarillo brillante-verde. b. Gas: burbujas de gas en la profundidad del medio. c. M edio FLN: fermentación de la lactosa, producción de ácido: pico de flauta amarillo. d. Medio líquido: burbujas de gas en la porción superior del tubo de Durham invertido insertado: formación de gas nitrógeno. Las colonias fluorescentes no se detectan en los medios de aislamiento habituales como el agar con sangre (BA) y el agar de M acConkey (MAC); requieren medios con sales catiónicas que actúan como ac tivadores o coactivadores para intensificar la luminiscencia. Los medios FN o FLN pueden ser sustitui dos por el medio de Sellers para la determinación de fluorescencia y desnitrificación.

XIV. PRECAUCIONES A. Pruebas estándares de reducción de nitrato 1. Cuando se realiza la prueba de reducción de nitratos que utiliza la a-naftilam ina, el color pro ducido en una reacción positiva puede perderse con rapidez (37). Interpretar los resultados de inmediato, en particular al realizar varias determinaciones. Wallace y Neave (37) también nota ron que la pérdida de color gradual ocurrió con más facilidad con los microorganismos fuerte m ente nitrato positivos cuando una única gota de cada reactivo mostró una reacción positiva. Si se aum enta la cantidad de cada reactivo, el color se m antiene estable. La concentración de nitri to (N O j) aum enta cuando se form a H 2S, lo cual destruye por completo la reacción de color. E s tos autores recom endaron la sustitución por dim etil-a-naftilam ina en la reacción de acoplam ien to para el desarrollo del color; este com puesto no se aclara ni se destruye en presencia de un aum ento de la concentración de nitrito, ya que el grupo amino está protegido. Con el aumento de la concentración de N O z, este com puesto coloreado puede precipitar, si bien el resultado po sitivo todavía es rojo. U na concentración baja de N 0 2 produce un desarrollo de color más len to. Ambos, a-naftilam ina y dim etil-a-naftilam ina, son sensibles a 1 parte de nitrógeno en 100 m illones de partes de solución (37). 2. Eliminar la pérdida gradual del color o la destrucción del color por los microorganismos produc tores de H 2S mediante el empleo de un medio con peptona exenta de azufre (37). 3. Un microorganismo nitrato positivo que reduce de manera intensa exhibe un precipitado castaño inmediatamente después del agregado de los reactivos. Esto se debe al efecto del exceso de nitrito

Pruebas de reducción de nitratos/nitritos 337 sobre el grupo p-am ino del colorante azo y puede ser reducido por el uso de dimetil-a-naftilamina en lugar de la a-naftilam ina (4). 4. La prueba de nitrato es muy sensible y debe probarse un tubo de nitrato no inoculado con los reac tivos para asegurar que el medio no contiene nitrito (31, 37). 5. Algunos microorganismos reducen el nitrato a nitrito pero destruyen el nitrito tan rápido como se for ma, lo que da un resultado falso negativo (41). Esta destrucción del nitrito se evidencia en muy po cas bacterias, en particular algunas especies de Salmonella y Pseudomonas y Brucella suis (41). ZoBell y Meyer (42) comprobaron 400 cultivos de Brucella y encontraron que todos reducían los nitratos. 6. U n resultado de reducción con cinc positivo (41) indica que el nitrato fue reducido a nitrito y lue go sufrió una reducción adicional. N o existe evidencia de acumulación de nitrito. Sin embargo, el nitrato, en la reducción, puede haberse asimilado en la célula bacteriana o haberse convertido di rectamente a nitrógeno celular pero no reducido (8, 38, 41). 7. ZoBell (41) estableció que algunos microorganismos pueden destruir el K N 0 3 al 0,01% en el m e dio después de un período de incubación de 2 días. 8. Conn (8) estableció que en algunas ocasiones el nitrato puede ser sólo parcialmente reducido o un microorganismo puede perder de manera temporaria su capacidad para reducir el nitrato. 9. En todos los cultivos donde hay ausencia de nitrito, cuando se utilizan los reactivos a-naftilam i na (o dim etil-a-naftilam ina) y ácido sulfanílico, agregar cinc en polvo directamente al tubo an tes de realizar la interpretación final. 10. Se determinó que la a-naftilam ina es carcinógena (29); en consecuencia, se recomienda la susti tución por A(Ai-dimetil-a-naftilamina junto con ciertas precauciones de seguridad como evitar los aerosoles, el pipeteo con la boca y el contacto con la piel (27). 11. Cuando se agrega cinc, no utilizar en exceso; si se agrega demasiado Zn, la gran cantidad de gas hidrógeno producida puede reducir el nitrito (formado del nitrato no reducido) a amoníaco (NH3), lo que puede dar un resultado falso negativo (ausencia de color) o una reacción de color fugaz (31). 12. El (los) microorganismo(s) de prueba debe(n) m ostrar un crecimiento suficiente para reducir el ni trato antes de que sean agregados los reactivos; 48 h deben ser suficientes (4). 13. El material de vidrio o los reactivos contaminados con el óxido nitroso pueden dar un resultado falso positivo; evitar esta posibilidad probando un tubo control sin inocular para una reacción ne gativa (4). 14. Tanto la a-naftilam ina como el ácido sulfanílico son relativamente inestables; realizar con frecuen cia pruebas para el control de calidad. El compuesto diazonio que se forma a partir del nitrato re ducido también es relativamente inestable y el color tiende a perderse de manera gradual; las in terpretaciones deben realizarse enseguida después del agregado de los reactivos. 15. Cualquier medio basal que contenga nitrato de potasio al 0,1% (K N 0 3) es satisfactorio (42). 16. Para evitar el retardo en la iniciación del crecimiento y en la reacción del medio, el inoculo no de be ser tomado de una suspensión líquida o de caldo del microorganismo. 17. Si se form a un precipitado en el reactivo sulfanilamida, descartarlo. Descartar el reactivo naftilendiamina si cambia el color; debe ser amarillo. 18. En ocasiones los colores pueden ser pálidos y difíciles de interpretar; este problema disminuye pre parando estándares de color para las comparaciones.

B. Comprobación de Mycobacterium 1. Debe tenerse cuidado de no agitar los tubos de manera demasiado vigorosa después de haber agre gado las tiras de nitrito; pueden ocurrir diversos grados de reacción en la porción media de la tira si se humedece y la reacción puede no ocurrir con posterioridad en la parte superior de la tira (32). 2. No es suficiente una única prueba para la identificación de micobacterias; son necesarias un gru po de pruebas estándar. 3. Las tiras comerciales brindan resultados aceptables sólo con las micobacterias fuertemente nitra to positivas como M. tuberculosis. El tubo control con M. tuberculosis debe ser fuertemente po sitivo o los resultados no son confiables (15). Si la tira de papel es negativa o si el tubo control po sitivo no es fuertemente positivo, el procedimiento químico (caldo) debe ser realizado mediante el uso de controles positivos intensos y débiles (15). 4. Si existe un cambio de coloración al castaño en el extremo distal de la tira de prueba de nitrato, descartarla; esto indica un deterioro del reactivo (12). C. Fluorescencia-desnitrificación: las colonias fluorescentes no se detectan en los medios de aislamien to ordinarios como el agar con sangre (BA) y el agar de M acConkey (MAC); requieren medios con sa les catiónicas que actúan como activadores o coactivadores para intensificar la luminiscencia.

338

Pruebas bioquímicas individuales

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' w>

CAPÍ TULO >

c x —> c responsables de un resultado positivo en la prueba de oxidasa; la producción de estas dos enzimas difiere en los diversos géneros. Se consi deró que las especies de Neisseria producían indofenol oxidasa, mientras que la citocromo oxidasa era producida por las especies de Pseudomonas. Estudios espectrofotométricos probaron que la citocromo oxidasa de Warburg y la indofenol oxidasa eran la m ism a enzim a (39). Gaby y Hadley (23) establecie ron que la citocromo oxidasa fue denom inada con muchos otros nombres: A tmungsferment, citocromo c oxidasa citocrom o a3 oxidasa, y citocromo a oxidasa. Castor y Chance (11) mostraron por métodos fotoquímicos que cuatro pigmentos bacterianos actúan como enzimas respiratorias citocromo oxidasa terminales: citocromo a h citocromo a2. citocromo a3 y un pigm ento que se une al monóxido de carbo no (CO-binding) designado citocrom o o. Dos citocromos (a y a3) están combinados en la m isma pro teína y el com plejo se denom ina aa3 (24). U na m ezcla del citocromo a y el citocromo a3 se denom ina citocromo c oxidasa (25, 26). Los citocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos ferroporfirina (43). El citocromo aa3 contiene dos moléculas de hemo A y cada una contiene un átomo de Fe (hierro), que varía en sus valencias entre Fe3+ (férrico) y Fe2+ (ferroso) durante la oxidación y la reducción, y dos átomos de C u2+ (cobre) asociados con la actividad de citocromo oxidasa y la reacción de electrones con el oxígeno m olecular (26). Citocromo-Fe+++ j. o ----------- ^ Citocromo-Fe++ ^ --------------

(oxidado-eliminación de electrones)

(reducido-ganancia de electrones)

(férrico)

(ferroso)

Todas las especies de Pseudomonas y Neisseria producen una enzima oxidasa que, en presencia de oxígeno atmosférico, citocromo c y un reactivo para oxidasa, oxida el reactivo a un compuesto colorea do, el indofenol (4, 23). Los electrones provenientes del citocromo c son captados por la citocromo oxi dasa oxidada, que los transfiere a una molécula de oxígeno (45). El oxígeno libre es necesario para la re generación indirecta del citocromo c oxidado (45). La prueba en realidad determina la presencia del citocromo c y los resultados son positivos sólo en las bacterias que contienen citocromo c como una en zima respiratoria (6). ,

citocromo

., ,

,, ^

2 Citocromo c reducido + 2H+ + 1/2 o 2 ------------ ► 2 Citocromo c oxidado +- H20 oxidasa

Un resultado positivo de oxidasa consiste en una serie de reacciones, con un componente autooxidable del sistema citocromo como catalizador final (25). Los sustratos artificiales pueden ser sustituidos por los aceptares naturales de electrones en cualquier parte dentro de la cadena de transporte de electrones donde ellos reducen el sistema citocromo c-citocromo oxidasa (9, 25). Los diversos colorantes reactivos de la prueba de oxidasa son aceptares artificiales de electrones; el reactivo p-fenilendiamina y el indofenol son tanto aceptares como dadores de electrones (9). Estos sustratos artificiales pueden ser incoloros o colorea dos, lo cual depende de su estado (9); la reacción de oxidasa final brinda un producto coloreado.

IV. REACTIVOS EMPLEADOS

________________________

A. Reactivos de oxidasa, varias opciones (Eastman Chemical Co.; véase Apéndice 11). 1. Reactivo de Kovacs: diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) (d id orh idrato de N,N, N, Ntetrametil-p-fenilendiamina) al É%*(30), al 0,5% (5); solución incolora.

Prueba de oxidasa 347 2. Reactivo de Gordon y McLeod (24,43): clorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (también deno minado monoclorhidrato (HC1) de N,A-di mcti 1-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina) al 1-1,5%; solución púrpura claro. 3. Reactivos de Gaby y Hadley (23), modificado por Ewing y Johnson (18) a. Reactivo A, 1% de a-naftol en alcohol etílico (etanol) al 95%, y reactivo B, monoclorhidrato de paminodimetilanilina (u oxalato) al 1% (también denominado oxalato de dimetil-p-fenilendiamina). b. También denominado como reactivo de indofenol oxidasa. c. Reacción original “nadii’^na de naftol y di de diamina. 4. Reactivo de Carpente , Suhrland y Morrison (10): oxalato dep-am inodim etilanilina al 1%.

5. Discos/tiras reactivas impregnados con oxidasa a. Difeo (15) (1) “Bacto-differentiationdisks, oxidase” (DiscosBacto-diferenciación, oxidasa);reactivo: oxa lato de p-aminodimetilanilina (2) “Dryslide oxidase test” (Prueba de la oxidasa desecada en portaobjeto); reactivo diclorhi drato de Ar,'V,A’,N’-tetrametil-p-fenilendiamina. b. BBL (4): “Taxo N Discs” ; reactivo: p-aminodimetilanilina. c. Key Scientific Products (véase Apéndice 11) (1) Discos y tiras reactivas. (2) Reactivo: diclorhidrato de N,A', A N ’-tetrametil-p-fenilendiarnina. d. REMEL: “Microdase test disks” (1) Oxidasa modificada; separa Staphylococcus (-) de Micrococcus (+). (2) Discos de papel de filtro con tetra (reactivo de oxidasa) en dimetil sulfóxido (DMSO); el DMSO mantiene la célula permeable al reactivo. (3) Inóculo: colonia tomada del medio de crecimiento con un apbcador y frotada sobre el disco. (4) Resultados (a) Todos los Staphylococcus son negativos excepto las cepas de S. caseolyticus, S. sciuri, S. lentus y S. vitulus (2,19). (b) Nesterenkonia halobia, Dermacoccus nishinomiyaenis y Arthrobacter agilis son positi vos para la prueba de oxidasa m odificada (28, 42); todas las especies estaban incluidas originalmente en el género Micrococcus. B. Método de preparación, reactivos 1. Disolver 1 g del reactivo deseado en menos de 100 mL de agua destilada (a excepción del a-naftol) a-Naftol (1-naftol) Alcohol etílico (etanol), 95% 2. 3. 4. 5. 6.

1g 100 mL

Calentar con suavidad para colocarlo en la solución. Transferir a un frasco graduado y llevar a 100 mL con el diluyente apropiado (agua o etanol). Dejar reposar 15 min antes de usar (1). Conservar en una botella oscura tapada. Evitar la exposición a la luz (12). Rotular de manera correcta.

El reactivo de Kovacs, una solución acuosa al 1% de tetrametil-p-feniiendiamina, es menos tóxico y más sensible que el compuesto dimetil, pero más costoso (1, 14, 17, 30, 43). Este reactivo le confiere a las colonias oxidasa positivas un color lavanda, que se oscurece de m anera gradual a un color púrpura ne gruzco, pero también puede impartir color al medio circundante (1). El reactivo de Gordon y McLeod (24), una solución acuosa al 1-1,5% de dimetil-p-fenilendiamina, es más estable que el compuesto de tetrametil (32). Todos los compuestos de p-fenilendiam ina son relativamente inestables (3,43). El reactivo de oxalato de p-aminodimetilanilina presenta una ventaja sobre los reactivos de Kovacs o de Gordon y McLeod: es extremadamente estable tanto en la forma de polvo como en solución; en solu ción acuosa es estable al menos durante 6 meses (14). La p-aminodimetilanilina es un poco menos solu ble que los reactivos con sal clorhidrato, pero el calentamiento suave la solubiliza. Otra ventaja es que la sal de oxalato no forma un precipitado negro cuando es agregada sobre las colonias crecidas en agar cho colate, como ocurre algunas veces con los reactivos con clorhidratos (14). El uso de discos o tiras reactivas comerciales impregnados con oxidasa elimina la necesidad de pre parar reactivos frescos. Ninguno de estos reactivos interfiere con la reacción de la coloración de Gram (1).

348

Pruebas bioquímicas individuales

C. Método de uso

1. Soluciones de reactivos a. Procedimiento directo en pico de flauta; reactivos indofenol (reacción nadi) (18, 21, 23). (1) Medio de crecimiento: agar nutritivo en pico de flauta: 18-24 h; no incubar durante más tiempo. ^ (2) Agregar 2-3 gotas de cada reactivo (A y B) al pico de flauta; inclinar el (los) tubo(s) para permitir que los reactivos se mezclen y fluyan sobre el crecimiento. (3) Observar el cambio de color; desarrollo de color azul sobre el crecimiento dentro de los 2 min. b. Procedimiento directo en placa (1) Agregar 2-3 gotas del reactivo directamente a pocas colonias sospechosas desarrolladas en medio sólido en placa, por ejemplo, agar sangre (BA) o agar chocolate. (2) No inundar la totalidad de la placa con el reactivo. (3) No invertir la placa. (4) Observar los cambios de color. (a) Reactivo de Kovacs: color de la reacción dentro de los 10-15 seg (1, 30). (b) Reactivo de Gordon y McLeod: color de la reacción en 10-30 min (24, 43). (c) Procedimiento indirecto sobre papel de filtro con el reactivo de Kovacs (30) 1. Colocar un trozo de papel de filtro W hatman no. 1 de 6 cm2 en una placa de Petri. 2. Agregar 2-3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel. 3. Con una aguja de inoculación de platino, colocar una ansada de una colonia sospe chosa sobre el papel impregnado con el reactivo en una línea de 3-6 cm de longitud. 4. Una reacción de color positiva ocurre dentro de los 5-10 seg. 2. Discos de oxidasa a. Procedimiento directo en placa (4, 15) (1) Discos húmedos impregnados con agua destilada estéril. (2) Colocar el disco sobre unas pocas colonias sospechosas crecidas en un medio en placa, por ejemplo, agar sangre (BA) o agar chocolate. (3) No invertir la placa. (4) Incubar de nuevo la placa en estufa a 35°C durante 20-30 min. La prueba puede ser incubada a temperatura ambiente (25°C) o en refrigerador (4-10°C), pero la reacción es más lenta. (5) Observar para evaluar los cambios de color: de inmediato, rosa a púrpura; después de 2030 min de incubación, rojo a negro. b. Procedimiento indirecto (4, 15) (1) Dos variantes (a) Discos húmedos impregnados con agua destilada estéril, colocar en una placa de Petri y agregar una ansada de una colonia sospechosa proveniente de un medio sólido. (b) Discos húmedos impregnados con un cultivo en caldo del microorganismo sospechoso. (2) Observar los cambios de color; una reacción positiva debe ocurrir en segundos: rosa a negro. 3. Prueba del 1.isopo (29) a. Para la comprobación de bacterias con requerimientos especiales de cultivo. b. Reactivo: clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina. c. U tilizar un hisopo de algodón blanco en lugar de un ansa bacteriológica, una aguja o un aplicador. d. Tomar la colonia con el hisopo y frotarla sobre un trozo de papel de filtro que contenga el reactivo. e. Interpretar sobre el hisopo, no en el papel de filtro. (1) Reacción positiva dentro de los 10-15 seg; se considera reacción tardía o débil cuando el color se desarrolla más allá de los 30 seg pero dentro de 1 min. (2) El resultado en la prueba del hisopo puede ser positivo cuando el resultado en el papel de filtro es negativo. D. Control de calidad: todos los reactivos o discos deben ser probados con cultivos conocidos positivos y negativos antes de incorporarlos al uso general. E. Conservación: conservar todos los reactivos y discos en un refrigerador (4°C) mientras no se utilizan; entibiar los reactivos antes del uso (13). Barry y Bemsohn (3) recomiendan congelar los reactivos (-20°C) en alícuotas de 1 a 2 mL y descongelar 3-4 h antes del uso para reducir la autooxidación y prolongar su actividad. No utilizar más de 1 día después del descongelamiento (5, 35). Todos los reac tivos deben estar recién preparados justo antes del uso; en solución pierden su actividad con rapidez.

Prueba de oxidasa 349 Si se conservan refrigerados, pueden permanecer estables entre 5 días a 2 semanas (29,43). Di l'do La boratories (14) establece que el reactivo oxalato de p -a m in od itu e ti Iañ il in a es estable al menos duran te 6 meses. Sin embargo, dado que la estabilidad de estos reactivos varía, es aconsejable que a los reac tivos y discos se les efectúe un control de calidad todas las semanas y que sean descartados cuando muestran una reacción negativa o débil con un microorganismo positivo conocido. La actividad de oxi dasa disminuye si los discos se oscurecen con la conservación prolongada (3). Si los discos prepara dos en el comercio no están reaccionando de modo apropiado, lo cual se evidencia con un control de calidad, el lote completo debe ser devuelto a la compañía comercial para su reemplazo. F. Química de la acción del reactivo: los colorantes de p-fcnilcndiam ina son aminas aromáticas prima rias (36), derivados diamino del benceno (20). La citocromo oxidasa no reacciona directamente con el reactivo p-fenilendiam ina pero oxida el citocromo c, el que a su vez oxida el reactivo (4, 23, 27, 43). ,

citocromo

(1) 2 Citocromo c reducido + 2H+ + '/2 0 2 --------------- ► 2 Citocromo c oxidado + H20 oxidasa

(2) 2 Citocromo c oxidado + reactivo----- r r z — ► Compuesto coloreado '

oxidado

El compuesto básico de los reactivos, la fenilendiamina, es mediado. Cuantos más grupos metilados se introducen en el radical amino (NH2), el color es más azul; y si se introducen tres grupos fenilos (C6H5) en lugar del metilo, el color es aún más oscuro (33). La oxidación de las aminas aromáticas produce quinonas (37). Si el reactivo de oxidasa se prepara con a-naftol, se forma azul de indofenol (48); sin embar go, el a-naftol no es necesario para que se produzca la reacción. El naftol es un componente de acopla miento azoico: -N = N -grupo azo (37).

nh 2

Anilina (fenilamina)

nh 2

p-Fenilendiamina

Existen dos tipos principales de prueba de la oxidasa que utilizan reactivos diferentes, pero los meca nismos y resultados son comparables (5).

(26)

Tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Wurster)

h3c x

Azul de Wurster (formado en presencia de ozono (O) o peróxido de hidrógeno (H20 2))

, ch3

N 2H 20

nh2

Dimetil-pfenilendiamina

Azul de indofenol (37) (insoluble en agua)

350

Pruebas bioquímicas individuales

El indofenol es un colorante, un N-análogo de la quinona en el cual el =N reemplaza a uno o ambos grupos = 0 (48).

Indofenol (34) (indofenol bencenona (31))

Quinona

El reactivo clorhidrato de fenilendiamina forma un grupo diclorimida (C1N=C6H4=NC1); el =NC1 pue de ser reducido a -(N H 2 o hidrolizado a = 0 (48).

V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Positivo (+) N e is s e ria m u c o s a P s e u d o m o n a s a e ru g in o s a

A rC C 19696 ATCC 10145

B. Negativo (-) E s c h e r ic h ia co li N o in o culado

ATCC 11775

VI. RESULTADOS Véanse figuras 32-1 a 32-3 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. Vil. INTERPRETACIÓN A. Colonias oxidasa positivas: la colonia se vuelve de color rosa, luego marrón (rojo oscuro) y por últi mo negro (negro purpúreo). 1. Colonias rosa a. Bacterias viables. b. Fase para subcultivos. 2. Colonias negras a. Dentro de los 10-15 seg. b. Bacterias no viables. Cuando se utiliza una mezcla reactiva de dimetil-p-fenilendiamina-a-naftol, un resultado positivo se denota por un color azul (23, 42) en 1-2 min. B. Colonias oxidasa negativas 1. Sin cambios de color en las colonias o un color rosa pálido debido al reactivo. 2. Puede ocurrir un cambio de coloración al negro en el medio circundante. Con el reactivo de Kovacs, un resultado positivo se m anifiesta por un color negro purpúreo que se de sarrolla dentro de los 10 seg; una reacción positiva en 10-60 seg se considera un resultado tardío (43). Steel (43) estableció que el desarrollo de color después de 60 seg denota un resultado negativo.

Prueba de oxidasa 351 VIII. TIRAS REACTIVAS IMPREGNADAS CON OXIDASA Y REACTIVO DE BARRY Y BERNSOHN (3)_________ A. Preparación de las tiras reactivas 1. Papel de filtro W hatman no. 1 a. Cortar en tiras de 6-8 cm de ancho. b. Saturar con una solución acuosa al 1,0% de oxalato de dimetil-p-fenilendiamina. 2. Secar con rapidez. a. Colocar sobre una cuerda o una vara de vidrio. b. Evitar el contacto con clips de metal, tachuelas, etc. 3. Conservar en jarras con tapa a rosca que contengan una generosa cantidad de desecante. 4. Conservar en refrigerador; estable hasta 6 meses. B. Procedimiento 1. Colocar una colonia pura sobre una tira reactiva seca. 2. En la misma tira reactiva pueden probarse varias colonias de manera simultánea. C. Interpretación 1. Resultados dentro de los 10 seg. 2. Positivo: color rojo.

IX. PRECAUCIONES A. La prueba de oxidasa se utiliza de manera sistemática para identificar los miembros del género Neisseria. Sin embargo, otros géneros también brindan un resultado oxidasa positivo (véase II. Objetivo). Ellingworth y col. (17) encontraron que Haemophilus influenzae era oxidasa negativo con dimetil-pfenilendiamina pero positivo con el reactivo de Kovacs más sensible, tetrametil-p-fenilendiamina. Cas tor y Chance (11) establecieron que Pseudomonas maltophilia a menudo es oxidasa positiva tardía y que no todas las especies de Pseudomonas son positivas. Los autores recomiendan no utilizar la reac ción de oxidasa para describir el género Pseudomonas. La utilización de la prueba de oxidasa para ayudar a identificar el género Neisseria requiere reali zar una coloración de Gram en todas las colonias oxidasa positivas. Todas las especies de Neisseria son diplococos gramnegativos, con forma de granos de café, mientras que otros microorganismos que pueden exhibir un resultado oxidasa positivo son bacilos gramnegativos o cocobacilos gramnegativos. Sin embargo, Oligella urethralis (antes Morardella urethralis) puede exhibir una morfología similar a Neisseria en la coloración de Gram. En consecuencia, las pruebas de fermentación de hidratos de car bono deben ser utilizadas para la identificación final de las especies de Neisseria. B. No intentar realizar una prueba de oxidasa sobre las colonias que desarrollan en un medio que conten ga glucosa; su fermentación inhibe la actividad de oxidasa, lo que puede interpretarse como un resul tado falso negativo. Una prueba de oxidasa en bacilos gramnegativos debe realizarse sólo sobre colo nias provenientes de un medio no selectivo y/o de un medio no diferencial para asegurarse la validez de los resultados: agar sangre (BA), tripticasa soja agar (TSA), agar infusión de corazón (HIA), agar nutritivo (NA), etc.; no utilizar placas de agar EMB, MAC, XLD ni BGA. C. Lautrop (31) estableció que pueden ocurrir resultados falsos positivos con cultivos de B. pertussis en medios que contienen una concentración alta de sangre. D. Steel (43 ^recomienda utilizar un ansa o una aguja de inoculación de platino o un aplicador para tomar las colonias para la prueba de oxidasa; además establece que cualquier traza de hierro (cromoníquel) puede oxidar por sí sola el reactivo fenilendiamina, lo que brinda un resultado falso positivo. E. Pueden ocurrir resultados falsos negativos si un cultivo mixto contiene los géneros Pseudomonas y Neisseria. Las especies de Pseudomonas producen una sustancia inhibitoria que interfiere con la pro ducción de oxidasa por las especies de Néisseria (46). F. U n resultado de oxidasa negativo puede exhibir un cam bio de color al negro en el m edio que ro dea las colonias pero no sobre las colonias. Este cam bio de color carece de significado. En el agar chocolate circundante puede aparecer un precipitado negro cuando se utiliza un reactivo de clorhidrato viejo (14). Es necesario observar la reacción sobre la colonia a ser probada, no en el medio cercano a ella. Las sales de oxalato no form an este precipitado (14). Se prefiere la sal de oxalato por sobre los reactivos que utilizan m onoclorhidrato o diclorhidrato; el oxalato es más es table y habitualm ente se prepara todas las sem anas, m ientras que el clorhidrato debe prepararse todos los días.

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Pruebas bioquímicas individuales

G. No rotular el reactivo de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina simplemente como reactivo de Kovacs, sino como reactivo de Kovacs para oxidasa. Existe también un reactivo de Kovacs para indol.

H. Los reactivos de oxidasa se autooxidan con rapidez (con el oxígeno libre en el aire) y pierden sensibi lidad. La autooxidación se reduce por el agregado de una solución de ácido ascórbico al 0,1% direc tamente al reactivo (44) durante su preparación. Los reactivos deben descartarse si se forma algún pre cipitado (14). Evitar cualquier exposición indebida de los reactivos a la luz. El reactivo tetrametil de Kovacs debe descartarse si muestra un color azul oscuro, debe ser incoloro (12). Deben respetarse los tiempos para el desarrollo del color, dado que con posterioridad puede apa recer un color púrpura-negro debido a la autooxidación de los reactivos y/o a microorganismos posi tivos débiles que contienen una pequeña cantidad de citocromo c esto es imposible de interpretar con precisión, lo que puede conducir a un resultado falso positivo. I. El reactivo tetrametil de Kovacs es confiable siempre que se respete el tiempo límite para considerar positivo un resultado (hasta 60 seg) (43). El reactivo de Kovacs es muy sensible con una lectura final dentro de los 10 seg; cualquier resultado después de los 10-60 seg no es típico de las especies de Neisseria (35). Sin embargo, el reactivo dimetil puede requerir 10 a 30 min para un resultado positivo (24, 43); con una reacción tardía, esta prueba debe repetirse utilizando un cultivo de 18 a 24 h provenien te de agar con sangre (BA, SBA) (35). J. Estudios espectrofotométricos mostraron que la citocromo oxidasa y la indofenol oxidasa son la mis ma enzima (39). K. Cuando se usan los reactivos de prueba A y B indofenol (nadi), hacer caso omiso a cualquier reac ción débil o dudosa después de los 2 min (35). L. El clorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (DPM) es menos sensible, y las colonias viscosas (pegajo sas) pueden aparecer como oxidasa negativas debido a la deficiente penetración del reactivo (35) M . E1 uso del procedim iento del disco o del método indirecto con papel de filtro (30) proporciona su ficiente desarrollo viable para los subcultivos y la inoculación para procedim ientos bioquím icos adicionales. N. La prueba de oxidasa es una reacción de oxidación y el oxígeno debe alcanzar las colonias; después de inundar el crecimiento o una porción de la colonia, inclinar el pico de flauta o las placas para per mitir que el reactivo se escurra, lo que expone las colonias al aire. O. La prueba de oxidasa debe ser realizada en todos los bacilos gramnegativos (7). Si la prueba no se rea liza en los miembros de la familia Enterobacteriaceae (todos son oxidasa negativos excepto P. shigelloides), es posible identificar de manera errónea Aeromonas hydrophilia (-H) como E. coli o una espe cie de Serrada y P. shigelloides (oxidasa +) (antes Aeromonas shigelloides) como Shigella sonnei. REFERENCIAS 1 B ailey RW, S co lt E G . D iag n o stic M icrobiology, ed 2. St. L ouis: C V M osby, 1966:329-330. 2. B ak er JS . C o m p ariso n o f various m ethods fo r diffe ren tiatio n o f stap hylococci an d m icrococci. J C lin M icro b io l 1 984;19(6):875-879. 3. B arry A L , B e m so h n KL. M eth o d s for storing o x i dase test reag en ts. A ppl M icro b io l 1969;17(6): 933934. 4. B B L M an u al o f P ro ducts an d L ab oratory P ro ced u res, ed 6. C o c k ey sv ille, M D : B B L M ic ro b io lo g y S y stem s, D iv isio n o f B ecto n D ickinson an d C o m pany, 1988. 5. B lazev ic D J, E d erer G M . P rin cip les o f B iochem ical Tests in D iag n o stic M icrobiology. N ew York: John W iley & S ons, 1975:91-93, 127. 6. B lazev ic D J, S ch reckenberger P C , M atsen JM . E v a lu atio n o f th e PathoT ec “R ap id 1-D S ystem ” . A ppl M icro b io l 1973;26(6):886-889. 7. B ra n so n D . M e th o d s in C lin ic a l B acterio lo g y . S pringfield, IL: C harles C T hom as, 1972:41. 8. B urro w s W, L ew ert R M , R ip p o n JW . T extbook o f M icrobiology. T h e P athogenic M icroorganism s, ed 19. P h ilad elp h ia: W B S aunders, 1968: 110-111 9. C an taro w A , S c h e p a rtz B . B iochem istry, ed. 3. P h i ladelphia: W B S aunders, 1962:385.

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CAPI TULO

Prueba de oxidación-fermentación I. PRINCIPIO Determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización.

II. OBJETIVO

(Véanse también caps. 44-45) La determinación de la reacción de oxidación-fermentación (O/F, Oxi/Ferm) temprana en el labora torio de diagnóstico ayuda en gran medida a la identificación de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. 1. En especial para diferenciar los bacilos gramnegativos entéricos y no entéricos, aerobios a anae robios facultativos, de la familia Enterobacteriaceae, cuyos miembros son todos fermentadores (F). No todas las bacterias enumeradas más adelante son habitantes normales o anormales del tracto intestinal como lo son los miembros de la familia Enterobacteriaceae; sin embargo, cualquier bac teria puede ser encontrada en cualquier área del cuerpo en ciertas condiciones, a. Fermentación (F, Ferm) o fermentación y oxidación (F & O): Actinobacillus Aeromonas Capnocytophaga Cardiobacterium hominis Chromobacterium violaceum Gardnerella vagin*lis E sp ecies de Haemophilus E sp ecies de E sp ecies de E sp ecies de

Helicobacter Kingella Megamonas hypermegas Succinivibrio dextrinosolvens Suttonella indologenes E sp ecies de Vibrio E sp ecies de Xanthom*onas E sp ecies de E sp ecies de

b. Oxidación (O, Oxi) y/o inerte (-, NR, no reactivo): Acidovorax Acinetobacter Afipia Agrobacterium Alcaligenes Bartonella Brevundimonas Brucella melitensis E sp ecies de Campylobacter Chryseomonas luteola E sp ecies de Comámonos Eikenella corrodens Flavimonas oryzihabitans Especies de Flavobacterium E sp ecies de Legionella E sp ecies E sp ecies E sp ecies E sp ecies E sp ecies E sp ecies E sp ecies

de de de de de de de

Methylobacterium Moraxella Ochrobactrum anthropi E sp ecies de Oligella E sp ecies de Pasteurella E sp ecies de Pseudomonas E sp ecies de Ralstonia E sp ecies de Roseomonas E sp ecies d e Shewanella E species de Sphingomonas E species de Stenotrophom*onas Taylorella equigenitalis E sp ecies de Weeksella Wolinella succinogenes E sp ecies de Xanthobacter

E sp ecies de E sp ecies de

2. Ayudar a la diferenciación entre los géneros Staphylococcus y Micrococcus. a. Especies de Staphylococcus: fermentadoras de la glucosa; excepción: S. saprophyticus, fermentador débil o no reactivo (ni fermentación ni oxidación). b. Especies de Micrococcus: por lo común oxidadoras de la glucosa.

Prueba de oxidación-fermentación 355 3. Ayudar en la identificación de otros microorganismos. B. Determinación de la movilidad y de la producción de gas (C 0 2 e H2) debido al medio semisólido.

III. BIOQUÍMICA

______________________________________________

Las bacterias utilizan los hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (como se demuestra por la produc ción de ácido) sólo en condiciones aerobias, mientras que otras producen ácido tanto de modo aerobio co mo anaerobio (10). Las bacterias que pueden crecer, realizar su metabolismo y reproducirse en condiciones ya sea aerobias (presencia de oxígeno atmosférico) o anaerobias (ausencia de oxígeno atmosférico) se de nominan anaerobios facultativos. La mayor parte de las bacterias de importancia médica son anaerobias facultativas.

Fermentación (F, Ferm) La fermentación es un proceso anaerobio y las bacterias que fermentan un hidrato de carbono por lo común son anaerobios facultativos (10). En la fermentación, un hidrato de carbono es hidrolizado en dos moléculas de triosa (10) que con posterioridad son convertidas a una cantidad de compuestos con 1, 2, 3 o 4 carbonos (3); el principal intermediario es el ácido pirúvico. Los productos finales de la fermentación va rían con cada especie bacteriana, lo que depende de su sistema enzimático y de las condiciones ambienta les (5). El criterio importante es que antes de esta ruptura, el azúcar glucosa es fosforilado a glucosa 6-fosfato (3). La fermentación requiere un compuesto orgánico como aceptar terminal de electrones (5). La principal vía metabólica fermentativa de la glucosa es la vía de Embden-Meyerhof-Pamas (EMP), aunque la degradación puede ocurrir por la vía de la derivación (shunt) de las pentosas o por la de Ent ner-Doudoroff (ED) o cualquiera de éstas en combinación con la EMP (3). Sin embargo, las tres vías metabólicas requieren la fosforilación de la glucosa como el paso inicial antes de que pueda ocurrir la de gradación (11). La vía metabólica de Embden-Meyerhof-Pamas (EMP) también se denomina glucolítica o anaerobia o fermentativa. La vía metabólica de Entner-Doudoroff también se denomina aerobia. Glucosa 6 -fosfato

1 Mol de glucosa

Vía de Em bden-M eyethoí-Pam as

Fructosa 6 -fosfato

Fructosa 1,6 -difosfato 2

Ácido 6 -fosfoglucónico

Moles de gliceraldehído 3-fosfato 2

Derivación (shunt) de las pentosas

Ribulosa 5-fosfato

Moles de ácido pirúvico

Vía m etabólica de Entner-D oudoroff

Acido 2-ceto-3-desoxi-6-fosfoglucónico

C02

Gliceraldehído 3-fosfato

Ácido pirúvico + Etanol

Ácido pirúvico

Vía metabólica de Embden-MeyerhofPamas

+ co 2

2 Moles de ácido pirúvico

Tres vías metabólicas de la fermentación fosforilada (4)

356

Pruebas bioquímicas individuales

Oxidación (O/Oxi) La oxidación de la glucosa por una de las vías m etabólicas de derivación (shunt) es un proceso ae robio y las bacterias que oxidan los hidratos de carbono por lo com ún son aerobias obligadas (estric tas) (10). En el proceso de oxidación, la glucosa u otros hidratos de carbono no son degradados y frac cionados en dos triosas (10); en su lugar, el grupo aldehido es directam ente oxidado a un grupo carboxilo, para form ar el ácido glucónico, que con posterioridad es oxidado a un ácido 2-cetoglucónico (10, 14, 16). E l ácido 2-cetoglucónico luego puede acum ularse o ser degradado (15) en dos m o léculas de ácido pirúvico. En contraste con lo que ocurre en la ferm entación, Sebek y Randles (15) y Norris y Cam pbell (14) encontraron que la oxidación no requiere la fosforilación inicial de un hidra to de carbono antes de la degradación. Sebek y Randles (15) atribuyen la falta de fosforilación en la etapa inicial de la oxidación a la incapacidad del trifosfato de adenosina (ATP) para penetrar en la cé lula bacteriana. La oxidación requiere oxígeno o un com puesto inorgánico com o aceptor term inal de electrones (6). Glucosa

I Acido glucónico

I Acido 2-ceto-glucónico

I Ácido 2-ceto-6-fosfoglucónico

I 2

Moles de ácido pirúvico

Vía m etabólica oxidativa: ausencia de fosforilación in icial (4)

La principal diferencia entre el m etabolismo fermentativo y el metabolismo oxidativo de un hidra to de carbono es el requerim iento de oxígeno atmosférico y la fosforilación inicial. La ferm entación es un proceso anaerobio que requiere la fosforilación inicial de la glucosa antes de la degradación a una mezcla de ácidos relativamente fuertes, m ientras que la oxidación, en ausencia de com puestos inorgá nicos com o el nitrato y el sulfato, es un proceso aerobio estricto que involucra la oxidación directa de una m olécula no fosforilada de glucosa (inicialm ente) (10). La ferm entación produce m ayor acidez que la oxidación (10).

IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS___________________________________________ A.

Medios; dos opciones de acuerdo con la morfología de los microorganismos de prueba 1. Medio basal OF de Hugh y Leifson (OFBM); bacilos gramnegativos (entéricos OF) (1 ,5 ,7 ,1 0 ) a. Ingredientes del medio basal semisólido, pH 7,1 Peptona de caseína (triptona), 0,2% Cloruro de sodio, NaCÍ Fosfato dipolásico (K2HP04) Agar Azul de bromotimol (BTB) Agua desionizada

2g 5g 0,3 g 2-3 g 0,03-0,08g 1.000 mL

b. Indicador de pH: azul de bromotimol (BTB) (1) Ácido: color amarillo, pH 6. (2) Alcalino: color azul de Prusia oscuro, pH 7,6. (3) Medio no inoculado: p ll 7,1; color verde. c. Productos comerciales disponibles (1) Difeo: medio basal Bacto-OF (5). (2) BBL: medio basal OF (l). 2. Staph O F : medio de fermentación para la diferenciación de Staphylococcus y M icrococcus grampositivos (8). a. Ingredientes del medio basal semisólido, pH 7

Prueba de oxidación-fermentación 357 Digerido pancreático de caseína (triptona), 1% Extracto de levadura Agar Púrpura de bromocresol (BCP) Agua desionizada

10 g 1g 2g 0,001 g 1.000mL

b. Indicador de pH: púrpura de bromocresol (BCP) (1) Ácido: amarillo, pH 5,2. (2) Alcalino: púrpura, pH 6,8. (3) Medio no inoculado: pH 7; p ú rp u ra . Pueden utilizarse indicadores alternativos de pH como la fucsina ácida de Andrades y el rojo fenol (véase Apéndice 3 para las reacciones de color). B. Método de preparación, medio basal; cualquier medio 1. Pesar la cantidad exacta que indica el rótulo. Los productos de las diferentes compañías pueden presentar leves diferencias. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar con suavidad la solución. C. Método de esterilización, medio basal; cualquier medio 1. Autoclave. 2. 121°C, 15 Ib, 15 min. D. Enfriar el medio basal estéril a 40-45°C en un baño de agua. E. Agregado de hidratos de carbono, 2 opciones 1. Soluciones acuosas, 10% (10 g/100 mL) a. Hidratos de carbono (1) Enteric OF: glucosa, maltosa, lactosa, manitol, sacarosa, xilosa. (2) Staph OF: sólo glucosa y manitol. b. Método de esterilización (1) Filtración, recomendado (11) (a) Método con filtros de membrana Millipore. (b) Membranas: diámetro de poro 0,45 |im. (2) Procedimiento alternativo (1) (a) Concentración al 1% del hidrato de carbono deseado agregado al medio basal antes de la esterilización (10 g/L). (b) Autoclave: 118°C, 10 min. Si el hidrato de carbono se agrega al medio basal antes de la esterilización en autoclave, la temperatu ra puede producir la hidrólisis del hidrato de carbono (10). Sin embargo, Hugh y Leifson (10) establecie ron que los hidratos de carbono pueden ser esterilizados en la autoclave si se emplea una solución acuo sa al 10%. Aun así se recomienda que los hidratos de carbono sean esterilizados por filtración. c. A alícuotas de 100 mL del medio basal estéril fundido, agregar 10 mL de una concentración al 10% del hidrato de carbono deseado estéril (filtrado) (1 ,5 ,1 0 ); concentración final del hidra

to de carbono, 1 %. d. De manera aséptica fraccionar alrededor de 5 mL por tubo estéril con tapa a rosca (1 ,5 ). 2. Discos comerciales estériles con hidrato de carbono a. Fabricante: BBL, Difeo, Key Scientific (C.O.T. comprimidos). b. M ediobasal (1) El mismo que se em plea para las soluciones acuosas de hidratos de carbono. (2) Agregar los discos de hidrato de carbono a un medio en tubo, estéril. (a) De manera aséptica. (b) Seguir las indicaciones del fabricante. F. Enfriar antes del uso y refrigerar para la conservación (4-10°C). G. Inoculación, prueba estándar de dos tubos 1. Inoculo: crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h. a. Enteric O F agar con hierro de Kligler (KIA) u otro agar apropiado para el pico de flauta (2).

358

Pruebas bioquímicas individuales

b. Staph OF : placa de agar con sangre (BA, SBA) u otro medio conveniente de aislamiento en pla ca; no inocular a partir del medio agar manitol salado. 2. Para cada hidrato de carbono, inocular un par de tubos OF por cada microorganismo a probar. M ar car uno como “abierto” y el otro como “cubierto” (o “sellado”). También realizar un grupo de con troles: un grupo inoculado sin el agregado de hidrato de carbono y un grupo no inoculado con hi drato de carbono. 3. Inoculo liviano (2, 7) a. Aguja de inoculación. b. Sembrar por punción ambos tubos alrededor de 0,5 cm desde el fondo del tubo. 4. Recubrir todos los tubos marcados como “cubiertos” (o “sellados”) con alrededor de 1-2 m L de vaselina líquida estéril o Vaspar estéril para excluir todo el oxígeno. a. Selladores (2) (1) Parafina. (a) En una botella de 200 mL, agregar 1 mL de agua a 100 mL de parafina líquida. (b) Esterilización; dos opciones 1. Autoclave: 121°C, 15 Ib, 15 min. 2. Estufa de esterilización: 160-170°C, 1 h. (2) Vaspar: más eficaz; no se retrae del vidrio como lo hace la parafina y es un sólido con m e nos posibilidad de perm itir la difusión del aire. (a) M ezclar partes iguales de vaselina sólida y parafina. (b) A una botella de 100 mL, agregar 50 mL de la mezcla. (c) Esterilización: en alícuotas de 50 m L , esterilizar en la autoclave a 121°C, 15 lb, 1 h. (d) Después de la esterilización, colocar en estufa para el secado a 110°C para eliminar el agua atrapada. b. Se recomienda no utilizar vaselina líquida espesa; aumenta la difusión del aire. H. Incubación: 35°C 48 h o más tiempo (1,5). Los microorganismos de desarrollo lento pueden reque rir 3-4 días (2, 7) o incluso hasta 14 días de incubación prolongada (4). Tapas flojas. U na baja rela ción hidrato de carbono:proteína reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar pe queñas cantidades de ácidos débiles provenientes del metabolismo oxidativo (11). Las grandes cantidades de hidratos de carbono aumentan la cantidad de ácido encontrada (11). El medio OF entérico de Hugh y Leifson (10) contiene una concentración alta de hidrato de carbo no con una concentración baja de peptona para superar la posibilidad de que un microorganismo ae robio utilice la peptona y, en consecuencia, pueda producir una condición alcalina que neutralice cual quier acidez leve producida por un microorganismo oxidativo. Estos autores establecieron que ciertas peptonas pueden no ser satisfactorias; recomiendan un digerido pancreático de caseína. El fosfato di potásico en el medio estimula la fermentación y actúa como buffer para controlar el pH (10). El clo ruro de sodio incrementa el crecimiento de las especies de Brucella (10). La concentración de agar semisólido utilizada también permite la determinación de la movilidad además de la capacidad oxidativa o fermentativa de un microorganismo. El agar también ayuda a dis tribuir el ácido producido en la superficie a todo el tubo, lo cual facilita la interpretación del pH (10, 11). La glucosa se utiliza de manera sistemática en el medio basal OF; sin embargo, algunos mi croorganismos a ser probados son incapaces de metabolizar la glucosa pero pueden atacar otros hidra tos de carbono (11). Debe utilizarse una batería de glucosa, lactosa y sacarosa y, a veces, de maltosa (6), manitol y xilosa (10). Con la conservación, el medio puede absorber una pequeña cantidad de oxígeno, pero Hugh y Leif son (10) establecieron que esta pequeña cantidad no afecta las reacciones OF de manera apreciable. Cowan y Steel (4) aconsejan que el oxígeno absorbido en el medio OF conservado puede eliminarse primero por la ebullición y luego por el enfriamiento rápido del medio justo antes del uso.

V, MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. E n teric O F 1. Crecimiento con fermentación (F, Ferm): Proteus vulgaris Escherichia cotí

ATCC 13315 ATCC 8677

Prueba de oxidación-fermentación 359 2. Crecimiento con oxidación (O, Oxi): Pseudomonas aeruginosa

ATCC 10145

3. - Crecimiento sin F ni O (NC): Alcaligenes faecalis

ATCC 8750

Staph OF 1. Crecimiento con fermentación (F, Ferm): Staphylococcus aureus subesp. aureus

ATCC 12600

2. Crecimiento con oxidación (O, Oxi): Micrococcus luteus

A TC C 4698

3. Tubo control: medio basal OF sin hidrato de carbono

VI.

RESULTADOS________________________________________________ Véanse f ¡guras 33-1 y 33-2 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color.

Vil. INTERPRETACIÓN: PRUEBA DE DOS TUBOS

_____

A. Además de la utilización del hidrato de carbono, con el medio OF se pueden detectar la producción de gas y la movilidad (5). Registrar la producción de gas y/o la producción de ácido y la reacción de m o vilidad para cada tubo, mediante el uso de las siguientes abreviaturas.

1. Reacciones de hidratos de carbono Á cido: A Á cid o y gas: A G , ® S in cam bios o reacció n alcalina: N C

2. Determinaciones OF F erm entativo: F, F erm O xidativo: O , O xi N i oxidativo ni ferm entativo: N R (no reactivo), - (inerte), N F (n o ferm e n ta tiv o )

3. Movilidad M óvil: + (crecim iento que difunde desde la lín ea de punción) Inm ó v il: - (crecim iento confinado a la lín ea de punción)

Si los microorganismos no exhiben crecimiento en ninguno de los medios OF, informar sin crecimien

to (NG) (9). B. Enteric OF: patrones de utilización de hidratos de carbono (2, 10) (cuadros 33-1 y 33-2).

Cuadro 33-1. Patrones de utilización de hidratos de carbono de la Enteric OF Tubo cubierto (sellado) Tubo con reacción Tubo abierto Reacción Amarillo (A)a Verde (-) Oxidación (O, Ox) Abierto Fermentación (F) Amarillo (A) Amarillo (A) Anaerógena Cubierto Amarillo (AG) Cubierto Amarillo |AG) Aerógena Ni fermentación Púrpura (-) Ningunob Azul o verde (-) ni oxidación (NR, -) Fermentación y Amarillo (A o AG) Ambos Amarillo (A o AG) oxidación (O + F, O/F) aA: producción de ácido. b Lectura de control del hidrato de carbono no inoculado; sin cambios de color.

360

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 33-2. Patrones de utilización de hidratos de carbono de la Staph OF S tap h O F

Tubo con re a cció n

Tubo a b ie rto

Tubo c u b ie rto (se lla d o )

1. Oxidación (O, Ox) 2. Fermentación (F) (anaerógena) 3. Ni fermentación ni oxidación (NR, -)

Abierto

Amarillo (A)a

Púrpura (-)

Cubierto

Amarillo (A)

Ningunob

Púrpura (-)

Micrococcus-, oxidativo (O) o ni fermentativo ni oxidativo (no reactivo, NR o-) Staphylococcus aureus y S. epidermidis: fermentativo (F). Staphylococcus saprophyvcus: fermentativo débil (WF) o no reactivo (NR, -).

aA: producción de ácido. b Lectura de control del hidrato de carbono no inoculado; sin cambios de color.

VIH. PRECAUCIONES A. Deben utilizarse las abreviaturas correctas para registrar las reacciones OF. No utilizar positivo (+) o negativo ( -) para denotar oxidación (O, Oxi) o fermentación (F, Ferm). Esto podría originar confusio nes; se indica posiblemente el resultado de la movilidad o hace imposible deducir si el resultado del hidrato de carbono fue negativo para la oxidación, para la fermentación o para ambas. B. En la mayor parte de los libros de texto, las reacciones OF de muchos microorganismos se indican co mo + /-, lo cual señala que estos microorganismos varían en su reacción OF y que son oxidativos o ni oxidativos ni fermentativo (no utilizan la glucosa, inertes). C. En algunas oportunidades se agrega al medio una solución acuosa del indicador de pH, 3 mL de una concentración por litro al 1%. No deben emplearse las soluciones alcohólicas, debido a que un m i croorganismo puede producir ácido a partir del alcohol (11), lo que da un resultado de fermentación u oxidación falso positivo. D. Cowan y Steel (4) establecen que algunos microorganismos no pueden crecer en el medio de H ugh y Leil'son. Si esto sucede, repetir la prueba OF en el medio basal de Hugh y Leifson (10) con el agrega do de sustancias de enriquecimiento, ya sea suero al 2,0% o extracto de levadura al 0,1 %¿A) ■ E. Hugh y Leifson (10) establecen que el nitrato es reducido por la m ayoría de los microorganismos fer mentativos; sin embargo, la falta de reducción de los nitratos es común entre los microorganismos no fermentadores. F. Hugh y Leifson (10) encuentran que un microorganismo que sólo oxida la glucosa podrá no fermen tar cualquier otro hidrato de carbono (sólo lo oxida); en consecuencia, cuando se prueba con otro hi drato de carbono, puede omitirse el tubo cubierto (sellado). G. Un microorganismo que no es oxidativo ni fermentativo ( -) podrá producir una leve alcalinidad en el tubo abierto (color azul-verde), pero el tubo cubierto podrá no exhibir un cambio de color (verde) (10). H. Algunos microorganismos pueden crecer en ambos tubos OF sin ninguna producción de ácido. Si es to ocurre, Cowan y Steel (4) recomiendan la confirmación de la reacción negativa mediante el uso de otro medio basal que contenga glucosa. I. Algunos microorganismos requieren una incubación prolongada antes de que sea visible la produc ción de ácido (4, 7). Lederberg (13) atribuyó la reacción tardía a la incapacidad de un hidrato de car bono de penetrar en la célula bacteriana. Este autor recomendó realizar la prueba de galactosidasa (prueba ONPG) para determinar la capacidad fermentativa potencial. J. Hugh y Leifson (10) mostraron que la reacción OF de la mayoría de las bacterias gramnegativas es oxidativa o fermentativa; sin embargo, sus reacciones pueden causar alguna confusión debido a que a menudo son lentas o débiles. K. Hugh y Leifson (10) establecieron que las bacterias paracolónicas pueden oxidar y fermentar los hi dratos de carbono, y en este caso la oxidación no se evidencia a menos que la fermentación sea débil o lenta. Las bacterias paracolónicas Salmonella choleraesuis subesp. arizonae (antes Arizona) y las especies de Citrobacter pueden oxidar la lactosa, fermentarla o pueden tener ambas acciones (10). L. Los microorganismos Jermentativos exhiben una reacción ácida en todo el medio en ambos tubos. Sin embargo, la producción de ácido por un microorganismo oxidativo se evidencia primero sólo en la su perficie del medio del tubo abierto y de manera gradual se disemina al resto del tubo (10). Si la reac ción oxidativa es tardía o débil, en la superficie del tubo abierto puede observarse alcalinidad, lo que con frecuencia produce un error en la interpretación de la reacción OF como negativa (ni oxidativa ni fermentativa). Sin embargo, con la prolongación de la incubación durante varios días, la reacción alcalina

Prueba de oxidación-fermentación 361 revierte a ácida (10). Por consiguiente, en todas las reacciones OF negativas se debe continuar la in cubación durante 3-4 días. M. Es esencial un inoculo denso para detectar los productos bioquímicos provenientes de muchos mi croorganismos no term entadores que son aerobios estrictos; el ambiente dentro del tubo OF cerrado puede no favorecer el desarrollo óptimo (12). N. El medio se siembra por punción en el centro del tubo, de modo que carece de superficie de crecimien to. Esto puede hacer difícil determinar si un resultado negativo refleja inactividad bioquím ica o inca pacidad del microorganismo de crecer en el medio (12). O. El mayor porcentaje de discrepancias con la prueba O/F ocurre con los microorganismos con requeri mientos especiales de cultivo o con las cepas bacterianas encontradas de manera ocasional; esto a m e nudo conduce a resultados falsos negativos (12). P. El uso de equipos de identificación comerciales por microbiólogos y el hecho de obviar la inoculación del microorganismo desconocido en KIA o en TSI pueden tom ar imposible determinar cuál de los sis temas, F u O, seleccionar. Koneman y col. (12) recomiendan evaluar primero las características O/F de todos los aislamientos desconocidos de bacilos gramnegativos en KIA/TSI. Q. Las tapas flojas permiten el intercambio con el aire; si las tapas están apretadas, los tubos control con hidratos de carbono no oxidados podrían no tom arse alcalinos (9). R. Los patrones de utilización de otros hidratos de caibono (p. ej., lactosa, maltosa, sacarosa y xilosa) a menudo son requeridos para ayudar en la identificación de un género o una especie de un microorga nismo (9). S. Si uno sospecha un bacilo gramnegativo no fermentativo desconocido, es importante investigar las tres principales características de identificación: a) falta de evidencia de fermentación de la glucosa, b) po sitividad de la citocromo oxidasa y c) falla para crecer en el medio de MacConkey (MAC) (13).

REFERENCIAS 1. BBL. Manual of Producs and Laboratory Procedu res, ed 6. co*ckeysville, MD: BBL Microbiology Systems, Division of Becton Dickinson and Com pany, 1988: 216-217. 2. BransonD. MethodsinClinicalBacteriology. Springfield, IL: Charles C Thomas, 1972:12,135. 3. Burrows W, Lewcrt RM, Rippon JW. Textbook of Microbiology. The Pathogenic Microorganisms, ed 19. Philadelphia: WB Saunders, 1968:118-121, 135. 4. Cowan ST. Cowan & Steel’s Manual for the Identi fication of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: Cam bridge University Press, 1974:28,170. 5. Difco Supplementary Literature. Detroit: Difco La boratories, 1968:255. 6. Doelle HW. Bacterial Metabolism. New York: Aca demic Press, 1969:130,257. 7. Ewing WH. Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae, ed4. New York: Elsevier, 1986. 8. Fackiam RR, Smith PB. The Gram positive cocci. Hum Pathol 1976;7(2): 187-194. 9. Forbes BA, Sahn DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, ed 10. St. Louis: CV Mosby, 1958:174,443.

10. Hugh R, Leifson E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of car bohydrates by various gram negative bacteria. J Bac terid 1953;66(l):24-26. 11. Hugh R, Ryschenkow E. Pseudomonas maltophilia, an Alcaligenes-like species. J Gen Microbiol 1961,26(1): 123-132. 12. KonemanEW,AllenSD,JandaWM,etal.ColorAtlas & Textbook of Diagnostic Microbiology, ed 5. Phi ladelphia: LB Lippincott, 1997:254-261, 304. 13. LederbergJ.Thebeta-D-galactosidaseofEsc/rcnc/u'a coli, strain K-12. J Bacteriol 1950;60 (4):381-392. 14. Noras FC, Campbell JJR. The intermediate meta bolism of Pseudomonas aeruginosa. III. The appli cation of paper chromatography to the identifica tion of gluconic and 2-ketogluconic acids, interme diates in glucose oxidation. Can J Res 1949;27C;253-261. 15. Sebek OK, Randles Cl. The oxidative dissimilation of mannitol and sorbitol by Pseudomonas fluorescens. J Bacteriol 1952;63(6) 693-700. 16. Stokes FC, Campbell JJR. The oxidation of glucose and gluconic acid by dried cells of Pseudomonas aerugino sa. Arch Biochcm Biophysics 1951;30(1): 121-125.

CAPI TULO i

Prueba de fenilalanina desaminasa I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo para desaminar la fénilalanina a ácido fenilpirúvico por vía enzimática, con la producción de acidez.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43-45) A. La actividad de fenilalanina desaminasa es característica de Morganella morganii de los biogrupos 1 y 2 y de todas las especies de Proteus y Providencia. Se utiliza para separar estos géneros de la m a yoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae aislados con más frecuencia. Otras especies de Enterobacteriaceae que exhiben actividad de desaminasa son: Raros aislamientos de Enterobacter (15) Pantoea agglomerans (V, variable, por lo común +) Rahnella aquatilis (+) Tatumella ptyseos (+) B. Ayudar a la diferenciación de especies: A fipiafelis (+) de A. broomeae (-) y A. clevelandensis (-).

III.

BIOQUÍMICA

El aminoácido aromático fenilalanina es desaminado por un mecanismo oxidativo por una aminoáci do oxidasa, una flavoproteína (20), para producir un cetoácido, el ácido fenilpirúvico. La desaminación oxidativa elimina el grupo amino (NH2) del aminoácido para formar un enlace doble oc-cetoácido y am o níaco libre (NH3). Éste es un proceso de dos pasos: en un inicio, se elimina el hidrógeno, lo que produce un iminoácido y el hidrógeno se combina con el oxígeno para formar agua; luego el iminoácido es hidrolizado a un cetoácido (17). RCHNH2COOH + v2 0 — — -----»- RCNHCOOH— — 2° z

e nzim a

Aminoácido

»• RCOCOOH + NH,

Iminoácido

Cetoácido

Reacción neta

nh3

Fenilalanina

Acido fenilpirúvico

Amoníaco

P r u e b a d e f e n ila la n in a d e s a m in a s a

363

La fenilalanina es desanimada a ácido fenilpirúvico y con posterioridad puede ser reducida a ácido fenil-láctico con una incubación adicional. El ácido fenil-láctico es reconvertido a fenilalanina y el ciclo de desaminación ocurre de nuevo. Una pequeña cantidad de ácido fenilpirúvico puede ser descarboxilado a ácido'fenilacético, el que también puede ser reconvertido a fenilalanina (4, 12).

(PPA)

descarboxilado

Reconvertido

Ácido fenilacético (R edibujado de Harrow, B. and Mazur, A. T e x tb o o k o f B io c h e m is tr y , 99 ed., p. 405, con autorización de W. B. Saunders Co., Filadelfia.)

IV.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: MEDIO FENILALANINA (PA) (2, 3, 6, 9)

A. Ingredientes, pH 7,3 DL-Fenilalanina Extracto de levadura Cloruro de sodio, NaCl Fosfato disódico, Na2HP04 Agar Agua desionizada

2g 3g 5g 1g 12 g 1.000 mL

El extracto de levadura proporciona tanto una fuente de carbono como de nitrógeno. B. Productos comerciales disponibles. C. Método de preparación 1. Pesar la cantidad exacta que indica el rótulo. 2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar con suavidad la solución. 4. Fraccionar alrededor de 4 mL por tubo, pico de flauta largo (16 x 120 mm). D. Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. E. Dejar solidificar el medio en posición inclinada. F. Enfriar antes de usar y conservar refrigerado (4-10°C). G. Inoculación 1. Inoculo denso (8). 2. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h (agar con hierro de Kligler, KIA).

364

Pruebas bioquímicas individuaies

H. Incubación: 35°C; 4 h o 18-24 h. 1. Agregar el reactivo directamente al tubo incubado antes de intentar la interpretación y rotar el reactivo con suavidad sobre el pico de flauta para echar fuera la superficie de las colonias. Si no se dispone del medio fenilalanina comercial y si se utiliza la L-fenilalanina en lugar de la m ez cla de isómeros dl , sólo se requiere 1 g (1%) (5). La forma l (+) de la fenilalanina es degradada con más rapidez por Proteus y Providencia que la mezcla dl (14).

V. REACTIVOS EMPLEADOS: DOS OPCIONES A. Cloruro férrico en solución acuosa (FeCl3), al 10% 1. Ingredientes, dos tipos a. Acídico, recomendado C lo ru ro férrico, F e C l3 A cid o clo rh íd rico concentrado, HC1 A g u a d e sio n izad a p a ra llevar a

12 g 2,5 m L 100 m L

b. No acídico C lo ru ro férrico, F eC l3 A g u a d esio n izad a

B. Sulfato de hierro (III) y amonio (sulfato de amonio férrico), FeS 0 4 (NH 4 )2 S 0 medias (5).

10 g 100 m L 4

• 6H20 , saturado a

C. Métodos de uso 1. Cloruro férrico, cualquier tipo a. Agregar 4-5 gotas de FeCl3 directamente al tubo incubado durante 18 a 24 h. Si el tubo es ino culado con una siembra densa, serían suficientes 4 h de incubación (2). b. Rotar el tubo con suavidad para aflojar el crecimiento. c. Ocurre una reacción positiva de color verde en 1-5 min en el pico de flauta y en el líquido de condensación (8). 2. Sulfato de amonio férrico (5) a. Acidificar con 10% de ácido sulfúrico (H2S 0 4), usando rojo fenol como indicador. A lcalino: rojo. A cido: am arillo.

b. Agregar 4-5 gotas de sulfato de amonio férrico saturado a medias. c. Agitar el tubo con suavidad. d. Una reacción positiva de color verde ocurre en 1 min. 3. Cualquier reactivo: interpretar la reacción de inmediato, ya que el color es inestable y se aclara con rapidez (5, 19). D. Control de calidad: los reactivos deben ser probados con cultivos conocidos, positivo y negativo, an tes de ser puestos en uso general. E. Conservación: conservar los reactivos en un refrigerador (4°C) cuando no se utilicen. Estos reactivos deben ser envasados en frascos oscuros para evitar la exposición a la luz. Su estabilidad varía; en con secuencia, todas las semanas deben ser sometidos a un control de calidad y descartados cuando dan una reacción negativa o débil con un microorganismo positivo conocido. F. Química de la acción del reactivo: dado que la renilalanina es desanimada, el color producido por el agregado de FeCl3 al 10% se debe a la formación de un cetoácido, el ácido fenilpirúvico (19). Henecka (13) mostró que los a y (3-cctoácidos muestran una reacción de color positiva con la solución alco hólica o con la solución acuosa del FeCl3. El ácido fenilpirúvico es un oc-cetoácido. Singer y Volcaní (19) atribuyen una reacción positiva con el FeCl3 a la formación de una hidrazona. Una hidrazina (RNHNH2) es un derivado del amoníaco agregado a un grupo carbonilo; uno de los hidró genos se une al oxígeno, mientras que un nitrógeno se une a un átomo de carbono (17). Cuando un alde hido o una cetona se combina con una hidrazina, se produce una hidrazona o un compuesto del tipo de la hidrazona (un derivado no saturado que contiene nitrógeno) y se elimina agua (10, 11, 17).

Prueba de fenilalanína desaminasa 365 hidrazina

(RNHNH2)

C— COOH

fü ) + RNH N /H ,)— -

* u

Ácido fenilpirúvico

c— II N — NHR

Hidrazona

Cetona ch2 ■ —

—

Hidrazina

CH2 — C — COOH [ I N— NHR +

Fenilhidrazona

El núcleo guanidina en la peptona [C(NH)(NH2)2] es un derivado del amoníaco y de la hidrazina del ácido carbónico (1). Los compuestos de tipo cetona son incoloros, pero si un grupo ceto (C = 0 ) se conju ga con otro grupo ceto o con un - C - C - u otro doble enlace, puede producirse color (17). El FeCl3 es un agente oxidante y en una solución ácida con hidrazina, el ion férrico (Fe3+) formará (vía una hidrazona) nitrógeno y amoníaco como sus productos finales (1), reduciendo el ion férrico. N2 H£ + Fe+++ —»- NH4 + v2 N2 + H+ + Fe++

El F eC l3 es un agente quelante; produce la quelación con el ácido fenilpirúvico para form ar un color verde (11). La exposición de un tubo de cultivo con fenilalanina al oxígeno atm osférico des pués del agregado de FeC l3 increm enta la velocidad de producción y la intensidad de una reacción positiva (14).

VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD____________

A. Positivo (+) ATCC 13315

Pioteus vulgaris

B. Negativo (-) ATCC 11775

Escherichia co li

No inoculado

Vil. RESULTADOS Véase figura 34-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII. INTERPRETACIÓN A. Resultado positivo (+): color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación (6). B. Resultado negativo (-): sin cam bios de color; perm anece am arillo debido al color del reactivo FeCl3.

IX. PRUEBAS ALTERNATIVAS A.

Medio líquido de fenilalanina-malonato 1. Fórmula de Shaw y Clark (18); es la combinación del medio de fenilalanina de Buttiaux, Osteux, Fresnoy y M oriamex (3), más tarde modificado por Ewing (7), y el medio de malonato de Leifson (16), más tarde modificado por Ewing, Davis y Reaves (9). 2. Diferencia por la capacidad de utilizar el malonato de sodio y la fuente de carbono y/o de desaminar la fenilalanina a ácido fenilpirúvico. 3. Ingredientes; pH 6,3

366

Pruebas bioquímicas individuales Extracto de levadura DL-fenilalanina Malonato de sodio Cloruro de sodio, NaCl Sulfato de amonio, (NH4)2S04 Fosfato dipotásico, K2HP04 Fosfato monopotásico, KH2P04 Azul de bromotimol (BTB) Agua desionizada

1g 2g 3g 2g 2g 0,6 g 0,4 g 1.000 m L

4. Indicador de pH: azul de bromotimol a. Acido: pH 6; amarillo. b. Alcalino: pH 7,6; azul de Prusia oscuro. 5. Fraccionar: tubos con rosca; 6-8 mL/tubo (16 x 125 mm). 6. Esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 10 min. 7. Inoculación: crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h; inoculo denso. 8. Incubación: en aerobiosis, 35°C, 18-24 h. 9. Interpretación {Nota: primero probar la utilización del malonato) a. Malonato (1) Positivo (+): color azul oscuro; reacción alcalina. (2) Negativo (-): sin cambios; el medio permanece verde claro. b. Fenilalanina (1) Agregar reactivo cloruro férrico antes de la interpretación; FeCl3, 0,8 g/10 mL de agua des tilada estéril; agregar al pico de flauta. (a) Solución de FeCl3, 8%: 3-5 gotas. (b) HC1, 0,1 N: 3-5 gotas. (2) Positivo (+) (a) Color inmediato verde oscuro intenso (b) Fenilalanina desaminada a ácido fenilpirúvico (3) Negativo (-): color amarillo. B. Discos o comprimidos comerciales {Nota: seguir las instrucciones del fabricante) 1. Key IPA tablets (Comprimidos Key IPA) a. Fabricante: Key Scientific Products. b. Determina dos reacciones bioquímicas: indol y fenilalanina. 2. Urea-PDA Disk (Discos para m ea y PDA) a. Fabricante: REMEL. b. Determina dos reacciones bioquímicas: fenilalanina desaminasa y ureasa 3. M initek disks (Discos Minitek) a. Fabricante: BD Biosciences. b. Fenilalanina desaminasa.

PRECAUCIONES

A. Un resultado positivo debe ser interpretado de inmediato después del agregado del reactivo FeCl3, de bido a que el color verde se aclara con rapidez (20) La interpretación positiva o negativa debe reali zarse dentro de los primeros 5 min. El hecho de permitir rodar el FeCl3 sobre el pico de flauta ayuda a obtener una reacción más rápida con un color más pronunciado. B. Los laboratorios a menudo utilizan las letras PA para denominar el medio de fenilalanina. Sin em bar go, PA también puede utilizarse para el agar con peptona y los agares con peptona y fenilalanina pa recen idénticos, Si existen dudas acerca de lo que representa la sigla PA, realizar un control de calidad con un microorganismo fenilalanina positivo conocido antes de poner el medio en uso general. C. Los extractos de carne o los hidrolizados de proteína no p ueden ser utilizados en la preparación del medio debido a que presentan variaciones naturales en el contenido de fenilalanina (15).

Prueba de fenilalanina desaminasa 367 REFERENCIAS 1. Audrieth LF, Ackerson B. The Chemistry of Hydra zine. New York: John Wiley & Sons, 1951:214-215. 2. 'BBL Manual of Products and Lai loratory Procedures ed 6. co*ckeysville, MD: BBL Microbiology Systems, Division of Becton Dickinson and 12. Company, 1988. 3. Buttiaux R, Osteux R, Fresnoy R, Moriamez J. Les propriétés biochimiques caractenstiques du genre Proteus. Inclusion sorihaitablcdcs Providencia dans celui-ci. Ann InstPasteur Lille 1954;87(4):375-386. 4. Cantarow A, Schepartz B. Biochemistry, ed 3. Phi ladelphia: WB Saunders, 1962:584-585. 5. Cowan ST. Cowan & Steel’s. Manual for the Iden tification of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: 16. Cambridge University Press, 1974:39-40,152. 6. Difco Supplementary Literature. Detroit: Difco La boratories, 1968:280. 7. Ewing WH. Enterobacteriaceae: Biochemical method for group differentiation. Public Health Service publ.no. 743. Washington,DC: US GovemmentPrinting Office, 1962:19. 8. Ewing WH. Edwards and Ewing’s Idem ilicntion of En terobacteriaceae, ed4. New York: Elsevier, 1986:253. 9. Ewing WH, Davis BR, Reavis RW. Phenylalanine and malonate media and their use in enteric bacte riology. Public Health Lab 1957;15:153-161. 10. Fieser LF, Fieser M. Organic Chemistry, ed 3. NewYork: Reinhold, 1956:211.

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CAPI TULO

Prueba de fosfatasa

I. PRINCIPIO___________________________________________________________________ Determinar la capacidad de un microorganismo de producir la suficiente enzima fosfatasa para hidrolizar el difosfato de fenolftaleína (PDP).

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 y 44) A. Medio con PDP 1. En un comienzo, para determinar principalmente las cepas patógenas de las especies de Staphylo coccus (Staphylococcus aureus subesp. aureus coagulasa positivo). 2. Para diferenciar especies a. Actinobacillus muris ( -) y A. seminis ( -) de otras especies de Actinobacillus (+) aisladas con más frecuencia b. Haemophilus haemoglobinophilus (-) de otras especies de Haemophilus (+) c. Pasteurella testudinis ( -) de otras especies de Pasteurella (+) d. Kurthia zopfii (— ) de K. gibsonii (+) y K. sibirica (+) e. Corynebacterium diphtheriae subesp. gravis (+) de otras especies de Corynebacterium (-). 3. Diferenciar los constituyentes predominantes de la flora oral de micoplasmas, Mycoplasma salivarium (+) de M. órale (-) (19). B. Prueba de fosfatasa con verde de metilo (MGP): para diferenciar los miembros de la familia Enterobacteriaceae (+) de otras bacterias intestinales gramnegativas (15-18).

III.

BIOQUÍMICA

La producción de fosfatasa se determina por la liberación de fenolftaleína, indicada por un cambio de color en el medio (11). La fenolftaleína liberada reacciona con un álcali para dar un color rosa a rojo bri llante. Difosfato de fenolftaleína (sal sódica)---------------- ►Fenolftaleína líbre (1) Fenolftaleína + álcali (NaOH o NH3) ---------------- *- Color rosa-rojo brillante (2)

La ftaleína es un compuesto del anhídrido itálico con un fenol o derivado fenólico (5) que contiene un anillo lactona de cinco lados. El anhídrido ftálico combinado con dos moléculas de fenol forma el com puesto fenolftaleína.

Prueba de fosfatasa 369

Cuando la fenolftaleína es neutralizada, el álcali se une al grupo C = 0 , se rompe el anillo de lactona y se forma un quinoide en uno de los anillos bencénicos (5).

Anillo benceno

Estructura quinoide (qulnona) c 6h 4o 2

Fenolftaleína (incolora en acidez) C 20H14O 4

Anillo lactona (de cinco lados)

Fenolftaleína (roja en alcalinidad)C20H13O 4

Ciertos radicales fundamentales conocidos como cromóforos son responsables del color producido por ciertos compuestos: C=C, C = 0 , C=S, C=N, N=N, N = 0 y N 0 2 (5). Cuantos más de estos grupos se pre sentan en el mismo compuesto, más intenso es el color producido (5). En los compuestos de benceno, los radicales cromóforos se denominan cromógenos, compuestos colo reados pero no colorantes, ya que ellos no tienen afinidad por los tejidos o las fibras (5). En la fenolftaleína, el cromógeno tiene una estructura quinoide (o quinona), que contiene dos grupos C =0. La estructura qui noide otorga al compuesto un color rosa-rojo; sin embargo, este color desaparece si la solución es acidifica da de nuevo, debido a la pérdida de la estructura quinoide y al restablecimiento de la forma fenólica (5). La fenolftaleína es capaz de formar sales, por lo común la sal sódica, que es más estable (2). Los auxocromos son el grupo de colorantes y cromógenos que forman sales, ya sean ácidos o bases (5). El gru po ácido carboxilo (-C O O H ) de la fenolftaleína está presente pero en una sal sódica se encuentra como -C O O N a, el auxocromo característico. La fenolftaleína se usa principalmente como un indicador ácidobase; es incolora en un ambiente ácido o neutro y rosa a rojo cuando éste es alcalino (5). Sin embargo, se debe tener presente que este indicador tiene una variedad de colores, lo que depende del pH (4,12).

370

Pruebas bioquímicas individuales

Rosa

Naranja-rosa en el extremo ácido de los límites de variación

Roja

ACIDO

Variaciones de color de la fenolftaleína

(10)

Incolora en el extre mo alcalino de los límites de variación

(Redibujado de Nussenbaum, S. O rganic Chem istry: Principies a n d Applications, p. 4 5 8 ,19 6 3 , con autorización de Allyn y Bacon, Inc., Boston )

IV.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS: MEDIO CON DIFOSFATO DE FENOLFTALEÍNA (PDP)

A. Sustrato fenolftaleína 1. Fabricante: Sigma-Aldrich (véase Apéndice 11). 2. Ingredientes; concentración al 0,5% Sal sódica de difosfato de fenolftaleína, PDP Agua destilada o desionizada

0,5 g 100 mL

3. Método de esterilización (4): filtración (Millipore o Seitz), filtro de membrana, 0,22 |xm. 4. Conservación: -20°C. B. Medios; dos opciones 1. Caldo nutritivo P D P (3, 7) a. Ingredientes, pH 7,5 Extracto de came Peptona Agua desionizada

3g 5g 1.000 mL

Prueba de fosfatasa 371 b. Productos comerciales disponibles: BBL, Difeo. c. Método de preparación (1) Pesar la cantidad exacta que indica el rótulo. (2) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. (3) Calentar con suavidad la solución. (4) Fraccionar alrededor de 3 mL por tubo (13 x 100 mm). d. Método de esterilización: autoclave, 115°C, 15 Ib, 15 min. e. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C). f. Justo antes de usar, agregar una solución al 0,5% de PDP.

(1) De manera aséptica. (2) Una gota (0,05 mL) a cada tubo (4, 11). (3) M ezclar con suavidad; agitar el fondo del tubo hacia atrás y adelante con los dedos. g. Inoculación (1) De modo simultáneo, dos tubos por cada microorganismo a ser probado. (2) Rotular los tubos A y B. (3) Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h (4) Inoculo denso. h. Incubación, ambos tubos: 35°C, 6 h i. Después de la incubación, agregar hidróxido de sodio (NaOH) antes de intentar realizar la in terpretación. 2. Agar nutritivo PDP (3 ,7 ,1 1 ) a. Ingredientes, pH 7,3; 1,5% E x tracto de cam e P ep to n a C lo m ro de sodio, N aC l A g ar A g u a d esionizada

3g 5g 8g 15 g 1.000 m L

b. Productos comerciales disponibles: BBL, Difeo. c. Método de preparación (1) Pesar la cantidad exacta que indica el rótulo. (2) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. (3) Calentar con suavidad la solución. d. Método de esterilización: autoclave, 115°C, 15 Ib, 15 min. e. Enfriar a 45-50°C. (1) Baño de agua, 37°C. (2) Controlar la caída de la temperatura para evitar la resolidificación. f. Agregar sustrato

(1) De manera aséptica. (2) Dilución final: 1/10.000. (a) Sal sódica de PDP, 5%, 2-20 mL. (b) Agar nutritivo fundido, 45-50°C, 98-980 mL. (3) M ezclar con suavidad. (a) Hacer remolinos lentamente en el frasco. (b) Evitar la formación de burbujas. g. De manera aséptica verter en placas de Petri, alrededor de 12-15 mL por placa. h. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C). (1) Enfriar: posición vertical (tapas hacia arriba). (2) Conservación: posición invertida (tapas hacia abajo). i. Inoculación (1) Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h. (2) Inoculo liviano (6). (3) Estriar para el aislamiento (colonias separadas) (6). j. Incubación: 35°C, 18-24 h (2); posición invertida, tapas hacia abajo. Según los estudios de Baird-Parker (1), se obtienen más cultivos positivos cuando la incubación se extiende durante 3-5 días a 30°C. k. Después de la incubación, exponer las colonias a los vapores del amoníaco antes de realizar la interpretación.

372 V.

Pruebas bioquímicas individuales

REACTIVOS

A. Hidróxido de sodio (NaOH) 10 N (40% ) 1. Ingredientes N aO H , exento de carbonato, R .G . A g u a d esio n izad a

40 g 100 m L

2. Método de preparación a. Pesar con rapidez el NaOH y disolver en menos de 100 mL de agua destilada en un vaso de precipitación. Este reactivo es altamente higroscópico. b. Colocar el recipiente en un baño de agua fría circulante para controlar la temperatura. c. Enfriar y transferir la solución de NaOH a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua destilada. d. Conservar en botella para reactivos recubierta con polietileno o parafina. 3. Método de utilización a. Medio líquido (caldo) en tubos. b. Después de la incubación, agregar 1 gota de NaOH al 40% al tubo A. (1) Si es positivo, registrar los resultados. (2) Si es negativo, continuar la incubación del tubo B; 35°C, 18-24 h. (a) Agregar reactivo al tubo B. (b) Registrar los resultados.

B. Vapores de amoníaco (NH3) 1. Hidróxido de amonio (NH4OH), concentrado gravedad específica 0,880. 2. Método de utilización a. Medio en placas. b. Dos métodos; exposición de las colonias a los vapores de amoníaco (1) Sostener el crecimiento sobre una botella abierta al vapor de amoníaco. (2) Agregar 1 mL de amoníaco a la tapa de la placa de Petri e invertir el medio sobre ésta. El

hidróxido de sodio y el hidróxido de amonio son extremadamente cáusticos, por eso evitar la exposición de la piel ya que pueden ocurrir quemaduras dolorosas. VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Positivo (+) Staphylococcus aureus subesp. aureus Staphylococcus epidennidis

ATCC 25923 ATCC 12228

B. Negativo (-) Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus hominis

ATCC 15305 ATCC 27844

Vil. INTERPRETACIÓN (2): CUALQUIER REACTIVO_________________________________ A. Positivo (+): caldo o colonias coloreados de rosa-rojo brillante. B. Negativo (-): sin cambios de color; el caldo o las colonias permanecen claros o blancos. Según Lewis (11), los métodos de tubo y placa presentan una sensibilidad igual para los estafilococos coagulasa positivos. Sin embargo, sus estudios m ostraron que el método en placa no indica cepas patógenas, pero es mejor que el método en caldo para los estafilococos coagulasa negativos, mientras que el método en caldo mostró menor cantidad de cepas fosfatasa positivas y coagulasa negativas. El procedimiento en caldo puede ser utilizado para la comprobación de la fosfatasa y de la coagulasa (8).

VIII. MEDIOS/PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS A.

Agar sangre fosfato (PDPBA) 1. Util como un medio de diferenciación para la selección de los aislamientos estafilocócicos. 2. Base: agar Columbia: BBL, Difeo.

Prueba de fosfatasa 373 a. Para comenzar, ingredientes base: Peptona de caseína/came (50/50) Peptona de caseína/levadura (50/50) Peptona de corazón Cloruro de sodio, NaCl Almidón de cereal Agar Agua desionizada

10 g 10 g 3g 5g 1g 13,5 g 1.000 mL

b. Sustrato: sal tetrasódica de difosfato de fenolftaleína (Sigma-Aldrich). (1) Esterilizado por filtración con membranas y agregado en una dilución 1:10 al agar base es téril (en autoclave) y enfriado (50°C). c. M edio final 4% Agar base Columbia Sangre de oveja desfibrinada estéril 5% Sal teirasódica de difosfato de fenolftaleína 0,05% d. Fraccionar 15-20 mL/placa de Petri.

B. Procedimiento del fosfato con verde de metilo (MGP) (15-18) 1. Procedimiento de Satta y col. (16); desarrollado originalmente para la identificación de bacterias grampositivas; modificado para abarcar a los bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae (16). 2. C olorante: verde de metilo (MG) a. Fabricante: Cario Erba, M ilán Italia. b. Esterilizado por filtro Seitz, 0,22 jt de tamaño de poro c. 50p.g/mL. 3. Sustratos de fosfato: tres opciones; 500 pg/mL. a. Difosfato de fenolftaleína (PDP), 0,5 M. b. Monofosfato de fenolftaleína (PMP). c. 6-Bencilnaftil fosfato (6-BNP). 4. M edio: agar triptosa fosfato (TPA) a. Difeo: Tryptose phosphate broth (TPB). b. Agregar 15 g de agar/L de medio. c. Enfriar el TPA preparado a 44°C y agregar verde de metilo y el sustrato de fosfato deseado. 5. Fraccionar: 20 mL/placa de Petri. 6. Inoculo: tom ar colonias aisladas y depositarlas sobre la superficie del agar. 7. Incubación: 35°C, 24 h. 8. Interpretación a. Positivo (+) (1) Todas las colonias que exhiben color azul-verde; debido a la actividad de la fosfatasa

bacteriana (17). (2) Toda coloración azul-verde del agar que rodea las colonias o que está por debajo de las co lonias es registrada como un halo (17). La enzima liberada en el medio por las bacterias que están en la fase de crecimiento es la responsable de los halos coloreados (15). El agar de doble potencia se utiliza para evitar el crecimiento diseminado de las especies de Proteus (15). Las sensibilidades del procedim iento para las bacterias gramnegativas varían con los diferentes sustratos de fosfato (15). Se obtienen sensibilidades más altas con PM P e incluso m ejor con 6-BNP cuando cualquiera de los dos sustituyen al PDP convencional (15). Según Satta y col. (16j), todas las cepas de la fam ilia Enterobacteriaceae excepto algunas de Leminorella richanlii formaron colonias co loreadas de verde. Las cepas de las bacterias intestinales gramnegativas Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes faecalis, seudomónadas aeruginosa y otras Pseudom onas que crecen en agar de M acConkey (MAC) y ferm entan la glucosa fueron todas fosfatasa negativas y todas fracasaron para producir colonias coloreadas en M GP (17). La actividad extracelular se detecta con facilidad por el procedimiento de fosfatasa con verde de me tilo pero no por las pruebas convencionales (15). Las cepas de Proteus producen una fosfatasa extracelu lar y una intracelular (17). M organella morganii y Providencia stuartii presentan una actividad intracelular mucho más alta que el resto de los miembros de la familia Enterobacteriaceae; éstas se detectan con facilidad por el M GP pero no por las pruebas convencionales (17).

374

Pruebas bioquímicas individuales

C. Hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (PNP) 1. El PNP incoloro por acción de la fosfatasa alcalina produce fosfato inorgánico (Pi) y p-nitrofenol amarillo. "2. Diversos procedimientos para la reacción de la fosfatasa de los estafilococos coagulasa negativos. a. Procedimiento de Penny y Huddy (13) (1) 0,5 mL de PNP al 0,1% por tubo. (2) Inóculo denso proveniente de un cultivo en agar con sangre. (3) Positivo: color amarillo dentro de las 4 h; liberación de p-nitrofenol. S. aureus subesp. au reus, S. hyicus, S. intermedius, S. schleiferi y la mayoría de las cepas de S. epidermidis son positivos para la fosfatasa alcalina. b. Procedimiento de Geary y Stevens, agar PNP (8) (1) Agar tamponado de Muller-Hinton a pH 5,6-5,8 con el agregado de 0,495 mg/mL de PNP. (2) Manchas inoculadas e incubadas durante 18-24 h. (3) Positivo: color amarillo brillante debajo del inóculo y alrededor de él.

D. Prueba de la mancha (14) 1. Objetivo principal: identificación de S. saprophyticus coagulasa negativo (-) de S. epidermidis (+) en cultivos de orina. Procedim iento recom endado por Pickett (14) en urocultivos para identifi car S. saprophyticus; este microorganismo es la segunda causa más común, después de los coliformes, del síndrome uretral agudo en las mujeres (10, 21). 2. Inóculo: colonias provenientes de agar sangre con PDP. a. Colonia que aparenta ser un aislamiento estafilocócico. b. Realizar primero las pruebas de catalasa y coagulasa. c. Papel de filtro saturado con NaOH 1 N. d. Tomar la colonia y colocarla en el papel de filtro. 3. Resultados a. Positivo (+) (1) Rosa brillante en segundos; fenolftaleína libre. (2) S. epidermidis. b. Negativo (-) (1) Ausencia de color. (2) S. saprophyticus. Identificación basada en un resultado de fosfatasa negativo junto con la resistencia frente a un disco de 5 pg de novobiocina (< 17 mm) (14) La principal ventaja es la eliminación de S. epidermidis, que por lo común no tiene importancia clíni ca en los urocultivos (14). E. Comprimidos/discos comerciales 1. Comprimidos para fosfatasa alcalina (P 0 4) o PNP: Key Scientific Company 2. Discos de fosfato: BBL.

IX. PRECAUCIONES A. El color producido por el indicador fenolftaleína varia con el pH (4). Agregar los reactivos en sus can tidades correctas porque una deficiencia o un exceso de álcali puede dar resultados falsos positivos o falsos negativos. B. Las colonias probadas para la producción de fosfatasa con vapores de amoníaco son viables por un pe ríodo de tiempo muy corto y en el caso de ser necesario efectuar subcultivos, deben ser realizados de inmediato después de registrar los resultados (4). C. Evitar la rotulación de los dos tubos de caldo como tubo 1 y tubo 2 cuando son procesados de mane ra simultánea sobre un único microorganismo; en la mayoría de los laboratorios las muestras se rotu lan con un número. El hecho de utilizar A y B u otras letras comparables evita la posibilidad de con fusión del número de muestra del laboratorio con el número del tubo. D. El método en caldo sólo puede utilizarse después que el microorganismo fue aislado en un cultivo

puro (11). E. La prueba de fosfatasa para la determinación de la patogenicidad de Staphylococcus no debe ser con fundida con la prueba de fosfatasa empleada para determinar el efecto de la pasteurización en la leche; las dos pruebas no son lo mismo (6).

Prueba de fosfatasa 375 F. El PDP es relativam ente inestab le. La degradación puede ocurrir en los medios o en la sustancia original si no se conserva a -20°C , al disociarse el fosfato de fenolftaleína y dar resultados falsos positivos. G. Soro y col. (20) mostraron que la actividad de fosfatasa es una propiedad de todas las especies de Staphylococcus cuyas cepas son aisladas con más frecuencia a partir de un origen humano. La produc ción de fosfatasa es afectada por el pH y por la presencia de P¡ en el medio de crecimiento (9). Soro y col. (20) encontraron que todas las cepas de Staphylococcus eran fosfatasa positivas a pH 8 cuando desarrollaron sin la presencia de P¡; sin embargo, cuando crecieron en un medio con el agregado de 0,3% de P¡ a un pH bajo o alto, sólo S. aureus subesp. aureus, la mayoría de S. epidermidis y S. xylosus fueron fosfatasa positivos y ninguna de las otras especies de Staphylococcus probadas fueron fos fatasa positivas (20). Las fosfatasas de los diversos estafilococos presentan propiedades diferentes (20). La actividad es constitutiva en algunas especies y reprimida en otras (20).

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CAPÍTULO

Prueba de porfirina-ácido 8-aminolevulínico (ALA) I. PRINCIPIO Probar si las especies de Haemophilus que no requieren hemina poseen la enzima necesaria para sintetizar precursores del hemo a partir del ácido 8-(delta)-aminolevulínico (ALA); detección de síntesis de porfmna (3).

II. OBJETIVO___________________________________________________________________ Determinación de especies de Haemophilus.

III. BIOQUÍMICA La mayoría de las especies de Haemophilus requiere factor X, factor V o ambos para su crecimiento.

Factor X El factor X es la hem ina (también denominada protoporfirina), un compuesto termoestable que es ne cesario para la síntesis de las enzimas respiratorias. Algunas especies de Haemophilus carecen de la en zima necesaria para convertir ALA a protoporfirina y son dependientes del factor X (7).

ALA La prueba original de ALA descrita por Kilian (3) detecta la capacidad de las cepas de Haemophilus para sinletizar intermediarios de protoporfirina en la vía metabóhca biosintética para la hemina a partir del precur sor ALA (4). El ALA es el precursor del porfobilinógeno, de las porfirinas y del hemo; la enzima porfobilinógcno sintetasa convierte el ALA en porfobilinógeno sin requerimientos del factor X hémico para el crecimien to. Se combinan dos moléculas de ALA para formar el compuesto porfobilinógeno (PBG) con anillo pirrólico. COOH COOH

CH2

CH2 C'H2 C=tO / \ ch2

COOH

Í H2 ó ;= c H'^-C— H H- v ' / NH

nh2

Dos moléculas de 8 -aminolevulinato

COOH

C ",

2H ,0

c -----

ALA deshidratasa

cn 2 cn 2 -c II

,CH CH 2

NH 2

N H

Porfobilinógeno (primer precursor pirrólico)

(6 )

Luego cuatro moléculas de PBG se combinan para formar uroporfirinógeno, el cual con posteriori dad sufre una sustitución en la cadena lateral para formar coproporfirinógeno y protoporfirina IV. La

Prueba de porfirina-ácido 8-aminolevulínico (ALA) 377 protoporfirina IV es el precursor inmediato del hemo (5). Mediante una oxidación, se forman los subpro ductos de la reacción, uroporfirina y coproporfirina (5).

IV. PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA; DOS OPCIONES______________________________ A. Solución de ALA como sustrato de la enzima (1) 1. Ingredientes C lo rh id rato de ácido 8-am inolevulm ico (S ig m a C o), (2 m o l/L ) S u lfato de m agnesio, M g S 0 4 (0,08 m ol/L ) B u ffer fosfato (0,1 m ol/L ), pH 6,9

0,34 g 0,0096 g 1.000 m L

2. Fraccionar a. Tubos pequeños (12 x 75 mm), con plástico en la parte superior b. 0,5 mL/tubo. El sulfato de magnesio debe ser preparado como una solución más concentrada y diluido a la concentra ción final deseada.

B. Discos ALA 1. Fabricante: REMEL. 2. Detección rápida de porfobilinógenos y porfirinas. 3. Método de uso; seguir las indicaciones del fabricante, a. Rehidratar el disco. (1) Retirar del frasco am polla provisto por el fabricante sólo la cantidad de discos a ser utiliza dos en un momento dado y dejarlos a temperatura ambiente antes del uso. (2) Colocar el lado “A” del disco hacia abajo, directamente sobre la superficie del agar o en una placa de Petri estéril. (3) Rehidratar con 40 pL de agua estéril. No sobresaturar el disco. 4. Inoculo a. Inoculo denso de una colonia aislada de 18 a 24 h de una cepa sospechosa de Haemophilus. b. Colocar papel de filtro, humedecido con agua estéril, en la tapa del recipiente que contiene la muestra para mantener húmedo el disco. 5. Incubación: 35°C. 6. Resultados: examinar el disco para la aparición de una fluorescencia roja en 1 h y hasta dentro de las 6 h en una habitación oscura con una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lámpara de Wood); alrededor de 360 nra. 7. Química de la reacción: varios porfirinógenos son incoloros; mientras que diversas porfirinas, cuan do se disuelven en solventes minerales fuertes ácidos u orgánicos y cuando se iluminan con la luz ultravioleta, emiten una fuerte fluorescencia roja (6). Las ligaduras dobles en las porfirinas son res ponsables de la absorción y de la fluorescencia características (6). H C= 5 I HC — C

sHC----- C IV

H Pirrol

7HC-

/ HC— C i |

=CH I 3 C = =CH / HN II \ C = =CH 4 I =CH

c= H

Molécula de porfina. Los anillos están marcados como I, II, III, IV. Las posiciones a ser sustituidas en los anillos están marcadas como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Los puentes metenilos están marcados como a, (i, y y 8. (6)

Porfina (C 2 0 H 14 N 4 )

378

Pruebas bioquímicas individuales

La reducción (por el agregado de hidrógeno) de los puentes de metenilo (-H C =) a metileno (-C H 2—) con duce a la formación de compuestos incoloros denominados porfirinógenos (6). 8. Conservación a. Solución ALA: -20°C hasta el uso. b. Discos ALA: en envase original, 2-8°C; protegidos de la luz.

V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Positivo (+): Haemophilus parahaemolyticus B. Negativo (—): Haemophilus influenzae

ATCC 10014 ATCC 10211

VI. RESULTADOS

Vil. INTERPRETACIONES A. Positivo (+) 1. Solución ALA: desarrollo de una fluorescencia de color rojo ladrillo a naranja en la fase acuosa inferior bajo la luz ultravioleta (lámpara de Wood). 2. Discos ALA: desarrollo de una fluorescencia de color rojo-naranja bajo la luz ultravioleta. 3. Presencia de porfirinas. 4. Las cepas de Haemophilus que no requieren factor X exógeno para el crecimiento poseen enzimas que sintetizan compuestos de p rotopoiirm a a partir del ALA (4). B. Negativo (-) 1. Sin cambios de color en la capa de reactivo ni en el disco cuando se examina bajo luz ultravioleta. 2. No puede sintetizar hemo. 3. Las cepas de Haemophilus que requieren factor X exógeno para el crecimiento no pueden sinte tizar protoporfirinas a partir del ALA (4).

VIII. PRECAUCIONES A. Generales 1. Las observaciones de la fluorescencia deben realizarse en un am biente oscuro o en una caja negra. 2. Las bacterias oxidasa positivas y catalasa positivas encontradas con frecuencia en la orofaringe pueden formar hemo y precursores del hemo a partir del ALA y, en consecuencia, dan resultados falsos positivos. La morfología del microorganismo a ser probado debe ser compatible con las es pecies de Haemophilus (2). Asimismo, los microorganismos que dan una fuerte reacción positiva de oxidasa o catalasa pueden dar un resultado falso positivo debido a que estos microorganismos fabrican hemo y sus precursores a partir del ALA en el proceso de síntesis de oxidasa y catalasa. Probar sólo las especies de Haemophilus con ALA. 3. Probar siempre subcultivos frescos de microorganismos para el control de calidad cada vez que se realiza la prueba (1). 4. Los cultivos a ser probados no deben tener más de 24 h. 5. El inoculo debe ser denso; cuanto más denso, mejor.

B. Discos ALA 1. Conservar en el envase original a 2-8°C y proteger de la luz; el sustrato es altamente sensible a la luz. 2. Las especies de Haemophilus a ser probadas deben tener de 18-24 h, no más tiempo. 3. Proteger los discos de la humedad; extraer sólo la cantidad de disco necesaria. Dejar que los dis cos alcancen la temperatura ambiente (22-25°C) antes del uso. 4. No utilizar los discos si a) varía el color blanco, b) se pasó la fecha de vencimiento o c) la sustan cia desecante del frasco cambió del color azul al rosa.

P r u e b a d e p o r f ir in a - á c id o 5 - a m ¡ n o le v u lín ¡ c o ( A L A )

379

REFERENCIAS 1. Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM. Bailey & . Scott’s Diagnostic Microbiology, ed 9. St. Louis: CVMosby, 1994:415-417. 2. Gadbury JL, Amos MA. Comparison of a new com mercially prepared porphyrin test and the conven tional satellite test for the identification of Haemo philus species that require the X factor. J Clin Mi crobiol 1986;23(3):637-639. 3. Kilian M. A rapid method for the differentiation of Haemophilus strains. Acta Pathol Microbiol Scand Sect B 1974;82:835-842.

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CAPÍ TULO # »

Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-(3-naftilamida (PYR) I. PRINCIPIO Detectar la presencia de la enzima L-pirrolidonil arilamidasa (PYR).

II.

OBJETIVO

La prueba PYR es una modificación de la prueba descrita por Godsey, Schulman y Enriquez (4). A. Prueba presuntiva específica tanto para los estreptococos P-hemolíticos del grupo A (5. pyogenes) co mo para la mayor parte de las especies de Enterococcus del grupo D; diferencia los estreptococos del grupo A de otras especies de Streptococcus. Prueba altamente sensible; reemplaza a la bacitracina y a la tolerancia a la sal (crecimiento en NaCl al 6,5%) (3). B. Caracterización preliminar de Streptococcus, de Enterococcus y de microorganismos símil estrepto cocos. La prueba PYR a menudo se utiliza junto con la prueba de leucina aminopeptidasa (LAP) y con otras pruebas bioquímicas (6) (cuadro 37-1).

Cuadro 37-1. C a ra cte rística s de Streptococcus, Enterococcus y m icro o rg a n ism o s tipo Streptococcus (3)________________________________________________________________

C atalasa

LAP

PYR

H id ró lisis d e la e scu lin a

+ +

V + +

V + “ +

M ic ro o rg a n is m o

p -Streptococcus S. pneum oniae S. pvogenes, grupo A Otras especies de p- Streptococcus Especies de Enterococcus, grupo D Aerococcus A. viridans A. urinae Alloiococcus otitis Gemella G. haem olysans G. m orbillorum G 'obicatella sanguis Helcococcus kunzii Especies de Lactococcus Especies de Leuconostoc

Variantes nutricionales de estreptococos A bio lio p h ia adiacens Abiotrophia defectiva Especies de Pediococcus Especies de Tetragenacoccus Especies de Vagacoccus

C re cim ie n to en N a C l a l 6,5%

— v+

s s s s

+ + +a

s s s

+ +

V V

V +

_l_wb

V + +

+ V

+ + +

V V

+ + +

V NR

NR, no se dispone de resultados; +w, positivo débil; S, susceptible (sensible); R, resistente. aPuede tardar 2-7 días. bDebe utilizarse un inoculo grande.

Vaneom icin a

s s s s s R s s R

S S

Prueba de hidrólisis de pirrolidonil-p-naftilamida (PYR) 381 C.

Caracterización de especies de Staphylococcus (5, 9, 12); S. haemolyticus, S. intermedius, S. lugdunensis y S. schleiferi por lo común son todos PYR positivos (9).

III. ENZIMA/SUSTRATO__________________________________________________________ Enzima La aminopeptidasa bacteriana (EC 3.4.11.8) L-pirrolidonil arilamidasa, también denominada pirrolidonasa, L-piroglutamilaminopeptidasa y L-piroglutamilpeptidasa hidrolasa (9).

Sustrato A. L-pirrolidonil-P-naftilamida; también denominada pirroglutamil-P-naftilamida o ácido-L-piroglutámico-P-naftilamida. B. Fabricante: Sigma. C. Disolver en alcohol metílico (CH3OH) y diluir con agua destilada estéril. Ajustar el pH a 5,7-6; con centración final, 0,02%.

IV. REACTIVO p-DIMETILAMINOCINAMALDEHÍDO (DMACA)_________________________ (N ota: El mismo reactivo que se utiliza para la prueba LAP (cap. 21).) A. Propiedades 1. Disponible comercialmente. 2. El DMACA es un revelador; un análogo vinilo de p-dimetilaminobenzaldehído (DMABA). 3. El reactivo se acopla con la naftilamina para formar una base de Schiff roja (2, 6). 4. No es un colorante, pero con la hidrólisis produce una sustancia que se convierte en un colorante azo insoluble (7) 5. Solución ácida; concentración al 1% en ácido clorhídrico concentrado (HC1) al 10%; concentra ción final, 0,01%. 6. Preparar fresco cada 2 meses. B. Química de la acción del reactivo: El reactivo PYR/LAP es una solución ácida que contiene deter gente que forma una base de Schiff roja con P-naftilamina libre. Las P-naftilaminas no son reactivas, ya que el grupo amino está involucrado en el enlace amida (3). 1. Paso 1: el sustrato L-pirrolidonil-P-naftilamida es hidrolizado por la enzima L-piroglutamilaminopeptidasa a L-pirrolidona y p-naftilamina libre; una sustancia incolora. 2. Paso 2: La P-naftilamina reacciona con DMACA, el que actúa como un colorante acoplador diazo y forma un color rojo.

PASO 1 L-PirroNdonil-fS-naftilamida — L-pirroiidomi arilamidasa

L .p jffQ ü d Q n a +

p-naftilamina libre

hidrólisis enzimática

Sustrato

C4H9N (incolora)

C10H7NH2 (incolora)

PASO 2 P-naftilamina

p- Dimetilaminocinamaldehído ------------ Colorante------------Color rojo acoplador diazo

Sustrato

Reactivo PYR

Base Schiff

Cuando se forma un grupo cromóforo azo -N = N - por el acoplamiento con los ñafióles o la naftilami na liberados de modo enzimático, se produce el color (7). Los compuestos diazo se combinan con las am i nas aromáticas o los fenoles (p. ej., P-naftilamina). El grupo azo - N - N - (o el grupo diazo si un N es co nectado a un elemento distinto del carbono) da un compuesto coloreado (7) que contiene estructuras no saturadas; por ejemplo, -N = N - (azo).

382 V.

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

PRUEBAS RÁPIDAS

(Nota: se dispone de adaptaciones comerciales fabricadas por REMEL; tanto medios como reactivo.) A. Caldo PYR (1 ,6 , 9, 10) 1. Medio basal: caldo de Todd-Hewitt a. Sustrato L-pirrolidonil-p-naftilamida, 0,01%. b. Fraccionar 0,02 mL/tubo con tapa a rosca (13 x 100 mm). 2. Inoculo: con un ansa de inoculación estéril, tom ar 2-3 colonias con morfología sim ilar y emulsio nar en el caldo/sustrato de PYR; turbidez del estándar no. 2 de McFarland (véase Apéndice 5). 3. Incubación: 35°C, 4 h. 4. Después de la incubación, agregar 1 gota del reactivo PYR/LAP a cada tubo sin mezclar. Obser var el cambio de color después de 2 min.

B. Agar PYR (3, 11) 1. Medio: Agar con tripticasa y soja (TSA) con sustrato al 0,01%. 2. Inoculo e incubación: similares a los mencionado antes para el caldo PYR; estriar para el aisla miento. 3. Después de la incubación, agregar 1 gota del reactivo PYR/LAP directamente a la superficie de crecimiento de la placa. Observar el cambio de color después de 2 min.

C. l iras reactivas PYR (2, 8) 1. Preparación de las tiras reactivas a. Papel de filtro W hatman Ne. 3 cortado en tiras de alrededor de 1,0 x 0,5 cm. b. Tiras reactivas saturadas con sustrato PYR/LAP, L-piroglutamil-P-naftilamida. c. Secar a temperatura ambiente (22-25°C) y conservar desecadas a 2-6°C; el vencimiento ocurre después de 1 año. 2. Microorganismos de prueba: aislamiento en agar con sangre de oveja (SBA) de 18-24 h, a 35°C, antes de la comprobación. 3. Inoculo a. Colocar las tiras en la placa de Petri y humedecer con agua destilada estéril, pH 5,7-6,0. b. Con un ansa de inoculación estéril, tomar varias colonias con morfología similar y frotar sobre la tira de papel. 4. Incubación: 35°C, 10 min. 5. Agregar 1 gota del reactivo DMACA directamente a la tira y observar el cambio de color.

VI.

PRUEBAS COMERCIALES EN DISCOS

A. Fabricantes; seguir las indicaciones del fabricante. 1. PYR/esculin disks (Discos para PYR/esculina): REM EL (11). 2. PYR disks (Discos para PYR): Key Scientific Products. B. Procedimientos 1. Rehidratar el disco; dos métodos a. Humedecer con agua destilada estéril. b. Colocar el disco sobre la superficie del agar; por ejemplo, agar con sangre de oveja (SBA). 2. Con un aplicador de madera o un ansa de inoculación, frotar varias veces sobre el disco una can tidad abundante de colonias provenientes de un cultivo puro de una placa de agar de 18 a 24 h. Si el aislamiento es de microorganismos de crecimiento lento, incubar 2-3 días para obtener un ino culo suficiente. 3. Incubar a temperatura ambiente (22-25°C), 5 min. 4. Después de la incubación, agregar 1 gota del reactivo de detección al disco; esperar 1 min para el desarrollo del color.

Vil. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A.

Positivo (+) Streptococcus pyogenes Enterococcus f (tecalis

ATCC 19615 ATCC 29212

P r u e b a d e h id r ó lis is d e p ir ro lid o n il- fS - n a ftila m id a ( P Y R )

383

Negat ivo (-) Streptococcus agalactiae Streptococcus bovis

ATCC 12386 ATCC 9809

VIII. RESULTADOS Véanse figuras 37-1 y 37-2 (Apéndice í) para los resultados fotográficos color. IX. INTERPRETACIÓN A. Positivo (+) 1. Color rojo cereza a rojo púrpura oscuro. 2. PYR hidrolizado. 3. Estreptococos p-hemolíticos del grupo A y enterococos del grupo D. B. Negativo (-) 1. Color rosa, naranja o amarillo (sin cambios). 2. Estreptococos del grupo B, P-estreptococos no A, no B o no D, estreptococos viridans.

I O

_____________________________

A. Generales 1. La publicación DHEW no. (NIH) 76-900 enumera las P-naftilaminas de aminoácidos como carci nógenos. Preparar y conservar los sustratos PYR/LAP de manera cuidadosa. 2. Antes de llevar a cabo la prueba PYR, confirmar que el microorganismo es un coco grampositivo p-hemolítico y que es catalasa negativo. Otros cocos grampositivos, catalasa negativos, son PYR positivos (cuadro 37-1). 3. Los aislamientos clínicos de posibles estreptococos son comprobados preferentemente antes de las 48 h de incubación o subcultivados antes de la comprobación. Los aislamientos PYR negativos después de más de 48 h deben ser resueltos por el empleo de aislamientos frescos o por métodos convencionales (8). 4. Probar cada nuevo lote de reactivo PYR todos los días que se lleva a cabo la prueba. 5. Pueden ser necesarias pruebas bioquím icas y serológicas adicionales para la identificación de finitiva.

B. Discos (11) 1. Conservar los discos en el envase original a 2-8°C; no congelar ni sobrecalentar. Permitir que los discos alcancen la temperatura ambiente antes del uso; no incubar. 2. El desarrollo de color después de 1 min debe pasarse por alto. 3. Pueden aparecer resultados falsos negativos si se utiliza un inoculo inadecuado. C. Tiras reactivas PYR; descartar si la sustancia desecante cambia del color azul al rosa.

REFERENCIAS 1. Bosley GS, Facklam RR, Grossman D. Rapid iden tification of enterococci. J Clin Microbiol 1983; 18(5): 1275-1277. 2. Ellner PD, Williams DA, Hosmer ME, Cohenford A. Preliminary evaluation of a rapid colorimetric method for the presumptive identifica! on of group A streptococci and enterococci. J Clin Microbiol 1985;22(5):880-881. 3. Facklam RR, Thacker LG, Fox B, Etiquez L. Pre sumptive identification of streptococci with a new test system. J Clin Microbiol 1982;15(6):987-990. 4. Godsey J, Schulman R, Ennquez I. The hydrolysis of L-pyrrolidonyl-P-naphthylamide as an aid in the rapid identification of Streptococcus pyogenes, S.

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avium, and group D enterococci. Abstr Annu Meet Am Soc Microbiol, C84,1981:276. Hébert GA, Crowder CG, Hanco*ck GA, et al. Cha racterization of coagulase-negative staphylococci that help differentiate these species and other mem bers of the family Micrococcaceae. J Clin Micro biol 1988;26(10): 1939-1949. KonemanEW, Allen SD, JandaWM.etal. ColorAtlas & Textbook of Diagnostic Microbiology, ed 5. Phi ladelphia: JB Lippincott, 1997:609, 614-615,1375. Lillie RD. HJ Conn’s Biological Stains, ed. 9. Bal timore: Williams & Wilkins, 1977:200. Morgan JW. Evaluation of a rapid method for the determination of L-pyrrolidonyl-P-naphthylamide

384

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

hydrolysis. Lab Med 1987;18(10):682-683. 9. Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al. Manual of Clinical Microbiology, ed 6. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1995:289-290. 10. OberhoferTR. Value of the L-pyrrolidonyl-P-naphthylamide hydrolysis test for identification of se

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CAPÍ TULO t

Prueba de hidrólisis del almidón I. PRINCIPIO A. Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón por medios enzimáticos. B. Probar la desaparición del almidón por el uso de un reactivo con yodo.

II.

OBJETIVO (Véanse también caps. 43 y 44)

A. Ayudar a la diferenciación de especies entre varios géneros de microorganismos aerobios: especies de Bacillus y especies de Streptococcus. 1. Bacillus pum ilis (-), B. sphaericus (—) de otras especies de Bacillus (+) aisladas con más frecuen cia. 2. Streptococcus bovis (+), no enterococos, del grupo D (+) de otras especies de Streptococcus del grupo D (por lo común —) (29). B. Ayudar a la diferenciación de especies entre diversos géneros de microorganismos anaerobios: 1. Clostridium butyrium (+), C. baratii (+), C .fa lla x (+), C. perfringens y C. sphenoides (variable) de otras especies de Clostridium ( -) aisladas con más frecuencia con esporas subterminales. 2. Prevotella oulora (—) y P. intermedia (variable, por lo común +) de otras especies de Prevotella (+) aisladas con más frecuencia. C. Ayudar a la diferenciación de especies 1. Corynebaclcrium diphtheriae tipo gravis (+) de otras especies de Corynebacterium (por lo común -). 2. Pseudomonas saccharophila (+) y P. stutzeri (+) de otras especies de Pseudomonas ( -) aisladas con más frecuencia. 3. Brevundimonas vesicularis (+) de B. diminuta (—) (20). 4. Chryseobacterium meningosepticum (—) de C. indologenes (+) (20). D. Ayudar a la identificación de géneros en los que todas las especies son 1. Especies de M ethylobacterium (+). 2. Especies de M obiluncus (+). 3. Especies de Roseomonas (+).

III.

BIOQUÍMICA

El almidón es un hom*opolisacárido, un producto de condensación (23) de muchos monómeros (uni dades moleculares) de un único tipo de monosacárido, a-D-glucosa, que forma un polímero de muchas unidades unidas por puentes a-glucosídicos (acetal) (14). Los polisacáridos (C6H 10O5)n como el almidón y las dextrinas por definición se producen por hidrólisis de más de seis moléculas de monosacáridos (14). La estructura básica del almidón es una mezcla de dos moléculas de polisacárido poliglucosa: anulosa li neal (10-20%) y amilopectina ramificada (80-90%) (17), por lo común en una relación 1:4 a 1:5 (22). El almidón que sólo da glucosa con la hidrólisis se denomina glucosán (14).

386

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

El almidón es una clase de hidrato de carbono de alto peso molecular con una solubilidad baja en su estado nativo, sólo levemente soluble en agua (5, 7) e insoluble en etanol acuoso y por lo general en sol ventes orgánicos (5). Los residuos de glucosa (dextrosa) del almidón, oc-amilosa y amilopectina, son to das moléculas de a-D-glucosa (glucopiranosa). La glucosa (C6H 120 6) es un monosacárido de 6 carbonos, una hexosa.

O Las líneas muestran la posición (proyección) de los grupos OH

a-Glucosa

Dado que el anillo recuerda al complejo heterocíclico de seis miembros pirano

'j- también puede c— c

denominarse piranosa (23); a-glucopiranosa. L a diferencia estructural entre a-glucosa y (3-glucosa es la posición (proyección) de los grupos OH en el carbón número 1: a , hacia abajo (debajo del plano) en la fórmula de Haworth o a la derecha en la cadena recta; |3, hacia arriba (sobre el plano) o a la izquierda (18, 23). La forma habitual encontrada en el almidón es a . En este caso la diferencia con la celulosa es la digestibilidad. La celulosa está compuesta de unidades de (3-glucosa indigeribles; el almidón está formado por unidades a-digeribles (18). cCH2OH O I *•

' \ / 0H 1C II 2C I 3C

y °\

(vi 1 N' | O H

H0\ / H 1C

2C 1 3C

5C 1 6CH2OH

6CH2OH a

Símbolo utilizado cuando no se requiere la designación a o p

La glucosa que aparece de manera natural es el D-isómero; sin embargo, existen dos isómeros ópticos, y l . Las dos formas son imágenes especulares pero no son idénticas; son asimétricas y no pueden su perponerse. La form a d se presenta de manera natural; la forma l es artificial (18). d

c h 2o h

Anillo de oxígeno

D-

arr./izq.

arr./derecha

a -D -

L-

arr./der.

arr/Izquierda

P-D- en el mismo lado

CH2OH + OH, carbono 1 en lados opuestos

La glucosa contiene un grupo aldehido (CHO o 0 = C -H ) y por consiguiente también es una aldosa o aldohexosa (23). Es un polihidroxialdehído que posee propiedades de aldehidos (23). La glucosa existe en tres formas fácilmente interconvertibles; también existe en solución acuosa y se establece un equili brio entre las formas abiertas y cíclicas (18).

Prueba de hidrólisis del almidón 387

oi-Glucosa (hemiacetal cíclico) (36%)

Forma abierta (polihidroxialdehído) (0,02%

p-Glucosa (hemiacetal cíclico) (64%)

La forma aldehido es inestable y existe sólo como un intermediario transitorio en las reacciones de hi dratos de carbono (18). Los aldehidos reaccionan con un grupo alcohol para formar un compuesto hem ia cetal inestable que no involucra una pérdida de agua o con dos grupos alcohol (p. ej., residuos de gluco sa) con pérdida de agua por la formación de acetal (18, 23). La glucosa posee una ligadura hemiacetal \

a la cual se unen una ligadura éter ( - C - 0 - C - ) y un grupo -O H ; el OH en el hemiacetal es

O— C—

activado por la ligadura éter unida en el mismo sitio (18). O II R—C —H Aldehido

HOR' ^ Alcohol

OH I R — CH I OR'

+HOR' Segundo alcohol

Hemiacetal

OR +

R— CH

H20

OR'

Acetal

R’ y R ” en el almidón son idénticos; residuos de a , D-glucosa.

Hemiacetal (residuo de glucosa)

Alcohol (residuo de glucosa)

Acetal (a-maltosa)

La acetalización bloquea cualquier posible apertura del anillo para formar el azúcar aldehido (5). En el al midón, los puentes de oxígeno acetal ( - C - 0 - R - ) que unen las unidades de glucosa son hidrolizados con fa cilidad, en especial en presencia de ácidos y ciertas enzimas, por ejemplo, amilasas (3,18, 23). La hidrolasa, la enzima digestiva específica para la hidrólisis del almidón, fue denominada en un comienzo como diastasa (1); en la actualidad se denomina amilasa. Existen dos tipos de amilasas: oc-amilasa o endoamilasa (5, 13), excretada por muchas bacterias (16, 27), y (3-amilasa o exoamilasa, presente en los vegetales superiores (5). El pH óptimo para la actividad de la oc-amilasa es de 6,9-7,2 (3, 24), pero varía de 5,5 a 6,5 con dife rentes sustratos y es inestable por debajo del pH 4,5 (5). Su temperatura óptima es de 50-55°C, pero la reacción parece satisfactoria a 37°C (16). Las a-am ilasas animales requieren cloruro (Cl j o aniones re lacionados (Bi- , L NOj^j en una concentración de por lo menos 0,01 M (3) para su actividad (5). La hidrólisis enzimática ocurre en las uniones a-l,4 -acetal y oc-l,6-acetal que mantienen junto el po límero de almidón (27). La a-am ilasa cataliza la hidrólisis de las uniones a-l,4-glucosídicas (acetal) de polisacáridos como el almidón (3). Ataca el interior de las cadenas de polisacárido, ya sea amilosa o amilopectina, en puntos al azar, para formar una mezcla de fragmentos (15, 23) de 5 a 9 unidades (15) de la configuración a (5). La amilosa es degradada por completo por la amilasa (5). La hidrólisis com pleta del almidón requiere otra enzima, que actúa en los puntos de ramificación 1,6 en la molécula de amilopectina, como la oligo-1,6-glucosidasa (5). Las dextrinas y la maltosa son absorbidas por las células a partir del medio y con posterioridad son hidrolizadas por enzimas intracelulares específicas (27): por ejemplo, enzima de dextrina ramificada, 1,4-a-á-glucan; 6-a(l,4-a-glucano)rtransferasa (30); maltasa (glucosidasa), una enzima que desintegra los glucósidos con compuestos hidrolizantes con especificidad de grupo y con uniones a-glucosídicas (23).

388

Pruebas bioquímicas individuales

Takesh*ta y Hehre (28) demostraron en un comienzo que la digestión del almidón o del glucógeno por las a-am ilasas puede conducir, en ciertas circunstancias, a productos que difieren desde el punto de vis ta estructural de los obtenidos por la hidrólisis. La a-am ilasa convierte el almidón en productos distintos de las entidades que poseen hemiacetal (dextrinas, maltosa, glucosa). Estos autores también mostraron que aunque los azúcares y las maltodextrinas obtenidos por la digestión de los oc-glucanos por la a-am ilasa se forman sobre todo por hidrólisis, no se originan exclusivamente por este medio o no necesaria mente representan segmentos, ya que preexistían en moléculas del sustrato. En alguna medida su forma ción también involucra la redistribución de unidades glucosílicas de una molécula de sacárido a otra. El almidón también puede ser hidrolizado por hidrólisis ácida, con la formación de los mismos pro ductos intermediarios y de glucosa como producto final; éste es un ejemplo de la acción catalítica del ion hidrógeno (24). La hidrólisis completa del almidón soluble forma residuos únicos de glucosa en un pro ceso de pasos secuenciales (5, 14, 17, 22-25): a-amilasa

(C6H10O5)n*

a-Amilasa

H¡0

(color azul soluble con yodo)

Almidón (hidrato de carbo no no reductor)

Amilopectina

(1)

(color rojo azulado a rojo castaño insoluble con yodo)

a-amilasa

(C6H10O5)x

Dextrinas: (C5HlO ^ y

H20

Amilopectina

Eritrodextrinas (color azul -» violeta rojo castaño con yodo)

(C6H10O5)z

(

Acrodextrinas (incoloras con yodo)

* La molécula se toma cada vez más pequeña a medida que progresa la hidrólisis; n es un número más grande que x, x es mayor que y e y mayor que z

(Q H 1 o ° 5 )z

a-amilasa oligo- 1 ,6 -glucosidasa h 2o

Acrodextrinas

(3)

a-Maltosa (4-a-D-glucopiranosa-a-D-glucopiranósido) (a-D-glucopiranosil-4-a-D-glucopiranosa) (glucosa-4-a-glucósido) (incolora con yodo) c h 2oh

maltasa

(dos moléculas de glucosa por molécula de maltosa hidrolizada)

H20

a-Maltosa

(CH^HaA,)

Disacárido (azúcar reductor) (incoloro con yodo)

a-Glucosa (dextrosa)

(C6Hi 20 6) Monosacárido (azúcar reductor) (incoloro con yodo)

(4)

Prueba de hidrólisis del almidón 389 Los dos constituyentes del almidón, amilosa y amilopectina, están compuestos de una cantidad de re siduos a-glucosa unidos por enlaces 1,4 en las cadenas de amilosa y amilopectina y enlaces 1,6 en el pun to de la ramificación en la amilopectina (14). Las uniones a-glucosídicas son análogas a los grupos a-hidróxilo (OH); las uniones glucosídicas conectan el carbono anom érico (carbonilo potencial) de un monosacárido con cualquier carbono de un segundo monosacárido (23). La a-am ilosa es un polisacárido, con un peso molecular de 59.000 a 1 millón, compuesta de polímeros lineales largos de a-D-glucosa unida por puentes 1,4-a-glucosídicos (acetal) (3, 5, 17). Las uniones a pro ducen una conformación en espiral en la cadena de amilosa; las moléculas se enrollan en una hélice no ra mificada con 6 residuos de glucosa por giro (23). Con la conformación en espiral, los puentes de hidrógeno no pueden formarse fácilmente entre las diferentes cadenas; así, el almidón no tiene fuerza y es más soluble en agua que la celulosa, ya que sus grupos OH pueden interactuar con las moléculas de agua (23). La es tructura helicoidal es responsable de un color azul soluble con el reactivo con yodo (5, 24). La molécula de amilopectina es más grande que la de amilosa, con un peso molecular de 200.000 a muchos millones, compuesta de una red altamente ramificada de unidades de a-D-glucosa (3); se estima que existe una ramificación por cada 24-30 unidades de glucosa unidas en una cadena por puentes 1,4. Cada uno de los residuos unidos por un enlace 1,6-a-glucosídico (acetal) es el origen de una cadena la teral (3, 5, 23); las cadenas altamente ramificadas dan un color rojo insoluble con el yodo (24) debido a que no se enrollan de manera eficaz (14). La posterior hidrólisis de la amilopectina ocurre a través de una serie de moléculas de almidón par cialmente digeridas denominadas dextrinas, de peso molecular decreciente (5); éstas son productos de la degradación parcial al azar de cerca del 4% de los puentes de oxígeno acetal de la amilopectina (17/18). Las dextrinas son aún moléculas grandes (17), que consisten en unos pocos polímeros de glucosa (27), con una marcada reducción en la viscosidad (5, 14). Las dextrinas son moléculas solubles, no fermentables (5), lineales o ramificadas que pueden sufrir una hidrólisis más lenta (5). La primera dextrina forma da es la eritrodextrina, que da un color con el yodo que progresa del azul al violeta al rojo castaño (5,18). A medida que la hidrólisis progresa, el color del yodo ya no se produce más debido a la formación de acrodextrinas que son incoloras (5, 14). Las moléculas terminales de maltosa son hidrolizadas de mane ra sucesiva con la degradación gradual, más o menos completa, de los intermediarios dextrinas a malto sa y a una cantidad más pequeña de glucosa (5). Los monosacáridos como la glucosa no pueden conver tirse en hidratos de carbono más simples por la hidrólisis (23).

Amilosa (Estructura enrollada helicoidal)

(continúa)

390

Pruebas bioquímicas individuales

Ramificación: unión 1,6-a-glucosídica (acetal)

CH,OH

T etc.

etc.

(Redibujado y modificado de Harper, H. A.; Rodwell, V. W. y Mayes, R. A. R e v ie w d e P h y s io lo g ic a l C h em istry, 16a ed., 1977, p. 103, con autorización de Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.)

Algunos azúcares reductores y sustancias fermentables son producidos a través de la reacción; sin em bargo, el principal mecanismo de la reacción es la ruptura de polisacáridos primero a dextrinas, seguida por una lase más lenta de formación de maltosa (5).

IV.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: MEDIO PARA ALMIDÓN

A. Medio adecuado para el tipo de microorganismo a ser probado (1) 1. Caldo. 2. Agar en placas o en pico de flauta. B. Ingredientes; pH 7,2 (12)

1. Mediobasal Peptona Extracto de came Cloruro de sodio, NaCl Agar (omitir en el caso de medios líquidos) Agua desionizada 2.

5g 3g 5g 20 g 1.000 mL

Almidón soluble (de papa) a. Preferido: 0,2% (1, 10, 11) (1) 20 g por litro de medio basal. (2) Recomendado para anaerobios (10). b. Otras concentraciones: 1% (20) o 5% (26).

C. Productos comerciales disponibles 1. M ediobasal a. BBL (2) (1) Infusion agar/broth (Agar/caldo infusión). (2) M ueller-Hinton agar/broth (Agar/caldo de Mueller-Hinton). b. Difeo (9) (1) Heart Infusion Agar (HIA) (Agar infusión de corazón). (2) M ueller-Hinton agar/broth (Agar/caldo de Mueller-Hinton). (3) Proteose N 9. 3 agar (Proteosa agar N 9. 3): 2% de proteosa para 1% de almidón. (4) Tryptose blood agar base (Agar base sangre triptosa). 2. Almidón soluble: Difeo y Merck; BBL, starch M initek disks (discos Minitek de almidón). D. Método de preparación (21) 1. Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo; los productos de las diferentes com pañías pueden presentar leves variaciones.

Prueba de hidrólisis del almidón 391

G. H.

V. A.

2. Rehidratar el medio basal en 500 mL de agua destilada o desmineralizada. 3. Calentar con suavidad la solución. 4. Disolver 20 g de almidón (0,2%) en 250 m L de agua destilada o desmineralizada. a. El almidón nativo es levemente soluble en agua (5, 17). b. Un suplemento termolábil (10). c. Con cuidado, llevar hasta el punto de ebullición; no hervir en exceso, ya que el sobrecalenta miento puede hidrolizar el almidón (7). 5. Combinar (pasos 2 y 4) y mezclar bien por suave rotación del frasco. 6. Llevar el volumen a 1 L. 7. Corregir el pH, si es necesario. Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. De manera aséptica, fraccionar en tubos con tapa a rosca (16 x 125 min) (12). 1. 15 a 20 mL por tubo. 2. Agar en pico de flauta: dejar que el medio solidifique en posición inclinada. 3. Medio de agar en placa a. Fraccionar en tubos para la conservación; no necesita tubos en pico de flauta. (1) Antes del uso, fundir la cantidad de tubos necesarios en un baño de agua en ebullición. (2) Verter en placas de Petri individuales. (3) Dejar que se enfríen antes de la inoculación. b. Si las placas de agar con almidón así preparadas se refrigeran, el medio se tom a opaco. Enfriar antes de usar, ajustar las tapas y refrigerar para la conservación (4-10°C). Inoculación 1. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h. 2. Medio en tubos en pico de flauta: siembra por estría. 3. Medio de agar en placa: pueden ser probados diversos cultivos en una m isma placa de agar (6). a. Una única placa de agar con almidón puede dividirse en cuatro cuadrantes para realizar las de terminaciones por separado. b. Véase el procedimiento en el capítulo 31, Prueba del disco de optoquina, Sección IV, Procedimiento. Incubación 1. 35°C, 18-24 h (L 6), 48 h (11) o hasta que ocurra suficiente desarrollo (1). 2. 20°C: 5 días (1). Agregar reactivo directamente al tubo o a la placa incubados antes de realizar la interpretación; re gistrar los resultados de inmediato.

REACTIVOS EMPLEADOS

_______

Dos opciones

1. Yodo acuoso de Gram (4) a. Ingredientes Y odo en cristales, I2 Y oduro de potasio, K I A g u a d estilada

1g 2g 300 m L

b. Método de preparación (1) Moler la sustancia sólida en un mortero en alrededor de 20 mL de agua destilada. (2) Agregar el resto del agua, enjuagando el mortero con porciones más pequeñas de agua has ta que se alcance el volumen requerido y agitar el frasco hasta la disolución. (3) Filtrar y distribuir en frascos oscuros de farmacia, con una capacidad de 150 mL. 2. Yodo acuoso de Lugol (21) a. Ingredientes Y odo, cristales e n polvo, I2 Y oduro de potasio, K I A g u a d estilad a o desio n izad a

b. Método de preparación (1) Solución stock (a) Disolver KI en agua destilada.

5g 10 g 100 m L

392

Pruebas bioquímicas individuales

(b) Agregar los cristales de I2 de a poco y agitar hasta su disolución. (c) Filtrar en botellas oscuras con tapas herméticas. (2) Solución de trabajo (7) (a) Diluir 1:5 con agua destilada. (b) Filtrar y distribuir en frascos oscuros de farmacia, con una capacidad de 150 mL. (c) Preparar soluciones frescas cada 3 semanas. 3. Cualquiera de los reactivos es una solución de color amarillo oscuro. B. Método de uso; cualquiera de los reactivos (1, 3, 6) 1. Medios a. Caldo (1) Agregar unas gotas de reactivo. (2) Agitar el tubo con suavidad para distribuir el reactivo en todo el medio. b. Medio en placas o en tubos en pico de flauta: bañar con el reactivo. 2. Interpretar la reacción de inmediato; el color azul formado con el almidón puede decolorarse de manera gradual (1). El yodo (I2) disuelto en una solución acuosa de yoduro de potasio (KI), a semejanza del yodo aislado, sólo es levemente soluble en agua, pero cuando el ion yoduro está presente, se combina con las molécu las de yodo formar el ion triyodo, I3, el que libera yodo con facilidad de acuerdo con la demanda (17). La prueba de yodo puede detectar trazas diminutas de almidón en solución (17). C. Control de calidad: los reactivos deben probarse con cultivos positivos y negativos conocidos antes de ser introducidos en el uso general. D. Conservación: conservar los reactivos en un refrigerador (4°C) cuando no están en uso. Estos reacti vos deben colocarse en botellas oscuras para evitar la exposición a la luz. Su estabilidad varía, ya que la solución se aclara de m anera gradual con el tiempo; por consiguiente, debe efectuarse un control de calidad cada semana y descartarse el reactivo cuando da una reacción negativa o débil con un microor ganismo positivo conocido. E. Química de acción del reactivo: la amilosa y la amilopectina se comportan de manera diferente con el yodo (23); la fracción amilosa del almidón se combina con mucho más yodo (23) y produce un com plejo azul intenso, profundo (5, 14, 22, 23, 24). El complejo amilosa-yodo es un complejo de adsor ción de almidón y yodo más que un compuesto definido (24). Las moléculas de yodo están atrapadas dentro de la hélice no ramificada de unidades de glucosa de glucosa de la cadena de am ilosa para for mar un compuesto de inclusión azul (17, 22, 23). Si esta red se desintegra, como ocurre durante la hi drólisis del almidón, el color azul se pierde (17). El curso de la hidrólisis del almidón en un tubo (o placa) de prueba puede ser seguido por el uso del reactivo de yodo, ya que a medida que procede la reacción el color producido por el yodo cambia gradualmente de un color azul intenso a púrpura y lue go a una falta de color si se está produciendo la hidrólisis del almidón (17, 24).

Hélice de las moléculas de yodo encerradas en la amilosa (yodo: espacios sombreados de negro) (Redibujado de Nussenbaum, S. Organic Chemistry. Principies and Applications 1963, p 522, con autorización de Allyn y Bacon, Inc., Boston.)

Las cadenas altamente ramificadas de la amilopectina dan sólo un color rojo con el yodo debido a que •ellas no presentan un enrollamiento eficaz (14, 22). El color es castaño roji*zo a incoloro con la dextrina, lo que depende del tipo de dextrina y del contenido de almidón de la preparación (hidrólisis parcial), co

Prueba de hidrólisis del almidón 393 mo en el caso de muchas preparaciones (24). Cuando se realiza esta prueba, la solución siempre debe te ner una reacción neutra o ácida (24).

VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

______

A . Anaerobios 1. Positivo (+) Bacteroides fragilis Clostridium perfringens

ATCC 25285 ATCC 13124

2. Negativo (-') ’’ Clostridium bifermentans Eikenella corrodens

ATCC 638 ATCC 23834

B. Aerobios 1. Positivo (+) ATCC 6633

Bacillus subtilis 2. Negativo (-)

ATCC 25922

Escherichia coli

Vil. RESULTADOS Véase figura 38-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII. INTERPRETACIÓN A. Positivo (+) 1. M edios (1 ,3 , 6, 10, 11) a. Caldo: ausencia de color en todo el medio; el medio permanece incoloro o presenta un leve tinte amarillo debido al color del reactivo de yodo. b. Placas/tubos en pico de flauta: medio de color púrpura-azul con un área incolora (zona de hi drólisis) alrededor del crecimiento. 2. Ausencia relativa de almidón; aún puede haber presentes 6 o menos unidades de glucosa (16). 3. Almidón completamente hidrolizado a glucosa con ácidos (24). 4. Véase Sección XI, Precauciones, cuando se reabza la prueba de hidróhsis para las especies de Bacillus. B. Hidrólisis parcial 1. El color observado puede dar una estimación grosera de la magnitud de la hidrólisis (16); violeta a rojo a rojo-castaño. 2. Color rojo transitorio a. Presencia de 18 a 12 unidades de glucosa (16). b. Eritrodextrinas (14). 3. Continuar la incubación y realizar una nueva prueba; el hecho de inundar las placas con el reacti vo de yodo no contamina la placa y ésta puede ser reincubada y probada de nuevo con posteriori dad si es necesario (21). C. Negativo ( -) (1, 3, 6, 10, 11) 1. Medios a. Caldo: color azul en todo el medio. b Placas y tubos en pico de flauta: medio color púrpura-azul en el crecimiento (alrededor del mismo). 2. Presencia de almidón; más de 30 unidades de glucosa presentes (16). 3. Almidón no hidrolizado; la m ayoría aún presente. 4. El color azul puede aclararse después de un período corto de tiempo; interpretar los resultados de la prueba inmediatamente después de agregar el reactivo de yodo (1).

394

Pruebas bioquímicas individuales

IX. MICROMÉTODO RÁPIDO A* Procedimiento de Clark y Cowan (6). B. Comprobación de la enzima preformada de las células bacterianas en 4 h. C. Medio de crecimiento 1. Medio sólido que favorezca el desarrollo, de preferencia sin sangre ni sustancias fermentables. 2. 35°C; 18-24 h. D. Suspensión de prueba 1. Lavar el crecimiento proveniente de una placa o pico de flauta con agua de la canilla. 2. El material de vidrio no necesita ser estéril pero debe estar limpio por métodos químicos. 3. Centrifugar y si se utiliza el crecimiento proveniente de un medio de agar con sangre, lavar una vez más para eliminar la hemoglobina. 4. Resuspender las células sedimentadas en un volumen pequeño de agua. E. Procedimiento 1. Pipetear 0,04 mL de la suspensión de prueba en cada uno de los dos tubos de Durham que conten gan 0,4 mL de agar base-almidón (0,2% de agar, 0,05% de almidón de papa). 2. De manera simultánea realizar un blanco control que contenga agar almidón sin inocular. 3. Incubación: 37°C, 4 y 24 h; si el resultado a las 4 h es negativo, continuar la incubación del segun do tubo y probar de nuevo al final de un período de 24 h. 4. Agregar 1 gota de yodo de Lugol; leer después de 30 m in a temperatura ambiente (22-25°C) con tra un tubo blanco. 5. Interpretación a. Hidrólisis: ausencia de color en la columna. b. Ausencia de hidrólisis: color azul en la columna. El micrométodo de Clark y Cowan (6) no es complicado por los efectos colaterales o las reacciones múltiples que pueden ocurrir en los cultivos que crecen en un medio nutritivo que contiene el sustrato de prueba; brinda resultados bastante rápidos y no requiere una técnica estéril. Clark y Cowan (6) mostraron que un resultado positivo se obtiene en 2 h con los microorganismos que hidrolizan el almidón de modo más activo, pero la prueba insume 4 y 24 h de incubación para detectar las reacciones más débiles.

PRUEBAS ALTERNATIVAS

A. Procedimiento de Kellerman y McBeth con etanol (19) 1. Medio: placas con agar y almidón (BBL). 2. Reactivo a. Etanol al 95%f^alcohol etílico). b. Inundar la placa incubada con el reactivo. 3. Interpretación a. Hidrólisis: zonas claras alrededor del crecimiento. b. Ausencia de hidrólisis: áreas blancas alrededor del crecimiento. c. Reacción no instantánea; observar la reacción 30 min después del agregado del reactivo.

B. Detección de productos finales, glucosa; azúcar reductor 1. Reactivo de Benedict o comprimidos Clinitest. 2. Preparación, método de uso e interpretación, véase capítulo 13, Prueba de oxidación del gluconato.

XI.

PRECAUCIONES

A. Enzima: La a-am ilasa no es estable a un pH menor de 4,5 (5).

B. Medios de cultivo/almidón 1. Evitar el sobrecalentamiento del almidón cuando se disuelve en el medio basal; puede hidrolizarse y dar resultados falsos positivos (7). El calentamiento rompe los gránulos y produce amilosa y amilopectina (15). 2. El almidón no es un hidrato de carbono reductor (17) y la preparación del sustrato almidón solu ble debe estar exenta de azúcares reductores (8). 3. El medio de almidón debe tener una reacción neutra o ácida (24); el pH óptimo para el medio es de 7,2.

Prueba de hidrólisis del almidón 395 4. Evitar la utilización del medio de agar con dextrosa y almidón; algunos estreptococos producen bastante ácido a partir del almidón por lo que la prueba resulta poco satisfactoria (9). x5. El agar con almidón brinda los mejores resultados si se utiliza antes de las 2 semanas; después de este período, el almidón cambia y puede desarrollar unas manchas de color púrpura roji*zo con el agregado de la solución de yodo (1). 6. A menudo se recomienda agar nutritivo para el medio basal; sin embargo, el ion cloruro es nece sario para la actividad de oc-amilasa (3, 14) y muchos caldos o agares nutritivos comerciales no contienen cloruro (NaCl) u otros aniones. Cualquier medio utilizado para detectar la hidrólisis del almidón debe contener por lo menos 0,01 M de cloruro (como cloruro de sodio) (3). Es necesario tomar las precauciones necesarias para seleccionar el medio basal para la prueba de hidrólisis del almidón. 7. Es aconsejable no conservar ni refrigerar las placas vertidas con agar y almidón; el medio se tor na opaco, lo que puede dificultar la interpretación de los resultados. Conservar el medio en tubos con tapa a rosca y, justo antes del uso, fundir en un baño de agua, verter y enfriar antes de la ino culación. C. Reactivos 1. Registrar los resultados inmediatamente después de agregar el reactivo de yodo ya que el color azul formado puede aclararse, lo que da un resultado falso positivo de ausencia del almidón (1). 2. El reactivo stock de yodo de Lugol debe diluirse 1:5 para la solución de trabajo; si no se realiza esta dilución el reactivo es demasiado fuerte, de modo que queda atrapado demasiado yodo en la hélice de amilosa y se presenta un exceso de yodo (libre) en el medio; en consecuencia, no se de tecta la verdadera hidrólisis del almidón, lo que da un resultado de la prueba falso negativo. D. Interpretación/resultados 1. Los microorganismos de prueba que muestran un color rojo-violeta con el reactivo de yodo (hidró lisis parcial), deben ser probados de nuevo después de una incubación adicional; la inundación de las placas o de los tubos en pico de flauta con yodo no contamina el crecimiento (21). 2. Algunas cepas de las especies de Bacillus producen sólo zonas restringidas de hidrólisis que pue den no ser evidentes hasta que el crecimiento bacteriano se elimine del agar antes de interpretar los resultados (8). E. Micrométodo: el procedimiento de Clark y Cowan (6) no requiere equipamiento estéril, pero el m a terial de vidrio debe limpiarse por métodos químicos para evitar la introducción de cualquier sustan cia que pueda interferir o modificar los resultados.

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25. Poner JR. Bacterial Chemistry and Physiology. New York: John Wiley & Sons, 1946:497. 26. Skerman VB. A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, ed 2. Baltimore: Williams & Wilkins, 1967. 27. Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA. The Mi crobial World, ed 2. Englewood Cliffs, NJ: Prenti ce-Hall, 1963:301-302. 28. Takesh*ta M, Hehre EJ. The capacity of alphaamylases to catalye the nonhydrolytic degradation of starch and glycogen with formation of novel glycosylation products. Arch Biochem Biophys 1975; 169(2):627-637. 29. Trepeta RW, Edberg SC. Measurement of microbial alpha-amylases with p-nitrophenyl glycosides as the substrate complex. J Clin Microbiol 1984; 19( 1): 60-62. 30. Umek K, Yamamoto T. Structures of multibranched dextrins producedby saccharifying a-amylase from, starch. J Biochem 1975;78(5): 897-903.

CAPÍ TULO

Prueba de ureasa

I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos moléculas de amoníaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 44 y 45.) A. Desde un principio, esta actividad enzimática fue característica de todas las especies de Proteus y se la utilizó sobre todo para diferenciar los microorganismos Proteus rápidamente ureasa positivos de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae; los otros géneros pueden dar una reacción positiva tardía. 1. Proteus (por lo común + y rápida) P. inconstans: ureasa P. mirabilis: ureasa + P. myxofaciens: ureasa + P. penneri: ureasa + P. rettgeri: urraca + P. vulgaris: ureasa + 2. Providencia (V, variable; por lo común - ) P heimbachae: ureasa P. siuartiv. ureasa V P. rustigianii: ureasa 3. Morganella morganii de los biogmpos 1 y 2: ureasa + débil B. Ayudar a la diferenciación de especies 1. Actinobacillus seminis (-) de otras especies de Actinobacillus (+) aisladas con más frecuencia. 2. Bartonella fe lis (+) de otras especies de Bartonella (-) aisladas con frecuencia 3. Bordetella avium (-) de B. bronchiseptica (+), B. parapertussis y B. pertussis (+). 4. Pasteurella aerogenes (+), P. dagmatis (+), P. lymphangitidis (+), P. mairii (+) y P. pneum otm pica (+) de otras especies de Pasteurella 5. Ureasa de Christensen a. Enterobacter dissolvens (+), E. gergoviae (+), E. hortnaechae (V, por lo común +), E. cloacae (V) y E. absuriae (V, por lo común +) de otras especies de Enterobacter (-). b. Klebsiella ornithinolytica (+), K. oxytoca (+), K. planticola (+) y K. pneumoniae subesp. p neu moniae (+) de otras especies de Klebsiella (-). 6. Oligella ureolytica (+) de O. urethralis (—). 7. Weeksella zoohelcum (+) de W. virosa (-). 8. Cepas T de M ycoplasma urealyticum (+); los micoplasmas T son los únicos micoplasmas conoci dos que contienen ureasa (véase Sección VIII A). 9. Peptostreptococcus tetradius (+), P. lactolyticus y P prevotii (V, por lo común - ) de otras especies de Peptostreptococcus- aisladas con frecuencia.

398

Pruebas bioquímicas individuales

10. Dentro del grupo viridans, Streptococcus vestibularis (+) y S. salivarius (V, por lo común +) de otros Streptococcus viridans (-). 11. Especies humanas de Haemophilus, H. influenzae de los biotipos I, II, III, IV (+), H. influenzae del biogrupo aegyptius (+), H. parainfluenzae de los biotipos II, III, IV, VII (+), H. haemolyticus (+), H. paracuniculus (+), H. parahaemolyticus (+) y H. paraphrophaemolyticus (+) de otras especies de Haemophilus (-). C. Ayudar a la identificación de 1. Vibrio parahaemolyticus ureasa variable, por lo común + (25). 2. Helicobacter cinaedi rápidamente ureasa + (20, 24, 32). 3. Especies de M ycobacterium (V); (véase Sección VIII.B). 4. Especies de Cryptococcus (levaduras) (+, 1-2 días) (35).

III.

BIOQUÍMICA

_________________________________

El sustrato urea, una diamida del ácido carbónico, a menudo se designa como una carbamida (8, 29). To das las amidas ° son hidrolizadas con facilidad (30). La urea es hidrolizada por una enzima (RC-NH2)

específica, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoníaco. En solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final (8, 29). H->N £ = 0

co2 +

+ 2 HOH

H,N

h 2o

Dióxido de carbono

Urea

+ 2 NH3

(NH4)2C0 3

Amoníaco

Carbonato de amonio

La ureasa es una importante enzima microbiana relacionada con la descomposición de los compues tos orgánicos (21). Las enzimas bacterianas se clasifican como constitutivas o adaptativas. U na enzima adaptativa o inducida se produce sólo cuando su sustrato específico está presente (7). La ureasa es consi derada constitutiva debido a que es sintetizada por ciertas bacterias sin tomar en consideración la presen cia o la ausencia de su sustrato, la urea (7, 46). Existen dos amplias divisiones de enzimas: a) hidrolasas, que están relacionadas con la hidrólisis (agre gado de agua) de ásteres, hidratos de carbono, proteínas y amidas, y b) aquellas relacionadas con diver sas reacciones de oxidación-reducción (17). La ureasa se clasifica como una amidasa, ya que cataliza la hidrólisis de las amidas (8). Oppenheimer (31) incluyó entre las amidasas a todas las enzimas que pue den romper los puentes entre el nitrógeno y el carbono por hidrólisis.

h 2n

nh2

Ureasa (una amidasa)

En el caso de la ureasa, el nitrógeno es disociado como amoníaco (NH3) (31). La ureasa (27,44) actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen puentes peptídicos (27). El pH óptimo para la actividad de la ureasa es de 7 (22).

IV.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS

_________________________

A. C aldo con u re a de R ustigian y S tu art, pH 6,8 (1, 13, 15, 40) 1. Ingredientes F o sfato m o n opotásico, K H 2P 0 4 F o sfato disódico, N a 2H P 0 4 (buffer de S orensen) E x tracto de levadura U rea, de alta pureza, 20% R o jo fen o l A g u a d esio n izad a

9,1 g 9,5 g 0,1 g 20 g 0,01 g 1.000 m L

Prueba de ureasa 399 2. Indicador de pH: rojo fenol a. Acido: color amarillo, pH 6,8. b. Alcalino: color rosado rojo, pH 8,4. c. M edio no inoculado: pH 6,8, color amarillo-naranja. 3. Productos comerciales disponibles: BBL, “urease test broth” (caldo para la prueba de ureasa) (1); Difeo, “urea broth” (caldo con urea) (13). 4. Método de preparación a. Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo. b. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. c. No calentar la solución; con el calor, la urea se descompone. 5. Método recomendado de esterilización a. Filtración (1) Filtros de membrana Millipore. (2) Membranas: 0,45 |_im de diámetro de poro. b. De manera aséptica, fraccionar alrededor de 3 mL (8) por tubo estéril (13 x 100 mm) c. Si el medio se prepara e inocula de inm ediato, pueden obtenerse resultados confiables sin fil tración (1). d. El medio basal puede ser rehidratado en 900 mL de agua destilada o desmineralizada y esterili zado en autoclave a 121°C, 15 Ib, durante 15 min. Cuando se enfria, agregar 100 mL de una so lución al 20% de urea estéril (filtrada) y el caldo se fracciona en tubos (3 mL por tubo estéril de 13 x 100 mm) (15). 6. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C). 7. Inoculación a. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h, agar con hierro de Kligler (KIA) u otro cultivo apropiado. b. Inoculo denso: 3 ansadas (ansa de 2 mm) (1, 15, 40). c. A gitar el tubo con suavidad para suspender las bacterias (40). 8. Incubación a. Estufa o baño de agua a 35°C (15, 40). b. Observar las reacciones después de 8 ,1 2 ,2 4 y 48 h de incubación. c. Las modificaciones en la temperatura cambia la velocidad de producción de la ureasa (40). El caldo con urea de Rustigian y Stuart es un medio altamente tamponado en el que la detección de la uti lización de la urea después de 48 h o menos de incubación estaba restringida en un principio a la produc ción de ureasa sólo por las especies de Proteus (40). En la actualidad el medio brinda resultados positi vos para la mayor parte de Proteus, Morganella y unas pocas cepas de Providencia stuartii (5). Otros microorganismos, en particular las especies de Enterobacter pueden atacar la urea de manera lenta y dé bil, pero la actividad de la ureasa en el caldo de Rustigian y Stuart no se detecta dentro de las 48 h de in cubación (40). El extracto de levadura incorporado en el medio proporciona los factores de crecimiento requeridos por los géneros fuertemente ureasa positivos (incluidos con anterioridad en un único género, Proteus')-, es tos microorganismos pueden utilizar el nitrógeno de la urea, si bien otros microorganismos productores de ureasa requieren una fuente de nitrógeno adicional (12). El indicador de iones hidrógeno rojo fenol muestra la producción de ureasa por los miembros de la subfamilia Proteeae mediante la demostración disminuida de la concentración de iones hidrógeno a cau sa de la formación de dos moléculas de amoníaco (NH3).

B. Agar con urea de Christensen, pH 6,8 (1, 10,13,15) 1. Ingredientes Peptona Cloruro de sodio, NaCl Fosfato monopotásico, KH2P04 Glucosa (dextrosa), 0,1% Urea, 20%, máxima pureza Rojo fenol Agar Agua desionizada

1g 5g 2g 1g 20 g 0,012 g 15 -20 g 1.000 mL

400

Pruebas bioquímicas individuales

2. Indicador de pH: rojo fenol a. Acido: color amarillo, pH 6,8. b. Alcalino: color rosado rojo, pH 8,4. c. Medio no inoculado: pH 6,8, color amarillo a color piel. 3. Productos comerciales disponibles a. BBL y Difeo, Urea agar base (1, 13). b. BBL: urea agar base (1). 4. Método de preparación y esterilización (1,13) a. Base de urea deshidratada (29%) (1) Pesar con precisión 29 g de la base deshidratada y disolver en 100 mL de agua destilada o desmineralizada. (2) No calentar la solución. La urea se descompone cuando se la expone al calor. (3) Esterilizar por filtros de membrana Millipore, 0,45 |xm de diámetro de poro. b. Agar (1) Disolver 15 g de agar en 900 mL de agua destilada o desmineralizada. (2) Autoclave: 121°C, 15 Ib, 15 min. (3) Enfriar a 50°C. c. Agregar 100 mL de urea base estéril de manera aséptica a 900 mL de la mezcla de agar y agua; la concentración final de la urea es de 10%. d. Fraccionar el medio de manera aséptica en tubos estériles, alrededor de 4 -5 mL por tubo de 13 x 100 mm (pico de flauta extenso, fondo corto) (1, 13, 15). e. Este medio puede utilizarse en la forma líquida si se desea (15). 5. Permitir que el medio se enfríe en posición inclinada. 6. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4- 10°C). 7. Inoculación a. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h, agar con hierro de Kligler (KIA) u otro cultivo apropiado. b. Inóculo denso (5, 10, 15); estriar toda la superficie del pico de flauta. c . No punzar el fondo; sirve como control del color (1). d. En el caso de especies de Brucella mantener a temperatura ambiente (22-25°C) 2 h, luego in cubar con 2-10% de C 0 2 (4). 8. Incubación: 35°C, 6 y 24 h y todos los días sucesivos durante 6 días (11). Pueden ser necesarios períodos más prolongados. El agar con urea de Christensen se utiliza para detectar la actividad de ureasa por todos los microorga nismos Proteus rápidamente ureasa positivos. Este medio también detecta la actividad de ureasa en las es pecies de Enterobacter y en otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (10) que exhiben una reacción de ureasa tardía. Las especies de Enterobacter pueden utilizar la urea como única fuente de nitrógeno (43); estos microorganismos pueden perder esta capacidad, pero pueden retener o volver a obtener su capacidad para hidrolizar la urea (10). El medio de Christensen elimina la necesidad del microorganismo de utilizar los derivados de la urea (amoníaco) como su única fuente de nitrógeno y también exhiben actividad de urea sa en microorganismos con requerimientos de nitrógeno más complejos (10). El medio con urea de Rustigian y Stuart (34) posee tan pocos nutrientes que si un microorganismo no puede utilizar el amoníaco, debe basarse en el extracto de levadura en el medio para obtener sus fuentes de nitrógeno y carbono. El medio de Ciiristensen elimina la necesidad de que un microorganismo utilice el amoníaco como su única fuente de nitrógeno (10) y permite la detección de la hidrólisis de la urea por otros miembros de la familia Enterobacteriaceae cuya actividad de ureasa es leve y tardía (10). Esto se cumple por a) el agre gado de glucosa al medio, b) la disminución de la concentración de peptona y c) por la disminución del sistema buffer; el medio con menos buffer detecta una cantidad más pequeña de álcali (16). Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae por definición fermentan la glucosa y la acidez producida ac túa contra la alcalinidad generada por la descomposición de la peptona; en consecuencia, la glucosa cons tituye una fuente de energía, dejando la peptona intacta (10). El agregado de glucosa elimina los posibles resultados falsos negativos y estimula la actividad de ureasa en los microorganismos que hidrolizan la urea en forma lenta (10). La energía proporcionada por la fermentación de la glucosa estimula la ureasa incrementando la velocidad del metabolismo y la reproducción celular (10). El agregado de la glucosa no incrementa de manera apreciable la actividad de ureasa en las especies de Proteus, lo que sugiere que su ureasa es constitutiva (10).

P ru e b a d e u re a s a

401

En el medio de Christensen la velocidad de la hidrólisis de la urea diferencia los microorganismos de la subfamilia Proteeae que producen ureasa rápidam ente (especies de Proteus, M. morganii y algunos P. stuartii) de otros microorganismos ureasa positivos. Los microorganismos Proteeae positivos exhiben una reacción positiva en el pico de flauta dentro de 1-6 h de incubación (10), con el color característico ro jo-violeta (rosado rojo) que se extiende en todo el medio al término de las 6 h de incubación. No es raro que estos microorganismos Proteeae exhiban un resultado positivo después de sólo 30 min de incubación; su ac tividad de ureasa es así de rápida en el medio de Ch ristensen. La magnitud y la velocidad de penetración del color en el medio es una medida de la actividad de ureasa del microorganismo (10). Todos los Proteeae urea sa positivos dan una reacción 4+ después de 24 h de incubación. La velocidad de la hidrólisis de la urea no difiere entre los microorganismos Proteeae positivos en el medio de Christensen (10). Los microorganismos ureasa positivo tardíos como las especies de Klebsiella o de Enterobacter va rían en su velocidad de hidrólisis de la urea. Algunos van de una reacción positiva 1+ después de 6 h de incubación a una reacción 4+ después de 3-5 días de incubación, mientras que otros exhiben sólo una reacción 1+ después de 6 días (10). C.

Caldo con urea R (rápida) (14) 1. Ingredientes; pH 6,9 Extracto de levadura Urea Fosfato monopotásico, KH2P04 Fosfato disódico, Na2HP04 Rojo fenol Agua desionizada

0,1 g 20 g 0,091 g 0,095 g 0,01 g 1.000 mL

El fosfato monopotásico y el fosfato disódico tienen baja capacidad buffer. 2. Esterilización: filtración (Millipore); 0,45 pm de diámetro de poro. 3. Fraccionar: 3 mL por tubo de borosilicato con tapa a rosca estéril (13 x 100 mm). 4. Conservación: refrigerador, 2-8°C; vencimiento máximo, 48 h; se recomienda utilizar el mismo día de su preparación (14). 5. Inoculo: 3 ansadas (ansa de 2 mm) (1, 15,40). 6. Incubación: en aerobiosis, 35°C, baño de agua; observar a los 10 min, a 1 h y a 2 h.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

A. Positivo (+); rápido e intenso Proteus mirabilis Proteus vulgaris

ATCC 29906 ATCC 13315

B. Positivo (+); débil Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae

ATCC 13883

C. Negativo (—) Escherichia coli No inoculado

VI.

RESULTADOS

Vil. INTERPRETACIÓN A.

Caldo con urea de Stuart 1. Positivo (+) a. Color rosa-rojo intenso en todo el caldo b. Ciertas especies de Proteeae:

ATCC 11775

402

Pruebas bioquímicas individuales

P. mirabilis P. myxofaciens P. penneri P. rettgeri (ahora Providencia rettgeri) P. vulgaris M. morganii de los biogrupos 1 y 2 Pocas cepas de P. stuartii 2. Negativo (-): sin cambios de color (amarillo-naranja).

B. Agar con urea de Christensen 1. Positivo (+): color rosa-rojo (rojo-violeta) intenso en el pico de flauta. El color puede penetrar en el interior del agar; la extensión del color indica la velocidad de la hidrólisis de la urea (2). a. Grado de hidrólisis (1) 4+; todo el tubo rosa-rojo. (2) 2+ pico de flauta rosa, fondo sin cambios. (3) + débil; la parte superior del pico de flauta rosa, el resto sin cambios. b. Positivo rápido: 1-6 h para todos los microorganismos Proteeae positivos. c. Positivo tardío: 24 h a 6 días de incubación o más Algunas cepas de Klebsiella Algunas cepas de Enterobacter Algunas cepas de Citrobacter Bacterias distintas de las pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae 2. Negativo (-): sin cambios de color (color piel a amarillo pálido). C. Caldo con urea R: positivo (+), color cereza (púrpura roji*zo).

VIII. MEDIOS DE PRUEBA ALTERNATIVOS A.

Caldo U-9 (medio para la prueba de ureasa con color) 1. Formulación de Shepard y Lunceford (36). 2. Objetivo: aislamiento selectivo de micoplasmas de la cepa T a partir de muestras clínicas; ayudar en la identificación de Ureaplasma urealyticum (37) en cultivos; el único micoplasma que contie ne ureasa. 3. Ingredientes a. Soluciones stock (1) Solución de urea, 10% (a) De máxima pureza; 3 g/30 mL de agua destilada. (b) Fraccionar 0,7 mL por tubo con tapa a rosca (13 x 100 mm). (2) Solución de rojo fenol: 1 %, 100 mg de fenolsulfonftaleína sódica/10 mL de agua destilada. (3) Penicilina G potásica (a) 0,63 g/10 mL de agua destilada estéril. (b) Concentración final: 100.000 unidades/mL.

b. Base Caldo con tripticasa y soja (TSB) o caldo de digerido tríptico Cloruro de sodio, NaCl Fosfato monopotásico, KH2P04 Agua desionizada

0,75 g 0,5 g 0,02 g 100 mL

c. Medio completo; pH 5 Base U-9, estéril, enfriada a 45-50°C Suero de caballo, sin calentar (normal), 4%, estéril Solución de urea, 10%, estéril Solución de rojo fenol, 1%, estéril Penicilina G, estéril

95 mL 5 mL 0,5 mL 0,1 mL 1 mL

Modificaciones con aditivos a. Caldo U-9 con anfotericina (38) (1) Objetivo: aislamiento de ureaplasmas a partir de muestras del tracto genitourinario femeni no; suprimir el crecimiento de especies de Candida y hongos filamentosos.

Prueba de ureasa 403 (2) Al caldo U-9 estéril, agregar de m a n era aséptica 2,5 jig/mL de anfotericina estéril (Fun gizone). b. C aldo U-9B (38) (1) Agregado de suplemento de crecimiento. (2) Para el medio U-9 completo, agregar 0,5 mL de una solución stock de L-cisteína-HCl al 2% an tes de la esterilización. c. C aldo U-9C; ingredientes Caldo con tnpticasa y soja (TSB) Extracto de levadura Cloruro de magnesio MgCl2 • 6H20 Agua desionizada

1,5 g 0,1 g 0,2 g 90 mL

Ajustar el pH a 5,5 con H C12 N Cl2. D espués de la esterilización, agregar: Suero de caballo, sin calentar (normal), estéril Urea, 10%, estéril L-Cisteína • HC1 • H20 , estéril Tripéptido GHL, 20 pg/mL, estéril Solución de rojo fenol, 1%, estéril Solución de Penicilina G, 100.000 unidades/mL, estéril

10 mL 0,3mL 0,5mL 0,1mL 0,1mL 1 mL

(Nota: el tripéptido GHL es acetato de glicil-L-histidil-L-lisina; Calbiochem-Novabiochem; véase Apén dice 11.) 5. Esterilización a. Filtración (Millipore), 0,22 pm de diámetro de poro: solución de urea, L-cisteína, péptido GHL, suero de caballo y agentes antimicrobianos. b. Autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min: base y solución de rojo fenol. 6. Fraccionar a. Tubos con tapa a rosca: 1,8 mL/tubo (13 x 100 mm). b. Frascos ampolla: 1,8 mL/frasco am polla (Wheaton). 7. Conservación a. Base: refrigerador, 2-8°C. b. Congelado (1) Soluciones stock, suero de caballo, L-cisteína y tripéptido GHL: -20°C. (2) Extracto de muestra original: -70°C. (3) Vencimiento de los medios completos: aproximadamente al mes. 8. Inoculación a. Muestras extraídas en 1,8 m L de caldo U-9 (extracto original). Conservar (congelado, -70°C) para posibles subcultivos. b. Se realiza una dilución de 1(H del extracto original por la transferencia de 0,2 m L al frasco am polla que contiene 1,8 mL de caldo U-9 (o U9-B o C) (37). 9. Incubación a. Tanto de los frascos ampolla originales como de los frascos ampolla con la dilución. b. En aerobiosis, 35°C, 18-24 h. c. Observar durante todo el período de incubación para determinar el primer cambio en el indica dor de pH. Continuar la incubación durante 7 días con observaciones diarias antes de informar una prueba de ureasa negativa. 10. Microorganismos utilizados para el control de calidad a. Positivo (+) Ureaplasma wealyticum

ATCC 27618

b. Negativo (-) Mycoplasma pneumoniae Staphylococcus aureus subesp. aureus No inoculado 11.

Interpretación (véase también cuadro 39-1) a. Positivo (+)

ATCC 15531 ATCC 12600

404

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 39-1.

A c tiv id a d d e u re a s a : p H d ie m p o

p H de la re a cció n

6 ,9-7,2

P e río do d e in cu b a ció n (h)

7,2-8 9,2-9,4a

8 24

aTodos los microorganismos Proteeae son ureasa positivos.

(1) El color rosa-rojo oscuro permanece en el fondo del tubo y difunde a todo el medio cuan do se continúa la incubación. (2) Hidrólisis de la urea y acumulación de amoníaco (NH3). (3) pH alcalino. (4) Ausencia de turbidez (nubosidad) evidente en el medio líquido. b. Negativo (-) (1) Sin cambios de color; el medio permanece de color paji*zo. (2) Ausencia de hidrólisis de la urea. B. Caldo con urea para micobacterias (39) 1. Ingredientes Peptona Glucosa (dextrosa) Cloruro de sodio, NaCl Fosfato potásico, monobásico, K2HP04 Urea Rojo fenol, sódico, 1 % Tween 80 Agua desionizada

1g 1g 5g 0,4 g 20 g 1 mL 1,1 mL 100 mL

2. Inoculo a. Cultivo joven, en fase de crecimiento activo en medio de Lowenstein-Jensen. b. Turbidez moderada. 3. Incubación: 35°C, sin C 0 2; interpretar después de 1-7 días. 4. Microorganismos para el control de calidad a. Positivo (+): M ycobacterium fortuitum ATCC 35931 b. Negativo (-): No inoculado. 5. Interpretación; cambio del amarillo brillante al 1+: 2+: 3+: 4+ :

ro sa ro sa rojo ro jo

claro; negativo oscuro; positivo claro; positivo oscuro; positivo

C. Ayudar a la diferenciación de especies de Mycobacterium-. M. scrofulaceum (+) de cepas pigmen tadas del complejo M. intracellulare-avium (-); grupo I de Runyon (M . tuberculosis, M. bovis, M. kansasii y M. marinum) por lo común +; otros grupos dan reacciones variables a negativas (23). 1. Medios de prueba; tres opciones a. Prueba de ureasa en discos (28) (1) Discos de urea (Difeo) impregnados con caldo para urea R de Ewing (15) agregado a 0,5 mL de agua destilada estéril en tubos con tapa a rosca (13 x 100 mm). (2) Con algunas marcas comerciales de tubos descartables se observan cambios de color ines pecíficos en el medio no inoculado; el problema se elimina con tubos de usos múltiples (28). b. Para cada medio en tubos fraccionar alícuotas de 3 mL en tubos de borosilicato con tapa a ros ca estéril (13 xlOO mm). (1) Medio de Toda, Hagihara y Takeya (42) (a) Sistema de buffer fosfato, 0,01 M, pH 6,7. (b) Esterilizar en autoclave y mientras aún está caliente agregar 3 g de urea y 1 mL de in dicador de pH rojo fenol al 0,1% por cada 100 mL de buffer. (2) Medio de Wayne y Doubek (45): agar base con urea de Christensen (Difeo) sin agar, dilui do 1:10 en agua destilada estéril. 2. Para los tres procedimientos (28) a. Inoculo denso (emulsión) proveniente de un cultivo de 21 días en medio con base de huevo. b. Incubación: 35°C; observar los resultados en 1 h y luego con intervalos de 24 h hasta las 72 h.

P ru e b a d e u re a s a

405

Positivo: color cereza (púrpura roji*zo)

Medio con urea tamponado, exento de azida 1. Detección rápida de la ureasa de Helicobacter (Campylobacter) pylori (19) 2. Ingredientes; pH 6,3-6,5 Urea Solución acuosa de rojo fenol, 0,4%, (p/vol) Fosfato de sodio, NaH2P 04, 10 mmol, pH 6,3 Agar Oxoid N° 4 Agua desionizada

2g 2,5 mL 0,14 g 0,4 g 100 mL

3. Fraccionar: 200 pL/orificio en placas de microtitulación de Linborough de fondo plano con 96 ori ficios; vencimiento refrigeradas (2-8°C) a los 10 días. 4. Inoculación: 5 (4 L (denso) por punción en los orificios con pipeta de siembra múltiple. 5. Incubación a. Temperatura ambiente (22-25°C). b. Evitar la exposición a la luz; colocar en un armario. Si se expone a la luz, el cultivo puede de sarrollar peróxido, el cual puede interferir con la reacción de ureasa. 6. Interpretación a. Observar el cambio de color después de 5 y 30 min y en los siguientes tiempos: 1,2, 3 ,1 2 y 18 h. b. H. pylori m uestra una reacción roja oscura, inmediata y persistente. E.

Medio no selectivo (NSM) 1. Objetivo: prueba de selección rápida para el aislamiento y la detección de ureasa por H. pylori (9); puede utilizarse para las biopsias del antro gástrico. 2. Ingredientes; pH 6,8 Agar base Columbia IsoVitaleX, 2% Hemina Urea Rojo fenol Agar granulado Agua desionizada 3.

39 g 20mL 10mg 20 g 1,2 mg 4g 980mL

Medio selectivo (SM): aditivos antimicrobianos opcionales; elimina la flora contaminante Trimetoprima Vancomicina Anfotericina B Cefsulodina

5 mg 10 mg 5 mg 5 mg

4. Esterilización a. Urea y rojo fenol: filtración (Millipore); 0,22 pm de diámetro de poro. b. Agar Columbia: autoclave, 121°C , 15 Ib, 15 min; enfriar y agregar la urea, el rojo fenol y los antibióticos. 5. Fraccionamiento: 15-20 mL/placa (15 x 100 mm). 6. Inoculación: muestras de biopsia mantenidas en 0,4 mL de caldo para brucellas; hom*ogeneizadas y vertidas en las placas d en tro de las 2 h. 7. Incubación: 35°C, en atmósfera de microaerofilia (jarra Campy Pak). 8. Microorganismos para el control de calidad a. Positivo (+): Helicobacter pylori, ATCC 11637, NCTC 11637; cambio de color en el curso de 1 h. b. Negativo (-) Proteus vulgaris ATCC 13315; cambio de color en 24 h Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; cambio de color en 48 h Campylobacter jejuni ATCC 32292; sin cambio de color 9. Interpretación a. Controlar para determinar el cambio de color a los 5 y 30 min y a 1, 2, 3, 6, 24, 36 y 48 h. b. Positivo (+) (1) Color amarillo a rojo. (2) Crecimiento bacteriano visible después de 3 días. c. Negativo: sin cambio de color.

406

Pruebas bioquímicas individuales

H. pylori da una reacción inmediata en el curso de 1 h y el medio se toma completamenn- rojo a las 3 h. H. p y lori posee una ureasa altamente activa, de peso molecular alto y produce una abundante cantidad de ureasa cuando se lo cultiva en medio sólido (20, 24, 32).

Solución salina balanceada (27) 1. Objetivo: biotipificacióm de especies de Haemophilus humanas (26). 2. Ingredientes; pH 7

3. 4.

5. 6. 7.

Fosfato monopotásico, KH2P04 0,1% Fosfato potásico, dibásico, KH2P 04 0,1% Cloruro de sodio, NaCl 0,5% Rojo fenol, 2% 0,5 mL Volumen total, 100 mL Esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min y agregar 10 mL de solución acuosa de urea estéril (filtro Millipore). Fraccionamiento: pequeñas cantidades en tubos estériles (13 x 100 mm). Inoculo: suspensión densa Incubación: 35°C, 4 h. Resultados a. Positivo (+): rojo color Haemophilus influenzae de los biotipos I, II, III, IV y del biotipo aegyptius Haemophilus paminfuenzae de los biotipos II, III, IV, VII Haemophilus haemolyticus Haemophilus parahaemolyticus Haemophilus paraphrophaemolyticus

IX. PRUEBAS RÁPIDAS A. Key Urease Test Tablets (prueba de ureasa con comprimidos Key) 1. Fabricante: Key Scientific Products. 2. Formula de Christensen. 3. Resultados en el curso de 6-12 h de incubación. 4. Procedimiento: seguir las directivas del fabricante.

B. Discos de urea 1. Fabricantes a. BBL, urease (UR) M initek disks (discos para ureasa (UR) Minitek); junto con la coloración de Gram y la prueba de oxidasa, pueden ser usados para la rápida confirmación de H. pylori (41). b. Difeo, urea disks (discos de urea). 2. Resultados dentro de 1-4 h de incubación. C. Urea-phenylalanine disks (PDA disks) (discos de urea-fenilalanina) 1. Fabricante: REMEL. 2. Procedimiento: seguir las directivas del fabricante. 3. Véanse figuras 39-3 y 39-4 (Apéndice 1). 4. Inoculo denso proveniente de un cultivo de 18 a 24 h en agar pico de flauta 5. Incubación: 37°C en baño de agua; observar a los 10 min y a 1 y 2 h. 6. Positivo: color cereza (púrpura roji*zo). D. C L O Striptest (prueba con tira reactiva CLO) 1. Fabricante: Delta West Ltd., Australia Occidental, Australia. 2. Ureasa rápida para H. pylori (3, 11). 3. Seguir las directivas del fabricante. 4. Leer después de los 15 min y a 1,3 y 20 h.

PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS

A. Contador de centelleo líquido; técnica radiométrica acumulativa de Buddemeyer (6). B. Pruebas no invasivas de la urea en la respiración con [13C] y [14C] (23)

1. 14C a. Fabricante: Pytest, Ballard M edical Products, Draper, Utah.

Prueba de ureasa 407 b. Utiliza 14C para m edir el bicarbonato eliminado por II. pylori productores de urea. 2. 13C a. Fabricante: M eretel UBT, Nashville, TN. b. Prueba de la urea en la respiración; [13C]urea contenida en la prinactina, una solución clara in colora C. Detección de H. pylori mediante el empleo de [15N]urea como trazador; determina la excreción de NH4.

XI.

PRECAUCIONES

A. Generales 1. Todos los medios de prueba con urea, tanto el caldo como el agar en pico de flauta, se basan en la demostración de la alcalinidad; en consecuencia, no son específicos para ureasa. El empleo de peptonas, en especial en el agar en pico de flauta (p. ej., P. aeruginosa), u otras proteínas en el m e dio puede variar el pH a la alcalinidad debido a la hidrólisis de la proteína y a la liberación de un exceso de residuos de aminoácidos y brindar resultados falsos positivos. Para eliminar la posible hidrólisis de las proteínas, realizar un control utilizando el mismo medio de prueba sin urea (2). 2. La sensibilidad de la prueba de ureasa puede corregirse con sustancias buffer. El caldo de Stuart está fuertemente tamponado, 10 veces más que el agar en pico de flauta de Christensen y por lo común sólo los microorganismos Proteeae ureasa positivos hidrolizan la urea en el caldo de Stuart para producir alcalinidad debido a que la cantidad excesiva de NH3 originado no puede ser neutra lizado por el buffer (2). 3. No calentar o recalentar la urea base en solución; la urea se descompone por el calentamiento. 4. Los medios de urea expuestos a la luz pueden desarrollar peróxido, el que podría interferir con la reacción de la ureasa (12). 5. Se sabe que la urea puede sufrir autohidrólisis; en consecuencia, es aconsejable conservar los m e dios en el refrigerador a 4-8°C. Los cambios de color pueden tardar algo más cuando el medio es refrigerado (12). 6. Los medios sin el agregado de buffer son menos específicos (13, 15, 16).

B. Caldo con urea de Stuart 1. El fuerte sistema buffer enmascara la actividad de ureasa en los microorganismos que son positi vos en forma tardía; este medio está ideado sólo para la detección de la actividad de ureasa en to das las especies de Proteus, M. morganii, P. rettgeri y en los microorganismos P. stuartii ureasa positivos (10). 2. M. morganii hidroliza la urea con lentitud (10) y después de 24 h de incubación la reacción sólo puede mostrar un apagado color rosa. Si se duda acerca del resultado, comparar con un tubo de medio no inoculado o reincubar durante un adicional de 24 h. M. morganii por lo común requiere cerca de 36 h de incubación para desarrollar una fuerte reacción de ureasa positiva (40). En los miembros de la subfamilia Proteeae ocurre un resultado ureasa positivo intenso cuando el pH al canza 8,1 o más (40). Existen variaciones en la reacción de pH de acuerdo con el período de incu bación y con los microorganismos los Proteeae ureasa positiva que se están probando (cuadro 391). P. vulgaris y P. mirabilis dan una reacción de ureasa positivos (pH 8,1) después de alrededor de 8 h de incubación. P. rettgeri ataca la urea rápidamente, lo que brinda un resultado positivo en cerca de 12 h. M. morganii requiere alrededor de 36 h de incubación para desarrollar una intensa reacción de ureasa positiva (40). 3. El pH de las reacciones positivas puede variar debido a las diferencias en el tamaño del inoculo utilizado o a diferencias en las velocidades de actividad de la ureasa de las diversas cepas de Pro teeae positivas (34). Si se incrementa el inoculo de la suspensión de bacterias Proteeae en solución fisiológica de 0,01 a 0,1 mL, disminuye el tiempo requerido para alcanzar el pH 8,1; sin embar go, un inoculo más denso no produce una aceleración posterior (40). El inoculo estándar aceptado de 0,1 da un resultado positivo alrededor de 3 h antes que el inoculo de 0,01 mL (40). 4. La cantidad de sustrato utilizado, la temperatura de incubación o ambos factores pueden alterar la velocidad de la producción de ureasa por los microorganismos Proteeae ureasa positivos (40). Stuart y col. utilizaron un inoculo constante y variaron la cantidad de medio por tubo de 1,5 a 3 a 4,5 y 6 mL y encontraron que el tiempo necesario para desarrollar un resultado positivo aumentaba con el volumen. La cantidad mínima aceptable de medio por tubo para una lectura precisa es de 1,5 mL (40).

408

Pruebas bioquímicas individuales

5. Pueden ocurrir resultados falsos negativos si la cantidad de NH 3 formado es demasiado baja para cambiar la concentración de ion hidrógeno del alto sistema buffer a un pH alcalino que causaría que el indicador rojo fenol cambiara de color (46). 6. Ambos caldos base, preparados o deshidratados, deben ser refrigerados; si el sello se rompe, es preferible conservar el frasco con una sustancia desecante en un recipiente sellado. 7. Si los nutrientes proporcionados por el extracto de levadura disminuyen antes de que el microor ganismo muestre un desarrollo notable, su capacidad de hidrolizar la urea no puede determinarse con precisión (10). 8. Si un microorganismo puede hidrolizar la urea pero no puede utilizar el amoníaco (NH3) como fuente de nitrógeno, no se produce el desarrollo y puede aparecer un resultado falso negativo (10). C. Agar con urea de Christensen 1. Los miembros de la subfamilia Proteeae ureasa positivos producen la alcalinización del medio de Christensen (rosado rojo) enseguida después de la inoculación. Para que los resultados sean váli dos para la detección de Proteeae, deben ser leídos dentro de las primeras 2-6 h de incubación. Citrobacter freundii y K. pneum oniae subesp. pneumoniae pueden convertir el agar con urea de Christensen dentro de las 24-48 h. Este medio detecta la actividad de ureasa rápida sólo de los miembros de Proteeae ureasa positivos. 2. El medio con urea de Christensen no se em plea para determinar la velocidad absoluta de la acti vidad de ureasa (10). Muchos microorganismos ureasa positivos, distintos de los integrantes de Proteeae, pueden hidrolizar la urea dentro de las 24 h y luego lentamente producir una ruptura adicional de la urea. Esto se evidencia por el color alcalino penetrante en todo el m edio^fondo y pico de flauta. La degradación posterior de la urea puede deberse a la falta de tolerancia de algu nos microorganismos a la creciente alcalinidad, la que con posterioridad disminuye la actividad de la ureasa (10). D. El caldo con urea R debe ser preparado en el día de uso ya que el buffer no mantiene el pH deseado por más de 48 h. E. Medios U-9 1. La preparación del medio basal, la conversión al medio U-9 completo y el fraccionamiento siem pre deben realizarse en el mismo día (37). 2. Recordar: el crecimiento y la actividad de ureasa por los ureaplasmas en el caldo U-9 ocurre sin turbidez (nubosidad) detectable en cualquier momento (37). 3. En raras ocasiones, los ureaplasmas exhiben reacciones ureasa positivas tardías después de 3-5 días de incubación (37). 4. Las especies de Ureaplasma son los únicos miembros de Mycoplasmatales que se sabe que con tienen ureasa; en consecuencia, la reacción de ureasa es específica de ureaplasmas (37). 5. Las formas L de Proteus pueden ser inducidas para hidrolizar la urea en el medio U-9 (37). Se re quiere un inoculo denso y un período de incubación de 48-72 h (37). Sin embargo, si hay presen cia de formas L de Proteus en una m uestra clínica y tienen éxito en penetrar en el medio a través de la barrera de penicilina, ellas se multiplican en la forma bacilar y producen la turbidez eviden te de tipo bacteriano y dan un resultado de ureasa falso positivo para ureaplasmas (37). 6. Los resultados de ureasa falsos positivos pueden ocurrir tam bién si hay presencia de hongos en la m uestra clínica (sobre todo especies de Candida y ciertos hongos filamentosos); sin em bar go, excepto Candida humicola (35), estos m icroorganism os son ureasa negativos. Pueden m ul tiplicarse en presencia de penicilina y liberar subproductos alcalinos a partir del m edio basal so lo que producen reacciones fuertem ente alcalinas y cambios en el medio al color rojo (37). Los resultadosifalsos positivos debidos a Candida son reconocidos por la turbidez evidente, por el sedimento denso y el olor símil levadura o por ambas características (35). Los resultados falsos positivos debidos a hongos filamentosos se evidencian por el desarrollo de bolas típicas vello sas, símil algodón (36). Por lo común, estos hongos pueden ser suprimidos por la incorporación de 2,5 pg/m L del agente antimicótico anfotericina B; sin embargo, algunas cepas de Candida pueden no ser inhibidas (35). 7. Robertson (33) mostró que el rojo fenol en el medio U-9 varía de un color paji*zo a un color rosa pálido a pH 7 y que a pH 8,2 el medio es rosa oscuro. El cambio de color no se evidencia hasta que se alcanza la fase de crecimiento estacionario (33). Los subcultivos deben realizarse cuando ape nas se detecta el cambio de color al rosa-rojo, los subcultivos realizados después del desarrollo completo del color rojo (por lo común a las 9-12 h (33)) por lo general dan un cultivo en agar negativo debido a la alta alcalinidad (pH 8-9) alcanzada en el medio, que resulta letal para las

Prueba de ureasa 409 especies de Ureaplasma (18). Si aparece la inactivación, puede utilizarse para inocular el agar una alícuota descongelada de la muestra congelada del extracto original. 8. Tanto M. hominis como U. urealyticum crecen en el caldo U-9; sin embargo, sólo U. urealyticum cambia el color del medio (33).

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CAPI TULO »

Prueba de Voges-Proskauer I. PRINCIPIO Determinar la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final neutro, acetilmetilcarbinol (AMC, acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa. Voges-Proskauer (VP) es un epónimo doble; Voges y Proskauer (41) fueron los primeros bacteriólogos en observar una coloración ro ja en los medios de cultivo después del tratamiento con hidróxido de potasio.

II. OBJETIVO (Véanse también caps. 43 a 45) A. Ayudar a la diferenciación entre géneros 1. Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae (+) y Enterobacter (por lo común +) de Escherichia coli (-). 2. Staphylococcus (por lo común +) de M icrococcus (-). B. Ayudar a la diferenciación de especies 1. Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae (+), K. oxytoca (+), K. planticola (+) y K. terrigena (+) de K. pneumoniae subesp. ozaenae ( -) y K. pneumoniae subesp. rhino seleromatis (-). 2. Aeromonas hydrophila (+), A. salmonicida subesp. masoucida (+), A. veromi (+) y A. sobria (V, variable; por lo común +) de otras especies de Aeromonas (-) aisladas con más frecuencia. 3. Estreptococos viridans aislados con frecuencia: S. mutans (+), grupo S. milleri (V), S. bovis (+) y S. salivarius (V, variable, por lo común +) de S. sanguis (-) y S. mitis (-^*(29). C. Ayudar a la identificación de 1. Hafnia alvei: 22-25°C (+); 37°C (V). 2. Yersinia enterocolitica: 22-25°C (V, por lo común +), 37°C (-). 3. Listeria monocytogenes (20) a. Reactivos Coblentz (+). b. Reactivo O ’M eara (-). D. A m bos: rojo de metilo (MR+) y Voges-Proskauer (VP+) 1. Todas las especies de Listeria (MR+/VP+). 2. Brochothrix campestris y B. thermosphacta (ambos MR+/VP+).

III.

BIOQUÍMICA

La prueba de Voges-Proskauer (VP) se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro deriva do del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, el principal intermediario en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos; la pro ducción de acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias (1). La prueba de Voges-Proskauer para la acetoína se utiliza sobre todo para separar Escherichia coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter, aunque otros miembros de la familia Enterobacteriaceae pueden pro ducir un resultado positivo de VP. Los m iem bros de la fam ilia E nterobacteriaceae se clasifican de m a nera característica com o ferm entadores de ácidos m ixtos o del ácido fórm ico, lo que indica que sus

412

Pruebas bioquímicas individuales

productos finales de la fermentación de la glucosa son ácidos: ácido fórmico, ácido acético, ácido succínico, etanol, hidrógeno y dióxido de carbono (15, 34). Á c id o lá c tic o Oxalacetato — ► Á c id o SUCCÍniCO

Ácido pirúvico

Ácido fórmico

Acetil CoA

H2 Acido acético Etanol

Los fermentadores de ácidos mixtos con posterioridad pueden ser divididos en dos grupos: a) los que producen ácidos pero no 2,3-butanodiol (o 2,3-butileno glicol), como E. coli (V P -) y b) los que produ cen 2,3-butanodiol como sus principales productos finales, como los grupos Klebsiella-Enterobacter (VP+). El principal producto final de la utilización del piruvato de los grupos Klebsiella-Enterobacter, espe cies de Serraba, especies de Bacillus y muchos otros microorganismos es el 2,3-butanodiol. Sin em bar go, la prueba de Voges Proskauer se basa en la detección de acetoína, un precursor en la producción del 2,3-butanodiol (15, 23, 34). U na molécula de acetoína se forma por la descarboxilación de dos molécu las de ácido pirúvico. Harden y Walpole (23) establecieron que la acetoína es un estadio intermedio en la conversión a 2,3-butanodiol. Tanto la acetoína como el 2,3-butanodiol son productos neutros de la fer mentación de la glucosa (25). 2 Piruvato — *- Acetoína + 2 C 0 2

Harden y Walpole (23) encontraron que cuando fermenta la glucosa, sólo se forma una pequeña can tidad del precursor acetoína; una porción mayor de carbono de la glucosa se utiliza con posterioridad pa ra formar 2,3-butanodiol. Paretsky y Werkman (32) encontraron que se acumula acetoína cuando un m i croorganismo se cultiva en condiciones de aerobiosis. Walpole (42) también encontró que Enterobacter aerogenes acumula más acetoína producida a partir del 2,3-butanodiol cuando el cultivo se expone al oxí geno atmosférico. La acetoína puede ser metabolizada por uno de dos medios: a) reducción a 2,3-butanodiol, el cual se acumula a menos que ocurra una reoxidación o b) raras veces por oxidación a diacetilo, el que puede ser metabolizado aún más (17). Stahly y Werkman (37) encontraron que la formación de acetoína y 2,3-bu tanodiol es un sistema reversible de reducción u oxidación, acetoína a 2,3-butanodiol por reducción del 2,3-butanediol oxidado a acetoína; la exposición al oxígeno atmosférico y a los álcalis revierte con lenti tud la reacción (34). Mientras estudiaban dos microorganismos, E. aerogenes y Staphylococcus aureus subesp. aureus, Strecker y Harary (38) aislaron dos enzimas responsables de la oxidación-reducción de la acetoína y del 2,3-butanodiol.

Prueba de Voges-Proskauer 413

CH3

C = O + lipoato --------lipoat°

deshidrogenasa

COCr

> C = Q

+ C02

Lipoato Acetil-lipoato

Piruvato

ch Oxidación Acetoína deshidrogenasa

C= 0

Enzima piruvato

sC oA

COO'

Acetil CoA

Piruvato

CH3

HO — C — C O O

C = 0 + Lipoato + HSCoA

Lipoato

I C=

p H 6 ,9

E n zim a acetolactato 3

CH3

Diacetil

a-Acetolactato

(acetilmetilcarbinol)

(acetilmetilcarbinol) NADH + H+ Butanodioí deshidrogenasa

I H — C — OH + NAD+

I H — C — OH

I CH3 2,3-B utanodiol (2,3-butileno glicol) (9, 15, 21) o xidació n

2,3-B utan o d io l

2,3-Butanodiol deshidrogenasa

Acetoína

reducción

A cetoína------T

----- —— 7----------- - 2,3-Butanodiol

diacetil (acetoína) reductasa

(2)

414

Pruebas bioquímicas individuales

La formación del 2,3-butanodiol a partir de la fermentación de la glucosa es por lo común del tipo “hi drógeno diol” (25). Glucosa — *- 2,3-Butanodio! + 2 C02 + H2

La producción de 2,3-butanodiol aumenta la producción de dióxido de carbono, lo que da por resultado en la formación de menos ácidos y la acumulación de acetoína (25). El balance entre acetoína y 2,3-butano diol está determinado por la cantidad de hidrógeno disponible (25) o por las diferencias en los potenciales de oxidación-reducción (43). En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, los productos finales neutros acetoína y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilos, el reactante del color producido en la prueba de VogesProskauer (36, 39). En consecuencia, el diacetilo es un producto de oxidación de la acetoína. Juni y Heym (24-26) postularon un camino metabólico cíclico para la degradación del 2,3-butanodiol, la acetoína y el diacetilo por microorganismos capaces de utilizar la acetoína y el 2,3-butanodiol como las únicas fuentes de carbono. Comienza con c h 3— c h o h — c h o h — ch 3

2,3-butanodiol

Acetilbutanodiol

Acetoína

+2H

+2H Reducido

Reducido c h 3—

CO— COH(CH3)—

-2H Oxidado

c o — ch3

Diacetllmetilcarbinol + DPT + h2o

Difosfotiamina (DPT)

ruptura

CH3 — COOH Ácido acético CH3 — CHO — DPT Complejo acetaldehído activo-DPT Ciclo de Ju n i y Heym (26)

(Reproducido de Juni, E. y Heym, G. (1956) J. Bacteriol. 71, p. 427, con autorización de The American Society for Microbiology.)

Empezando con 2 moléculas de 2,3-butanodiol, se regenera 1 molécula de 2,3-butanodiol y se forman 2 moléculas de ácido acético (24-26), que son las responsables de la elevación de la acidez. El pH en el medio de Voges-Proskauer es muy importante; debe evitarse un pH ácido. Por encima de 6,3, se acumulan ácido acético y ácido fórmico con supresión en la producción de C 0 2, H2, acetoína y 2,3-butanodiol. Por debajo del pH 6,3, el ácido acético es convertido a acetoína y 2,3-butanodiol y se su prime la producción de H2 mientras que se incrementa la producción de C 0 2 (15, 21). Los grupos Klebsiella-Enterobacter producen más etanol que E. coli, menos ácidos y dos veces más COz con respecto

Prueba de Voges-Proskauer 415 al H2 (una relación de gases 2:1 ).E . cotí no puede formar acetoína a partir del piruvato en el período de incubación normal y tiene una relación C 0 2:H2 de 1:1 (21). La reacción global del m etabolism o de la glucosa por los grupos Klebsiella-E nterobacter es la si guiente (21): Glucosa — >- 2,3-Butanodlol + 2 C02 + H2

IV.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO: MEDIO DE CLARK Y LUBS MODIFICADO (CALDO MR/VP) (10)________________________________________________ Ingredientes; pH 6,9 P o lip ep to n a o p ep to n a tam ponada D ex tro sa (glucosa) B u ffer fo sfato dipotásico, K 2H P 0 4 A g u a d esio n izad a

7 5 5 1.000

g g g mL

El medio MR/VP comercial es una modificación del medio de Clark y Lubs. Clark y Lubs utilizaron una concentración al 1% de peptona y glucosa, pero una concentración de no menos de 0)5 °/d es el m íni mo satisfactorio, de modo que la concentración de iones de hidrógeno limitante no es alcanzada por los microorganismos rojo de metilo negativos (4). Una concentración de 0,5% de peptona otorga menos co lor al medio, lo que facilita la interpretación de la reacción. B. Productos comerciales disponibles: BBL, Difeo, Merck, Oxoid. C. Método de preparación 1. Pesar la cantidad con precisión como indica el rótulo. Los productos de las diferentes compañías pueden mostrar leves diferencias. 2. Rehidratar con agua desionizada. 3. Calentar la solución con suavidad. 4. Fraccionar alrededor de 5 mL por tubo con tapa a rosca (16 x 125 mm). D. Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 Ib, 15 min. E. Enfriar antes de usar y refrigerar para la conservación (4-10°C). Vencimiento, a las 6-8 semanas. F. Inoculación 1. Desarrollo a partir de un cultivo puro de 18 a 24 h (agar con hierro de Kiigier (KIA)/agar con azú car triple y hierro (TSI)). 2. Inoculo liviano (8); excepto un inoculo denso para el procedimiento de Coblentz (14). G. Incubación 1. Mínimo absoluto: 35°C, 18-24 h. 2. Recomendado (5,9): 30°C, 3-5 días; puede requerir una incubación más prolongada, hasta 10 días (1). Algunas bacterias, en particular H. alvei, son VP variables a 35°C, pero positivas a 25-30°C. Si se sos pecha H. alvei, repetir el cultivo VP e incubar a 22-25°C (13,18). Cowan (13) encontró que la incubación a 30°C durante 5 días es el tiempo mínimo para detectar todos los microorganismos VP positivos entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae con los reactivos VP de Barritt (2) (a-naftol en etanol y KOH al 40%). Sin embargo, para la mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae VP posi tivos, son suficientes 18-24 h de incubación a 35°C.

H. Agregar los reactivos de Voges-Proskauer directamente a una alícuota incubada antes de intentar rea lizar la interpretación.

V. REACTIVOS EMPLEADOS: TRES OPCIONES A. Reactivos VP de Barritt (2) 1. Reactivo A: a-naftol al 5% en alcohol etílico absoluto (etanol). 2. Reactivo B: hidróxido de potasio (KOH) al 40%uiu

B. Reactivos VP de Coblentz (12) 1. Reactivo A: a-naftol al 5 % en etanol al 95 %.

416

Pruebas bioquímicas individuales

2. Reactivo B: creatina al 0,3%*en KOH al 40% . Creatina: A -m etil-V -guanilglicina; NH:C (NH2)N(CH3)CH2COOH. C. Reactivo V P único de O ’Meara (modificado): creatina al 04.%; en KOH al 40ífl (33). D. Método de preparación; para todos los reactivos mencionados antes

1. a-Naftol al 5 %, intensificador del color a. Ingredientes a -N a fto l (1 -n a fto l) E ta n o l (absoluto o a l 95% de acuerdo con e l procedim iento u tiliz a d o )

5g 100 m L

b. Disolver el a-naftol en menos de 100 mL de etanol absoluto (o al 95%). c. Transferir la solución a un frasco graduado de 100 mL y llevarlo a 100 mL con etanol absolu to (o al 95%).

2. Hidróxido de potasio (KOH), 40%, agente oxidante a. Ingredientes KOH C re a tin a (sólo para lo s re a ctivo s de C o b le n tz y O ’ M e ara) A g u a d e sio nizad a

40 g 0,3 g 100 m L

b. Pesar con rapidez el KOH y disolver en menos de 100 m L de agua destilada en un vaso de pre cipitación. Este reactivo es altamente higroscópico. Agregar la creatina excepto con el reactivo de Barritt. c. Colocar el recipiente en un baño con agua fría circulante para controlar la temperatura. d. Enfriar y transferir la solución de KOH a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua destilada. e. Conservar en una botella para reactivos de polietileno o recubierta con parafina. Vencimiento, a las 2-3 semanas (6). f. Rotular de manera correcta. El KOH al 40% puede ser sustituido por hidróxido de sodio (NaOH) al 4Q%.iLos ingredientes y la pre paración son similares a los utilizados para el hidróxido de potasio. Los hidróxidos de sodio y de po

tasio son soluciones extremadamente cáusticas; evitar la exposición de la piel ya que pueden cau sar quemaduras dolorosas. E. Método de utilización (Nota: Se utiliza un solo medio para ambas pruebas, M R y VP; el resultado de la prueba del M R (véase cap. 27) se determina después de una incubación de 48 h o más, el resultado de VP por lo común después de 24 h; en consecuencia, se deben probar alícuotas para la reacción de VP en caso de que sea necesario prolongar la incubación para la prueba de MR. Sin embargo, también se recomienda el uso de una alícuo ta para la prueba de MR. 1. De manera aséptica (con pipeta) retirar una alícuota para la determinación de Voges- Proskauer. a. Prueba de Barritt: 2,5 mL (2).. b. Prueba de Coblentz: 2 mL (12) c. Prueba de O ’Meara: 1 mL (30). 2. Agregar los reactivos VP directamente a las alícuotas en el siguiente orden: a. Reactivos de Barritt o Coblentz; reactivos adecuados para probar el procedimiento de prue

ba a ser utilizado (2, 12) (1) Primero: 0,6 mL (6 gotas) del reactivo A. (2) Segundo: 0,2 mL (2 gotas) del reactivo B. b. Procedimiento de O ’Meara: Agregar 1 mL de reactivo (30). c. A gitar los tubos con suavidad durante 30 seg a 1 min de modo que el medio esté expuesto al oxígeno atmosférico para oxidar la acetoína y obtener una reacción de color. 3. Permitir que los tubos reposen durante un tiempo apropiado antes de intentar interpretar el color. a. Tubos con Barritt: por lo menos 10-15 min; la reacción a menudo es inmediata (2). b. Tubos con Coblentz: 10-20 min (12). c. Tubos con O ’Meara: 35°C o temperatura ambiente (22-25°C), lectura final a las 4 h; si el resul tado es equívoco (±), repetir las pruebas con cultivos en caldo incubados a 25°C, 48 h (20).

Prueba de Voges-Proskauer 417 La prueba de O ’M eara depende de la formación de acetoína, la cual es oxidada en un medio alcalino en presencia de aire para formar diacetilo; éste reacciona con la creatina para producir un compuesto ro sado-rojo (30). F. Conservación: Conservar el reactivo en el refrigerador (4°C) cuando no se usa; el reactivo de O ’M ea ra se deteriora con rapidez y no debe guardarse por más de 2-3 semanas (20). G. Química de acción del reactivo: Los reactivos de Barritt para la detección de acetoína en la prueba de Voges-Proskauer actúan en un procedimiento de tres pasos (6, 11).

c 6h 12o 6

Fermentación

CHOH

( 1)

ch3

G lu c o s a

Acetoína (acetilmetilcarbinol, AMC)

Í H3

1 = ®

40% KOH

£ j_|Q|_|

O2 + (oxidado)

a-Naftol (catalizador)

C H3

c=o

c=o I

c=o 1 1

( 2)

c=o 1

ch3

Acetoína

Diacetilo

NH2 C (= N H

condensación

C o lo r ro sa d o -ro jo

(3)

NH- R

CH, Diacetilo (sustrato)

Núcleos de guanidina presentes en la peptona (arginina: NH:C(NH2) - N H - ( C H 2)3 -C H (N H 2)COOH)

Los tres ingredientes principales en la prueba de VP son el a-naftol, una sustancia nitrogenada presen te en la peptona y el diacetilo. El primer reactivo agregado a una alícuota incubada es el catalizador a-naftol. Es esencial una solu ción alcohólica de a-naftol debido a que actúa como un intensificador del color, lo que incrementa la sen sibilidad de la reacción sin pérdida de la especificidad (2). El a-naftol se combina con el producto de la reacción de diacetilo y con el compuesto de tipo guanidina, la arginina, presente en la peptona al comien zo de la reacción; por esto debe ser agregado en primer término (2). El segundo reactivo es el KOH al 40% (o NaOH al 40%), el cual ayuda a la absorción de COz en el medio VP (17). No debe excederse de la cantidad exacta de 0,2 mL. Estos dos reactivos, a-naftol y KOH al 40%, deben ser agregados en ese orden. El KOH reacciona con la peptona para dar un color salmónrosa y el posterior agregado de a-naftol no altera el color (2). Después del agregado del a-naftol y del KOH, el tubo debe agitarse con suavidad para exponer el medio al oxígeno atmosférico a fin de oxidar la acetoína presente a diacetilo. Branen y Keenan (5) m os traron que la aireación por agitación incrementa en gran medida la acumulación de diacetilo. El KOH ac túa como un agente oxidante y acelera la oxidación de acetoína a diacetilo (2). El diacetilo es el reactante esencial que da una reacción de color con el KOH y la peptona. Con el uso de un agente oxidante, el color desaparece rápidamente, sobre todo debido a que el complejo reactante diacetilo-peptona puede ser oxidado posteriormente con rapidez a un compuesto incoloro (2)

418

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

El diacetilo es la sustancia reactante activa, no p-xiloquinona (C6H 60 2(CH3)2), la que puede for m arse a partir del diacetilo por la acción del KOH (19). La prueba de VP está basada en la reacción entre el diacetilo y el núcleo guanidina (NH:C(NH,)-NH-R) presente en la peptona en condiciones al calinas (15). H arden y N orris (22) m ostraron que el diacetilo puede reaccionar con com puestos que contienen el núcleo guanidina, com o arginina, agm atina, creatina, dicianam ida y ácido guanidinacético. El com puesto que contiene el núcleo guanidina aquí es la arginina (NH:C (NH2)*(NH)»(CH2)3CH(NH2)COOH) (2, 6). Es necesario un grupo NH2 libre disponible en la m olécula de guanidina pro veniente de la arginina en la peptona para el desarrollo del color (4). Los reactivos de O ’M eara (30) y Coblentz (12) incorporan una fuente adicional del núcleo de guanidina, creatina (H2N-C(NH)-N(CH3) (CH2)—COOH); un grupo NH2 libre adicional intensifica el desarrollo del color, por lo com ún dentro de los 15 min. En consecuencia, cuando se mezclan en proporciones correctas diacetilo, peptona y a-naftol se desa rrolla de manera casi instantánea un color rojo (2) en la superficie del medio; la velocidad de desarrollo del color depende de la cantidad de acetoína en el cultivo de prueba (11). Harden y Walpole (23) postu laron que esta coloración, sólo en la supcificie, sugiere un proceso de oxidación. La reacción positiva por lo común ocurre en 2-5 min, mediante un tenue color rosa; no obstante, exhibe una marcada coloración (rojo oscuro) cuando se lo deja durante 30 min. El máximo color se obtiene después de 1 h (2). La expo sición durante 1 h o más de un cultivo negativo con los reactivos de VP puede mostrar un color similar al cobre por la acción del KOH sobre el a-naftol (2). Cuando la acetoína y el 2,3-butanodiol son oxidados en presencia de álcali y peptona, a diacetilo y ace toína y luego diacetilo, respectivamente, dan un resultado de VP positivo (2, 15). Harden y Walpole (23) mostraron que ni el 2,3-butanodiol ni la acetoína exhiben ninguna coloración con el KOH solo. Sin em bargo, la acetoína y la peptona sin un álcali exhiben un resultado de VP positivo. Los reactivos de Barritt son muy sensibles y específicos y esta prueba reveló que la acetoína es producida por muchas bacterias consideradas con anterioridad VP negativas (2). Eddy (17) utilizó métodos sensibles en la detección de acetoína para demostrar que las diferencias entre bacterias (p. ej., Enterobacteriaceae) que antes eran con sideradas como cualitativas, pueden en la actualidad ser cuantitativas.

VI. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. VP positivo (+) Enterobacter cloacae

ATCC 13047

tí. VP negativo (-) Eschericlua coli

ATCC 11775

N o in o cu lado

Vil. RESULTADOS Véase figura 40-1 (Apéndice 1) para los resultados fotográficos en color. VIII. INTERPRETACIÓN A. VP positivo (+): color rosado-rojo en la superficie del medio (acetoína presente), tí. VP negativo (-): color am arillo en la superficie del m edio (igual color que el reactivo). Puede for marse un color cobrizo, pero es un resultado negativo (debido a la acción de los reactivos cuando se mezclan).

IX. PRUEBAS ALTERNATIVAS (REMITIRSE A LAS REFERENCIAS)___________________ A. Cromatografía gas-líquido (GLC); determina diacetilo (8, 14, 16, 27, 33) tí. Cromatografía gas-líquido con captura de electrones (EC-GLC) (28). C. Cromatografía gaseosa-espectrometría de masa con ionización química (GC-CMS) (28). D. Método colorimétrico para la determinación de diacetilo (7).

P ru e b a d e V o g e s -P ro s k a u e r

419

X. PRUEBA DE VP RÁPIDA DE BARRY Y FEENEY (3)_______________________ A. Caldo MR/VP: de manera aséptica pipetear 0,2 mL en un tubo de prueba de 10 x 75 mm. B. Inoculo: una ansada de un crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h en KIA, TSI, agar de MacConkey (MAC), agar sangre (BA), agar chocolate (CA); no utilizar agar con eosina-azul de metileno (EMB) (4). C. Incubación: 35°C en baño de agua, 4 h. D. Agregar los reactivos; agitar bien entre cada agregado. 1. Solución de creatina: 0,3%; 2 gotas. 2. Reactivos de Barritt: A luego B, 2-3 gotas de cada uno. E. Positivo (+): color rojo cereza dentro de los 15 min.

XI. PRECAUCIONES A. Generales 1. El medio de Clark y Lubs (MR/VP), ya sea no inoculado o inoculado, aparece igual que el medio para indol. Asegurarse que los tubos estén marcados de manera correcta antes de la inoculación, ya que cualquier mezcla de los medios invalida todos los resultados de la prueba. 2. Si no se dispone de medios comerciales, cualquier medio que contenga no menos de 0,5% de glu cosa y peptona y un buffer fosfato es satisfactorio. Deben llevarse a cabo controles de calidad. 3. Las pruebas de rojo de metilo y de Voges-Proskauer no deben considerarse suficientes para dife renciar E. coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter en la identificación de rutina o en el análisis de agua. Las pruebas de citrato e indol deben realizarse de manera simultánea con las pruebas MR/VP. Existe la posibilidad de que la acetoína pueda ser destruida, lo que invalida las dos prue bas (MR y VP) con fines de identificación.

B. Medio para la prueba de Voges-Proskauer (VP) 1. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae pueden producir acetoína a partir de la glu cosa, pero no todas las cepas pueden fermentar la acetoína, por ejemplo, todas las cepas de E. aerogenes (39). Algunas bacterias pueden metabolizar la acetoína por reducción o por oxidación, lo que disminuye así la cantidad de sustrato para la detección por el procedimiento de VP (17). La acetoína puede ser reducida a 2,3-butanodiol, lo que da una reacción de VP negativa (17). El m e tabolismo intermedio de las cepas varía (39). 2. La acetoína presente en el medio de Clark y Lubs brinda una reacción positiva dentro de 1-3 días de incubación. Algunos microorganismos VP positivos pueden producir una condición ácida en el medio después de una incubación prolongada y brindan resultados de VP positivo débil o falso ne gativo (39). Algunos miembros de los grupos Escherichia-Enterobacter pueden destruir la acetoí na (19,38, 43); se produce ácido cuando la acetoína es utilizada como única fuente de carbono (39, 44). Tittsler (39), cuando trabajaba con cepas de E. aerogenes, demostró que este microorganismo puede producir ácido y gas cuando se cultiva en un medio sintético que contiene acetoína como única fuente de carbono. Las reacciones negativas no se deben a la depleción de peptona en el me dio (39). Como fuente de carbono, la acetoína es fermentada o convertida en compuestos VP ne gativos como 2,3-butanodiol por reducción o por oxidación a diacetilo, el que es metabolizado con posterioridad (17, 39). Sin embargo, la prueba de VP puede aún ser útil para distinguir E. coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter siempre que el período de incubación no exceda los 3 días (39). 3. M uchos de los laboratoristas tienen la impresión errónea de que un microorganismo VP positivo es de manera automática M R negativo o viceversa. Es cierto que la mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae brindan reacciones opuestas (el incremento de la alcalinidad produce un resultado M R negativo y un VP positivo debido a la formación de acetoína (6)), pero ciertos m i croorganismos como H. alvei (cuando se incuba a 37°C) y Proteus mirabilis pueden dar una reac ción de M R y de VP positiva, si bien la reacción de VP a m enudo es tardía. 4. Cuando se lleva a cabo la prueba de VP para identificar otros microorganismos, como especies de Bacillus y Staphylococcus, el fosfato presente en el medio de Clark y Lubs puede interferir con la producción de acetoína (39). Smith y col. (35) recomiendan la sustitución del fosfato por cloruro de sodio (NaCl), mientras que Abd-el-M alek y Gibson (1) recomiendan un caldo simple con glu cosa y peptona sin cloruro de sodio ni fosfato. 5. El orden para agregar los reactivos para VP de Barritt es extremadamente importante. Primero agre gar el a-naftol, luego el KOH. El orden inverso al agregar los reactivos puede dar un resultado

420

P r u e b a s b io q u ím ic a s in d iv id u a le s

positivo débil o falso negativo. El a-naftol se combina al comienzo de la reacción con el produc to de la reacción de diacetilo y cpmel compuesto de tipo guanidina presente en la peptona (2). No debe excederse de una cantidad exacta de 0,2 mL de KOH al 40%, ya que el exceso de KOH puede enmascarar una reacción de VP débilmente positiva manifestada por un color cobrizo debi do a su reacción con el a-naftol solo (2). El máximo color para la detección de cantidades mínimas de acetoína se produce en un tubo de VP positivo después de 1 h de reposo (2, 39). Después de la exposición a los reactivos durante 1 h, un cultivo VP negativo puede mostrar un color cobrizo debido a la acción del KOH sobre el a-naftol (2), lo que hace que un microbiólogo interprete el resultado como positivo. Vaughn y col. (40) también encontraron que las pruebas completadas pueden dar un resultado falso positivo después de la exposición a los reactivos por más de 1 h y que estos resultados ocurren con más frecuencia con una incubación a 30°C que a 37°C. El caldo infusión de carne no debe utilizarse para el desarrollo del microorganismo de prueba de bido a que la acetoína, el diacetilo y las sustancias relacionadas en el extracto de músculo produ cen un resultado de la prueba falso positivo (2). Luego del agregado del a-naftol y del KOH, el tubo debe ser agitado con suavidad para exponer el medio al oxígeno atmosférico a fin de oxidar la acetoína presente a diacetilo. Branen y Keenan (5) mostraron que la aireación por agitación incrementa en gran medida la oxidación de la acetoí na a diacetilo (2). El diacetilo es el reactante esencial necesario para producir el color rojo con el KOH y la peptona. Con el uso de un agente oxidante, el color desaparece rápidamente, sobre todo debido a que el complejo reactante diacetilo-peptona puede ser oxidado posteriormente con rapi dez a un compuesto incoloro (2).

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P ru e b a d e V o g e s -P ro s k a u e r

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CAPI TULO

Factores X y V

I. PRINCIPIO Determinar el requerimiento de factores de crecimiento X y V para favorecer el desarrollo de las es pecies de Haemophilus in vitro.

II. OBJETIVO Procedimiento cualitativo para el aislamiento y la diferenciación de las especies de Haem ophilus; el desarrollo depende de manera parcial de la presencia del factor X o del factor V o de ambos (5).

III. BIOQUÍMICA _______________________________________________________________ Factor X Porción hem de la hemoglobina (protoporfirina) necesaria para la síntesis de las enzimas respiratorias; también denominada hem ina y hematina; termoestable.

Factor V Coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD); termolábil.

Factores X y V Ambo¿ factores, X y V, permanecen dentro de los glóbulos rojos intactos. No están disponibles con facilidad para las especies de Haemophilus en los medios de agar con sangre de oveja (SBA) no calenta dos (6).

IV. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EMPLEADOS A Medios de cultivo 1. Medio de inoculo: caldo infusión de cerebro y corazón (BHIB). 2. M edios de prueba; medios con agar sin factores de crecimiento a. Tripticasa soja agar (TSA). b. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA). B. Reactivos 1. Tiras o discos de papel impregnados con los factores X y V. 2. Disponibles en el comercio; BBL: Taxo X, V y XV strips (Tiras reactivas Taxo X, V y XV) (6).

PROCEDIMIENTO

A. A partir de un cultivo puro en agar de la especie sospechada de H aem ophilus, preparar una suspen sión liviana del crecimiento en BHIB.

Factores X y V 423

1. Con un hisopo estéril, inocular la superficie de TSA o de BHIA (agares deficientes en factores). 2. Sembrar con el hisopo para obtener un crecimiento máximo. 3. Dejar que la superficie del agar se seque durante unos pocos minutos. B. Colocar las tiras (o discos) de los factores X y V sobre el agar en el área del inoculo. 1. Colocar las tiras con alrededor de 1 cm de separación. 2. Presionar con suavidad sobre las tiras de modo que se adhieran a la superficie del agar. C. Incubación: COz al 3-5%, 35°, 18-24 h. VI.

MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD F acto r X solo: Haemophilus haemoglobinophilus F acto r V solo: Haemophilus parainfluenzae F acto res X y V: Haemophilus influenzae

A TCC 19416 A TCC 33392 ATCC 33391

Vil. INTERPRETACIÓN Inspeccionar visualmente la superficie del agar para determinar el crecimiento visible entre una o más tiras (o discos) o alrededor de ellas (cuadro 41-1). El requerimiento del factor X en ocasiones puede ser observado en el aislamiento primario pero es mejor en los subcultivos (2).

Requerimiento del factor X

Requerimiento del factor V

Requerimientos de los factores X y V

Cuadro 41 -1. C recim iento de las especies de Haemophilus con el factor X , o con e l factor V o con am bos F a cto r M ic ro o rg a n is m o

H. actinom ycetem -com itans H. aphrophilus H. ducreyi H. haem oglobinophilus H. haem olyticus H. influenzae H. paracuniculus H. paragallinarum H. parahaem olyticus H. parainfluenzae H. parapm haem ophilus H. parasuis H. segnis

+ + + + -

+ + + + + + + + +

VIII. PRECAUCIONES A. Realizar las pruebas en todos los aislamientos sospechosos de ser Haemophilus sobre la base de sus características de crecimiento y de la morfología de la colonia en agar chocolate (CA). B. Las tiras o los discos deben estar separados en las placas de modo que se impida la sinergia debida a la difusión de los factores de crecimiento (4).

424

Pruebas bioquímicas individuales

C. El agar de M ueller-Hinton no debe ser utilizado para la prueba dado que favorece el desarrollo de una pequeña cantidad de crecimiento de algunas cepas de Haemophilus (4).

D. La prueba de crecimiento con los factores X y V no debe realizarse en agar con sangre debido a que

F. G.

los glóbulos rojos se unen al factor V, por lo que no está disponible para el microorganismo de prue ba e inhibe de manera marcada el crecimiento de H. influenzae (4). Es esencial una suspensión liviana del microorganismo de prueba en solución fisiológica o caldo pa ra reducir el sobrante de nutrientes del agar chocolate; un inoculo denso incrementa la posibilidad de algún crecimiento visible alrededor de las tiras (discos) del factor V antes de que el microorganismo pueda ser considerado por ser H. paruinfluenzae (4). Eikenella corrodens puede exhibir crecimiento alrededor de la tira del factor X; una prueba de diag nóstico útil (40). Cuando se transfiere el desarrollo del medio de aislamiento al caldo de inoculo evitar tomar el medio que contiene hemina a partir de la placa de aislamiento primario (3). Muchos microorganismos que requieren factor X pueden trasladar una cantidad suficiente de factor desde el medio de aislamiento primario para dar un resultado falsonegativo (p. ej., el desarrollo aparece demasiado alejado de la tira X que es un falso indicio de que el microorganismo no requiere el factor X) (1). La comprobación de estos factores ha sido en gran medida reemplazada por la prueba de porfirina (ALA) (cap. 36), la que establece un requerimiento del factor X por los microorganismos sin el problema de la transferencia a partir del medio de aislamiento primario. Permitir secar el inoculo en el medio de prueba de manera cuidadosa antes de colocar las tiras o los discos en la superficie del agar. No colocar las tiras demasiado cerca entre sí; los resultados pueden ser confusos.

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SECCI ÓN

Sistemas de pruebas múltiples

CAPI TULO

Sistemas de pruebas múltiples En el mercado existen diversos sistemas (equipos) de pruebas múltiples y técnicas de microbiología molecular, así como otros numerosos medios con pruebas combinadas. La mayor parte de ellos fueron sometidos a extensas comprobaciones por diversos laboratorios, lo que produjo modificaciones para in crementar su utilidad. La mayoría de los equipos comerciales de pruebas múltiples utilizan una microtécnica, con una can tidad de pruebas incorporadas en una única unidad. Esto puede crear problemas no encontrados habitual mente con las macrotécnicas estándar utilizadas aún en la actualidad: la transferencia de sustrato duran te la inoculación causa problemas, tanto la edad como la concentración del inoculo pueden ser críticos (algunas pruebas requieren un inoculo liviano mientras que otras un inoculo denso) y, sobre todo, los pro blemas se originan por el uso de estos equipos y medios combinados por personal de laboratorio sin ex periencia suficiente en bacteriología como para conocer sus limitaciones, sus problemas potenciales o am bos. Esto se observa en especial en los pequeños laboratorios situados en los consultorios médicos donde las pruebas son llevadas a cabo por los enfermeros o el personal administrativo que no están entrenados en bacteriología. Muchos equipos comerciales son utilizados de preferencia para diferenciar e identificar los miembros de la familia Enterobacteriaceae, una familia de bacterias que requiere el máximo de conocimiento y ex periencia para la identificación precisa, ya que incluye muchos microorganismos que pueden diferir m u cho de la norma en lo que se refiere a la actividad bioquímica. En el pasado aumentó el interés por los bacilos gramnegativos no fermentadores (NF, NFB). Estos m i croorganismos se encontraron con una frecuencia aumentada en muestras clínicas y ambientes hospitala rios y, debido a su resistencia múltiple a los fármacos, muchos laboratorios han puesto mayor interés en su identificación exacta. La identificación de los microorganismos no fermentadores requiere amplias comprobaciones bioquímicas con la interpretación realizada por personal con experiencia en bacteriolo gía; sin embargo, el problem a principal es el prolongado tiempo de incubación requerido y la urgente ne cesidad de una rápida identificación. M uchos laboratorios no están provistos con los medios ni cuentan con el personal experimentado para identificar estos microorganismos no fermentadores. Se dispone en el comercio de equipos para sistemas de pruebas múltiples. Con cualquiera de ellos es necesario tomar precauciones. Los sistemas de pruebas múltiples para los microorganismos no fermentadores son una ayu da pero, de manera habitual, no bastan para la identificación definitiva; a menudo se requieren pruebas suplementarias y su selección e interpretación requieren un criterio experimentado. Cuando se usan estos equipos, los resultados deben correlacionarse con los obtenidos con otras carac terísticas de identificación como la fuente de las muestras y la morfología de las colonias, tanto en m e dios diferenciales como selectivos, antes de que se realice una identificación presuntiva. Asimismo, mu chos de los resultados pueden no ser suficientes para la confirmación y puede requerirse una comprobación bioquím ica y serológica adicional.

Deben seguirse claramente las directivas del fabricante. Es necesario leer las instrucciones de manera cuidadosa para familiarizarse con los objetivos principales del equipo y sus limitaciones. Aquí se mencionan los equipos de sistemas de pruebas múltiples y los instrumentos automatizados uti lizados con más frecuencia. No es factible enumerar en este capítulo todos los sistemas y técnicas con su mo detalle (véase el M anual de la American Society for M icrobiology (ASM) (169) y el libro de Koneman (132)). La información sobre estos sistemas por lo común puede adquirirse solicitándola al fabricante (para las direcciones véase el Apéndice 11).

428

Sistemas de pruebas múltiples

La microbiología molecular es el campo más nuevo para la identificación de las bacterias: técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (sondas, señales y amplificaciones de células blanco), técnicas de secuenciación y tipificación del DNA, técnicas de sondas moleculares directas, cuantificación del ácido nu cleico y tecnología chip de genes (166, 167, 188, 211).

I. MEDIOS DIVERSOS PARA PRUEBAS COMBINADAS (Nota: Para los procedimientos, seguir las referencias de las pruebas; la mayoría de los medios están dis ponibles en el comercio.) A. Caldo/agar para coagulasa y manitol 1. M edios combinados para placas de Esber y Faulconer (70). 2. Objetivo: aislamiento de especies patógenas de Staphylococcus (fig. 42-1, Apéndice 1). 3. Las reacciones no son suficientes para clasificar a los estafilococos en el nivel de especie; se re quieren pruebas adicionales (p. ej., coagulasa, DNasa).

B . Medio FN (medio para fluorescencia-desnitrificación)/medio para fluorescencia-lactosa-nitrato (FLN) 1. Medio para tubos de Pickett y Pedersen (191-193). 2. Diferencia seudomónadas de otros bacilos no fermentadores por su capacidad de reducir los nitra tos a nitritos (desnitrificación) y el hecho de poseer el pigmento fluoresceína. C. Medio para indol-nitrato (caldo con tripticasa y nitrato) 1. Diferencial por la capacidad de reducir los nitratos a nitritos, de producir indol o por ambas pro piedades; favorece el crecimiento de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos y obli gados. 2. Un tubo con medio de prueba combinado para la determinación de indol y/o nitrato para las bac terias no incluidas en la familia Enterobacteriaceae (57) 3. No recomendado para coliformes y otras bacterias entéricas (57) a. Resultados de indol falsos negativos. b. La rápida reducción de nitratos y la formación de nitrato de sodio puede inhibir la producción de indol (222).

D. Agar con lecitina-lactosa para anaerobios 1. Fórmula de Ellner y O ’Donnell (68, 69). 2. Objetivo a. Diferencial por la capacidad de fermentar la lactosa, de producir lecitinasa o por ambas propie dades. b. Selectivo para el aislamiento y la diferenciación de las especies histotóxicas de Clostridium. E. Agar con lecitina lipasa para anaerobios (agar de McClung-Toabe modificado) 1. Modificación del agar de McClung y Toabe (156). 2. Diferencial por la capacidad de producir lecitinasa, de demostrar la actividad de lipasa o por am bas propiedades. F. Medio de Lombard-Dowell (LD): Medios en placa de Dowell y Lombard (56-58) para identificación presuntiva; placa única dividida en cuatro cuadrantes con medios distintos; ayuda en la identificación de bacterias anaerobias. 1. Agar LD a. Evalúa el grado de crecimiento y la producción de indol y catalasa. b. Diferencia especies de Bacteroides y Fusobacterium. 2. Agar LD con bilis: diferencia especies de Bacteroides por su capacidad para crecer en presencia de bilis con formación de un precipitado o sin ella. 3. Agar LD con yema de huevo: detecta lipasa, lecitinasa y actividad proteolítica de anaerobios formadores de esporas y no formadores de esporas, por ejemplo, especies de Bacteroides, Fusobac terium, Clostridium y anaerobios grampositivos no formadores de esporas. 4. Agar LD con esculina: determina la hidrólisis de la esculina, sulfuro de hidrógeno (H2S), y la pro ducción de catalasa por las especies de Bacteroides y Fusobacterium. 5. Agar LD con gelatina: determina la actividad de gelatinasa por las especies de Clostridium. G. Agar con lisina-ornitina-manitol (LOM) 1. Fórmula de Bucher y von Graevenitz (26); modificación del medio de Rimler-Shotts (220). 2. D iferencia por su capacidad para ferm entar el m anitol y descarboxilar la lisina, la om itina o ambas.

Sistemas de pruebas múltiples 429 3.

Detecta y ayuda en la identificación de Pantoea agglomerans (antes ubicada en el género Enterobacter).

H. Caldo para rojo de metilo y Voges-Proskauer (caldo MR/VP, medio de Clark y Lubs) 1. Fórmula de Clark y Lubs (35). 2. Ayuda en la diferenciación entre géneros o entre especies dentro de un género.

I. Medio para movilidad-indol-lisina (MIL) o medio para movilidad-indol-lisina-sulfato (MILS) 1. Fórmula MIL de Reller y M irrett (198); fórmula MILS de Ederer, Lund, Balazevic, Reller y Mirrett (64). 2. Cinco determinaciones bioquímicas: indol, H2S, lisina descarboxilasa, lisina desaminasa y movi lidad. 3. Junto con los medios KIA o TSI y urea permite la identificación presuntiva precoz de patógenos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae a partir de muestras de materia fecal.

J. Medio para movilidad-indol-omitina (MIO) 1. Fórmula de Ederer y Clark (63) y Oberhofer y Hajkowski (176). 2. Medio de prueba en un tubo único. 3. Ayuda en la identificación de la familia Enterobacteriaceae. K. Medio para movilidad-nitrato 1. Fórmula de Ball y Sellers (8). 2. Determinación de movilidad, licuefacción de la gelatina y reducción de los nitratos (N 0 3). L. Medio para movilidad sulfuro (movilidad S, medio movilidad S) 1. Fórmula de Hajna (88); modificación de Edwards y Bruner (65). 2. Determinación de movilidad y H2S. M. Medio para sulfuro-indol-movilidad (SIM) 1. Diferencia por su capacidad de producir indol y H2S y demostrar la movilidad. 2. Ayuda en la identificación de gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae en es pecial Salmonella y Shigella luego de la identificación presuntiva en medios en tubos (KIA o TSI). 3. Las reacciones no son suficientes para la clasificación en el niVel de especie; para la confirmación se requieren pruebas bioquímicas y serológicas adicionales. 4. Las reacciones de H2S se intensifican con los cultivos móviles. N. Caldo con trehalosa-manitol 1. Fórmula de Knapp y Washington (130). 2. Diferencia Staphylococcus epidermidis de otros estafilococos coagulasa-negativos en 2 h.

O. Agar con trehalosa-manitol-fosfato (TMPA) 1. Fórmula de Stevens y Jones (229). 2. Identifica y diferencia Staphylococcus epidermidis y S. saprophyticus cuando se utiliza junto con el disco de novobiocina. 3. Otras especies humanas de estafilococos coagulasa negativos producen reacciones variables.

II.

MICROTÉCNICAS: SISTEMAS DE PRUEBAS MÚLTIPLES, EQUIPOS CON AUTOMATIZACIÓN O SIN ELLA_______________________________

(Nota: la mayoría de los equipos son miniaturizados y la interpretación de las reacciones genera una cantidad de biotipos que se utiliza junto con sistemas de base de datos asistidos por computadora para identificar los microorganismos.) (Nota: Becton Dickinson Microbiology Systems fue renombrado como BD Biosciences.) A. Identificación de Actinobacillus: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (54). B. Identificación de Actinobacillus actinom ycetem com itans 1. PAGE; electroforesis en gel de poliacrilamida. 2. PCR (85). C. Identificación de anaerobios (56) (Nota: excepto en el caso de API-ZYM, todos los sistemas proporcionan códigos numéricos, bases de datos computarizadas y tablas de identificación.) 1. “API-ZYM”: fabricante, bioMerieux. 2. “API-An-Indent”: fabricante, bioMerieux. 3. “ATB 32A” : fabricante, bioMerieux. 4. “API 20A” : fabricante, bioMerieux 5. “IDS RapID-ANA II": fabricante, REM EL (fig. 42-2, Apéndice 1).

430

Sistemas de pruebas múltiples

6. “M initek Anaerobe II”: fabricante, BD Biosciences. 7. “Rapid ID ANA”: fabricante, bioMerieux. 8. “M icroScan Rapid Anaerobic Identification System” (Sistema MicroScan para la identificación rá pida de anaerobios): fabricante, Dade/MicroScan. 9. “Vitek Anaerobe Identification (ANI) card” (Carta Vitek para la identificación de anaerobios): fa bricante, bioMerieux. 10. Panel “BBL Crystal Anaerobe (ANR) ID” (31). Identificación de Borde te lia pertussis 1. Inmunofluorescencia dilecta (DFA): pruebas directas en extendidos nasofaríngeos. 2. ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima): pruebas en colonias aisladas (87, 212). 3. PCR (27, 86, 95, 141, 241): identificación de B. pertussis y B . parapertussis. 4. Electroforesis en gel con campo pulsado (13, 50). Identificación de especies de : Biolog (255) 1. Fabricante, Biolog. 2. Prueba de utilización del sustrato carbono. Identificación de Burkholderia 1. Aglutinación de partículas de látex (228). 2. Electroforesis en gel con campo pulsado (34). 3. “RapID N F Plus”. * Identificación de especies de Campylobacter 1. Pruebas de aglutinación de partículas de látex a. “M eritec-Campy (jcl)” (171) (1) Fabricante, Meridian Diagnostics. (2) Identifica cultivos aislados de C. jejuni, C. coli y C. lari. b. “Campslide’¿ae subsp. pulvifaciens. Int J Syst Bacteriol 1996; 46(1:270-279. Heyndrickx M, Vandemeulebroecke K, Scheldeman P, et al. A polyphasic reassessment of the genus Pae nibacillus, reclassification of Bacillus lautus (Naka mura 1984) as Paenibacillus lautus comb nov. and of Bacillus peorico (Montefusco et al. 1993) as Paeni bacillus peoriae comb nov, and emended description of P. lautus and of P peonae. Int J Syst Bacteriol 1996;46(4):988-1003. Ash C, Pnest FG, Collins MD. Validation list no. 51. Int J Syst Bacteriol 1994;44(4):8S2. Heyndrickx M, Vandemeulebroecke K, Scheldeman P, et al. Paenibacillus (formerly Bacillus) gordonae (Pi chinoty et al. 1986 Ash e al. 1994 is a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) validus (Nakamura 1984 Ash et al. 1994: Emended description of P. validus. Int J Syst Bacteriol 1995;45(4):661-669. Murdoch DA, Collins MD, Willems A, et al. Des cription of three new species of the genus Peptostreptococcus from human clinical specimens: Peptostreptococus harei sp nov, Peptostreptococcus ivorii sp. nov., and Peptostreptococcus octavias sp. nov. Int. J Syst Bacteriol 1997;47(3):781-787. Kusano K, Yamada H. Niwa M, Yamasato K Propionibacterium cvclohexanicum sp. nov., a new acid-to lerant omega-cyclohexyl fatty acid-containing propionibacterium isolated from spoiled orange juice. Int J Syst Bacteriol 1997;47(3):825-831 . Willems A, Collins MD. Phylogenetic relationship of the genera Acetobacterium and Eubacterium sensi stricto and reclassification of Eubacterium alactolyticum as Pseudoramibacter alactolyticus gen. nov., comb nov. Int J Syst Bacteriol 1996;46(4): 1083-1087.

Klatte S, Kroppenstedt RM, Rainey FA. Validation list no. 52. Int J Syst Bacteriol 1995;45(1:197-198. 98 Briglia M, Rainey FA, Stackebrandt E, et al. Rhodococcus percolatus sp. nov., a bacterium degrading 2,4,6-trichlorophenol. IntJ SystBacteriol 1996;46(1) :23-30. 99 Carreto L, Moore E, Nobre MF, et al. Rubrobacter xylanophilus sp. nov., a new thermophilic species isolated from a thermally polluted effluent. Int J Syst Bacteriol 1996;46(2:460-465. too Foster G, Ross HM, Hutson RA, Collins MD. Staphy lococcus lutrae sp. nov, a new coagulase positive species isolated from otters. Int J Syst Bacteriol 1997;47(3):724-726. 101 Zakrzewska-Czerwinska-MastalarzA, Lis B, Gamian A, MordarskiM. Staphylococcuspulvereri sp. nov., isolated from human and animal specimens. Int J Syst Bacteriol 1995;45(1): 169-172. 102 Hájek V Meugnier H, Bes M, et al. Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis subsp. nov., isolated from bovine nostrils. Int J Syst Bacteriol 1996;46 (3):792796. 103 Kloos WE, Ballard DN, Webster IA, et al. Ribotype delineation and description of Staphylococcus sciun subspecies and their potential as reservoirs of methicillin resistance and staphylolytic enzyme genes. Int J SystBacteriol 1997;47(2):313-323. 104 Eldar A. Bejerano Y, Bercovier H. Validation list no. 52. Int J SystBacteriol 1995 ;45( 1). 197-198. 105 Vandamme P, Pot B, Falsen E, et al. Taxonomic study of Lancefield streptococcal groups C, G, andL (Strep tococcus dysgalactiae) and proposal of S. dysgalactiae subsp. equisimilis subsp. nov. Int J Syst Bacte riol 1997;46(3):774-781. 106 Osawa R, Fujisawa T, Sly LL. Validation list no. 56. Int J Syst Bacteriol 1996;46(2):362-363. 107 Devriese LA, Pot B. Vandamme P, et al. Streptococ cus hyovagin*lis sp. nov. and Streptococcus thoraltensis sp nov, from he genital tract of sows. Int J Syst Bacteriol 1997;47(4):1073-1077. 108 Yassin AF, Rainey FA, Brzezinka H. et al. Tsukamurella inchonensis sp nov. Int J Syst Bacteriol 1995;45(3):522-527. 109 Yassin AF, Rainey FA, Brzezinka H, et al. Tsukamurella pulmonis sp. nov. Int. J Syst Bacteriol 1996; 46(2):429-436. 110 Yassm AF, Rainey FA, Burghardt J, et al. Tsukamurella tyrosinosolvens sp nov. Int J Syst Bacteriol 1997;47(3):607-614. 111 Goodfellow M, Zakrzewska-Czerwinska J, Thomas EG, et al. Validation list no. 53. Int J Syst Bacteriol 1995;45(2):418-419. 112 Padden AN, Rainey FA, Kelly DP, Wood AP. Xanthobacter tagetidis sp nov., an organism associated with ragetes species and able to grow on substituted thio phenes. Int J Syst Bacteriol 1997;47(2): 394 401.

466

Esquemas de identificación

DESCRIPCIONES Y CUADROS DE LOS GÉNEROS GÉNERO: ABIOTROPHIA (19) Cocos y cocobacilos grampositivos; cadenas largas en medios líquidos No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa negativos No encapsulados NaCl al 6,6%: sin crecimiento 10°C: sin crecimiento 45°C: sin crecimiento LAP (leucina aminopeptidasa) positivos PYR (pirrolidonil arilamidasa) variables Bilis esculina negativos Vancomicina: S (sensibles) 2 especies: A. adjacens, A. defectivus No crecen en agar sangre ni en agar chocolate a menos que se complemente con vitamina B6 (clorhi drato de piridoxal/tiol al 0,001%) por medio de un disco impregnado, de estrías cruzadas con estafiloco cos o de medios de cultivos con suplementos (19) Antes estreptococos “variantes nutricionales” o “productores de satelitismo”; pueden producir satelitismo alrededor de las colonias de estafilococos en agar con sangre de oveja al 5% (BA) o en agar chocolate GÉNERO: ACETOBACTERIU M (26, 30) Bacilos grampositivos ovoides o cortos dispuestos en form a aislada, en pares y en ocasiones en cadenas cortas. Las células presentan extremos fusiformes o romos No formadores de esporas

Anaerobios obligados (estrictos) Catalasa negativos No encapsulados Móviles por medio de 1 o 2 flagelos subterminales O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30°C 7 especies: A. bakii, A. carbinolicum, A. fimetarium, A. malicum, A. paludosum, A. wieringae, A. woodii Especie tipo: A. woodii ATCC 29683 Se asemejan a los estreptococos P-hemolíticos GÉNERO: A C TIN O M YC E S (26, 40) Bacilos grampositivos que a menudo se colorean de manera irregular y toman un aspecto en cuentas de collar. Bacilos delgados, rectos o ligeramente curvos y filamentos con verdaderas ramificaciones, sin conidios. Los bacilos a menudo presentan extremos en forma de clava. Dispuestos en forma aisla da y en pares; disposiciones con formas de V e Y y en empalizadas No formadores de esporas Anaerobios facultativos; requieren C 0 2 para un desarrollo máximo en aerobiosis o anacrobiosis. Algunas especies crecen de manera deficiente en aire incluso con C 0 2 Catalasa variables No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Reducción de los nitratos variables. Indol negativos CAMP positivos: A. neuii subesp. anitratus y A. neuii subesp. neuii Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C No son ácido-alcohol resistentes 20 especies: A. bovis, A. denticolens, A. europaeus, A. georgia, A. gerencseriae, A. gravenitzii, A. honieovulneris, A. howelhi, A. humiferus, A. hyovagin*lis, A. israelii, A. meyeri, A. naeslundii, A. neuii subesp. anitratus, A. neuii subesp. neuii, A. odontolyticus, A. radingae, A. slackii, A. turicensis, A. viscosus Especie tipo: A. bovis ATCC 13683

Las especies se diferencian mejor por electroforesis en gel de las proteínas

Bacterias grampositivas 467 Cuadro 43-1. C a r a c te r ís tic a s d ife r e n c ia le s d e la s e s p e c ie s d e Actinomyces a is la d a s c o n m á s fre c u e n c ia (33)

P ru e b a

Catalasa no3 no2 Pigmentación rosa-roja (BA) SH2 (TSI) CAMP Hidrólisis de la esculina U reasa Glucosa Maltosa Manitol Sacarosa Xilosa

A. n e u ii subesp

A. n e u ii

a n itra tu s

n e u ii

+ -

+ +

NR NR +

+ + A A V A V

NR NR A A A A A

A. is ra e lii

V +

m e y e ri

+ -

A A V A A

V NR NR -

NR A

A. n a e s lu n d ii

subesp.

A . od o n to lyticu s

A. vis cos US

—

v +a +

V A V

V V A A

—

A V

V, reacción variable; V+, variable, por lo común positivo; NR, no se dispone de resultados; A, producción de ácido (+); BA, agar sangre, aSi es positiva, puede insumir 7-10 días; la exposición al oxígeno incrementa la producción de pigmento.

GÉNERO: AEROCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos dispuestos en forma aislada o en pares; grandes racimos o características tétradas en medios líquidos (tioglicolato) Microaerófilos a anaerobios facultativos; mejor crecimiento con tensión reducida de oxígeno. Mal cre cimiento en anaerobiosis (puede ser lento) No formadores de esporas Catalasa negativos o débiles (reacción de seudocatalasa) debido a la catalasa sin el grupo hemo (32) No encapsulados

Inmóviles Oxidasa negativos Reducción de nitratos negativa O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento; 30°C Se asemejan a enterococos Alfa (a) hemolisis en agar con sangre de oveja al 5% (SBA) 2 especies: A . u rin a e , A . v ir id a n s Especie tipo: A . v ir id a n s ATCC 11563, NCTC 8251

Cuadro 43-2.

D ife re n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e A e ro co ccu s

P ru e b a

A. urinae

A. viridans

Catalasa Crecimiento a 10QC Crecimiento a 45SC NaCI al 6,5% Bilis al 40% Manitol Arginina Hidrólisis de bilis-esculina Licuefacción de la gelatina, 22QC Hidrólisis del hipurato Voges-Proskauer (VP) LAP PYR Vancomicina (30 pg)

+ NG NG G NR NR NR V NR NR NR +

NG NG G G A -

V -

+ -

G, crecimiento; NG, sin crecimiento; A, producción de ácido (+); V, reacciones variables; S, sensible (susceptible); LAP, leucina aminopeptidasa; PYR, pirrolidonilarilamidasa.

468

Pruebas bioquímicas individuales

GÉNERO: ALLO IO C O C C U S (19) Grandes cocos grampositivos dispuestos en pares y tétradas No formadores de esporas Aerobios obligados (estrictos); no crecen en anaerobiosis Catalasa positivos pero débiles; catalasa negativos sólo cuando se cultivan en medios desprovistos de gló bulos rojos enteros (p. ej., agar chocolate) No encapsulados Oxidasa negativos NaCl al 6,5%: crecimiento; puede tardar 2-7 días 10°C: sin crecimiento 45°C: sin crecimiento LAP (leucina aminopeptidasa) positivos PYR (pirrolidonil arilamidasa) positivos Bilis-esculina negativos Hipurato positivos Vancomicina; S (sensibles) 1 especie: A. otitidis (antes A. otitis) Especie tipo: DSM 7252, NCFB 2890 Se asemejan a estreptococos viridans

GÉNERO: A M YC O LA TO P SIS (26, 40) Bacilos grampositivos; hifas aéreas; hifas ramificadas; cadenas largas No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa positivos 12 especies: A. alba, A. azurea, A. coloiadensis, A. fastidiosa, A. japónica, A. mediterranei, A. methanolica, A. orientalis, A. orientalis subesp. lurida, A. orientalis subesp. orientalis, A. rugosa, A. sulphurea Especie tipo: A. orientalis ATCC 19795

GÉNERO: ARACH NIA (26, 33, 40) U na especie: A. propionica', transferida al género Propionibacterium como Propionibacterium propionicus (5) y género Arachnia ahora eliminado Véanse especies de Propionibacterium para los resultados bioquímicos GÉNERO: ARCA N O B A C TE RIU M (26, 33, 40) Bacilos grampositivos delgados, irregulares; pueden mostrar extremos en forma de clava. Coloración irre gular después de 48 h. A veces dispuestos en formación en V; sin filamentos. Ocasionales ramifica ciones rudimentarias que son más pronunciadas cuando se cultivan en anaerobiosis (19). Los cultivos más viejos exhiben bacilos cortos e irregulares y cocos. Difíciles de distinguir de las especies de Corynebacterium No formadores de esporas Anaerobios facultativos; crecimiento anaerobio mejor que aerobio Catalasa variables, por lo común negativos; algunas cepas exhiben actividad débil No encapsulados Inmóviles Reducción de nitratos: la mayoría de las cepas por lo común positivas O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C No son ácido-alcohol resistentes P-hemólisis tardía en agar con sangre de oveja y de conejo; se asemejan a estreptococos 4 especies: A. bernardiae, A. haemolyticum, A. phocae, A. pyogenes Especie tipo: A. haemolyticum ATCC 9345, NCTC 8452

Bacterias grampositivas 469 Cuadro 43-3. Características bioquímicas de tres especies de Arcanobacterium Prueba

A . haem olyticum

Hemolisis, 5 % S B A a CA M P inversa Pigmentación

H2S (KIA/TSI)

G lucosa Maltosa Manitol S acaro sa Xilosa Licuefacción de la gelatina Indol U reasa Fosfolipasa D Pirazinam idasa

A A

A V V V A +c

A A

A . pyogenes

A. bernardiae

V -

_c -

NR NR

— +

V, reacción variable; NR, no se dispone de resultados; V+, variable, por lo común positiva; A, producción de ácido (+); p, beta hemolisis; y, gamma hemolisis (ausencia de hemolisis). Datos de las referencias 19, 33. a p-hemólisis más fuerte en agar que contiene sangre humana o de conejo (19). b Puede exhibir p-hemólisis sobre agar infusión de cerebro y corazón con sangre humana (19). 0 Después de 48 h.

GÉNERO: ARTHROBACTER (26, 33, 40) Bacilos grampositivos que se decoloran con facilidad; en cultivos jóvenes se observan bacilos i regulares, a me nudo con extremos en forma de clava; no forman filamentos A medida que el crecimiento avanza (des pués 72 h), las células aparecen como pequeños cocos dispuestos en forma aislada o en pares o en grumos irregulares. En la tase estacionaria casi todas las células presentan forma cocoide; corineformes típicas No formadores de esporas Aerobios

Catalasa positivos No encapsulados Movilidad variable, por lo común negativos; algunas especies bacilares son móviles (19) Reducción de nitratos variable O/F de la glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-30°C

DNasa positivos Esculina variables CAM P negativos Licuefacción de la gelatina, 22°C positivos No son ácido-alcohol resistentes Carecen de ácido micólico en las células 24 especies: A. agilis, A. atrocyaneus, A. aurescens, A. citreus, A. crystallopoietes, A. cumminsii, A. duodecadis, A. globiformis, A. histidinolovorans, A. ilicis, A. mysorens, A nicotianae, A. nicotinovorans, A. oxydans, A. pascens, A. polychromogen.es, A. protophormiae, A. ramosus A. siderocapsulatus, A. sulfureus, A. uratoxydans, A. ureafaciens, A. viscosus, A. woluwensis Especie tipo: A. globiformis ATCC 8010

GÉNERO: AUREOBACTERIUM (19, 26, 40) Bacilos grampositivos, irregulares, cortos, dispuestos en forma aislada y en pares. Muchas células dis puestas en formación en V No formadores de esporas Aerobios

Catalasa positivos No encapsulados Movilidad variable O/F de la glucosa: O (oxidativos); lenta y débil Temperatura óptima de crecimiento: 25-30°C Reducción de los nitratos variable CAM P negativos

470

Esquemas de identificación

Esculina variables Licuefacción de la gelatina, 22°C, variables Ureasa negativos No son ácido-alcohol resistentes Carecen de ácido micólico en las células 13 especies: A. arabinogalactanolyticum, A. barkeri, A. esteromaticum, A. flavescens, A. keralanolyticum, A. liquefaciens, A. luteolum, A. saperdae, A. schleiferi, A. terrae, A. terregens, A. testaceum, A. trichothecenolyticum Especie tipo: A. liquefaciens ATCC 43647

Cuadro 43-4. D ifere n cia ció n de a lg u n a s esp e cies de Aureobacterium P ru e b a

Movilidad Licuefacción de la gelatina Telurito (0,05% p/v reducido)

A. barkeri

A. flavescens A. liquefaciens A. saperdae

A. terregens

A. testaceum

—

NR, no se dispone de resultados.

GÉNERO: BACILLUS (19, 26, 32, 40) Bacilos grampositivos o gramvariables con extremos redondeados o cuadrados, dispuestos en pares o en cadenas. Algunas especies son grampositivos sólo en cultivos jóvenes Endosporas; ovales o en ocasiones redondas o cilindricas. Sólo una espora por célula y la esporulación no se reprime por la exposición al aire. Resistentes al calor. Aerobios a anaerobio? facultativos; algu nas especies son aerobios estrictos (obligados) (p. ej., B. brevis, B.firm us, B. megaterium, B. sphaericus y B. subtilis) (33) Catalasa variables, por lo común positivos; unas pocas especies son negativas, pero raras veces se ob servan en un laboratorio clínico Encapsulado, sólo B. anthracis M ovilidad por lo común positiva excepto B. anthracis y B. mycoides; flagelos peritricos. La movilidad depende del medio de crecimiento (40) Reducción de los nitratos variable Oxidasa variables O/F de la glucosa: F (fermentativos) u O (oxidativos) o ambos (F/O) Temperatura óptima de crecimiento: 35°C; excepción: B. stearothermophilus no crece a 35°C, crecimien to a 65°C. La cápsula de B. anthracis se destruye a 42-43°C, lo que convierte al microorganismo en avirulento 75 especies: B. agaradhaerens, B. alcalophilus, B. amyloliquefaciens, B. anthracis, B. atrophaeus, B. azotoformans, B. badius, B. benzoevorans, B. carboniphilus, B. cergus, B. chitinolyticus, B. circulans, B. clarkii, B. clausii, B. coagulans, B. cohnii, B. edaphicus, B. ehimensis, B. fastidiosus, B. firmus, B. flexus, B. fusiformis, B. gibsonii, B. globisporus, B. halmapalus, B. haloalkaliphilus, B. halodenitrificans, B. halodurans, B. halophilus, B. horikoshii, B. horti, B. infernas, B. insólitas, B. kaustophilus, B. laevolacticus, B. lentus, B. licheniformis, B. marinas, B. marismortui, B. megaterium, B. methanolicus, B. mojavensis, B. mucilaginosus, B. mycoides, B. naganoensis, B. niacini, B. oleronius, B. pallidas, B. pasteuri, B. pseudalcaliphilus, B. pseudofirmus, B. pseudomycoides, B. psychrophilus, B. psychrosaccharolyticus, B. pumilus, B. schlegelii, B. silvestris, B. simplex, B. smithii, B. sphaericus, B. sporothermodurans, B. stearothermophilus, B. subtilis subesp. spizizenii, B. subtilis subesp. subti lis, B. thermoamylovorans, B. thermocatenulatus, B. thermocloacae, B. thermoglucosidasius, B. thermoleovorans, B. thermosphaericus, B. thuringiensis, B. tusciae, B. vallismortis, B. vedderi, B. weihenstephanensis Especie tipo: B. subtilis subesp. subtilis ATTC 6051, CCM 2216, NCIB 3610 La producción de catalasa y la formación de endosporas en aerobiosis distingue las especies de Bacillus de las especies de Clostridium (33) Hasta el presente, no se dispone de sistemas de identificación comerciales para el uso rutinario en el la boratorio clínico (19) (Véase cuadro 43-5)

Cuadro 43-5. C a ra cte rística s d ife re n cia le s de las e sp e cies de Bacillus a isla d a s co n m á s frecuenciaa

Prueba

22°C

B cereusc

B B. circuculans coagulans

B. firm usd

B. lichemformis

B. megaterium

B. pumilus

B. sphaericusd

+ +

V +

+ +

V +

v +h

V+I F

+ v+ F/O

G G

V V

G NG

A V V

B. subtilis

subesp. subtilis

+k 0

+ 0

NG G

G G

NG G

NG V

NG NG

A V A

A V+

V+ V+

A A A A

V V V

A A A A

_ _

F/O

__ V

+ F

(cont)

B a c t e r ia s g r a m p o s it iv a s

Gram, coloración Catalasa* Reducción de los nitratos Esporas9 Elipsoidales Esféricas Centrales Terminales o subterminales Distensión del esporangio B-hemólisis, 5% SBA Cápsula Movilidad OF de la glucosa Crecimiento en Anaerobiosis NaCI al 7,5% Hidratos de carbono Glucosa Arabinosa Manitol Xilosa Otras pruebas Licuefacción de la gelatina,

B. anthracisb

B. stearothermophiluse

■P» vi

472

Prueba

43-5.

C a ra c te rís tic a s d ife re n c ia le s d e la s e s p e c ie s d e

B anthracisb

_ Indol +n Lecitinasa Fenilalanlna desaminasa Citrato de Simmons V Hidrólisis del almidón + U reasa Voges-Proskauer0 +

Bacillus

a is la d a s c o n m á s fre c u e n c ia a (c o n t.)

B cereus 0

B. B circuculans coagulans

B firm usd

_ __n

B. Iicheniformis

B. megaterium

B. pumilus

B. sphaericusd

B. stearo therm o philus 6

B. subtilis

subesp. subtilis

“

V, variable; V+, variable, por lo común positivo; G, crecimiento; NG, sin crecimiento, +w, positivo débil, SBA, agar con sangre de oveja Datos de las referencias 26, 36, 40 a Por lo general no es necesario para identificar las especies, excepto para B . a n t h ia c is , agente etiológico del carbunco, y B . c e r e u s y B lic h e n ií o r m is , agentes etiológicos de la into xicación por alimentos. Otras pocas especies mencionadas aquí pueden estar implicadas en las intoxicaciones por alimentos y en infecciones humanas. b Cepas virulentas y avirulentas c B . c e r e u s y B c e r e u s var. m y c o id e s . B . c e r e u s con frecuencia es p-lactamasa positivo (f 9). d Aerobio estricta Las especies de Bacillus que son aerobios estrictos pueden aparecer como bacilos gramnegativos no termentadores en el agar con hierro de Kligler (KIA) o el agar con azúcar triple y hierro (TSI). e B. stearothermophilus no crece a 35°C; crece a 65°C. f Por lo común, catalasa positivos; hay excepciones pero no es probable que se observen en los aislamientos de muestras clínicas. 9 Una endospora por célula madre (esporangio) en presencia de oxigeno

h En agar con sangre de oveja al 5% (SBA), B . c e r e u s es (3 hemolisis positivo; B c e r e u s var. m y c o id e s es variable, por lo común positivo. 1B . a n t h r a c is virulento posee una cápsula, B a n t h r a c is avirulento no posee cápsula La cápsula se forma en condiciones apropiadas (con HC0 3 y anaerobiosis o C02) La cápsula es visible cuando se tiñe con una coloración con azul de metileno policrómico (MI Fadyean) 1B c e r e u s es móvil, B c e r e u s var. m y c o id e s por lo común es inmóvil, la movilidad depende del medio de crecimiento utilizado. k B m e g a t e u u m requiere aireación libre para una movilidad positiva lenta. 1Lenta mRapida. n Reacción de lecitinasa positiva débil, visible sólo por debajo de la colonia cuando se raspa el crecimiento 0 Incubar por 24 h adicionales a 37°C.

Esquemas de Identificación

C u ad ro

Bacterias grampositivas 473 GÉNERO: BIFIDOBACTERIUM (26) Bacilos grampositivos que a menudo se colorean de manera irregular; formas variadas; algunos curvos y en forma de clava; a menudo ramificados. Dispuestos en forma aislada, en pares y en V. A veces apa recen como cadenas en empalizadas de células paralelas o rosetas. A menudo se presentan como formas cocoides hinchadas No Arm adores de esporas Anaerobios; pocas especies pueden crecer en aire con 10% C 0 2 (26) Catalasa negativos; raras reacciones positivas cuando crecen en aire con C 0 2 (19, 26) No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa; F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37-41°C No son ácido-alcohol resistentes Reducción de los nitratos negativa; sin embargo, las células que crecen en presencia de glóbulos rojos lisados pueden ser capaces de reducir los nitratos (33) Ureasa: por lo general positivos Por lo común no patógenos M uy relacionados con la familia Lactobacillaceae 32 especies: B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. bourn, B. brete, B. catenulatum, B. cho*rinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum subesp. globosum, B. pseudolongum subesp. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subidle, B. suis, B. thermophilum Especie tipo: B. bifidum ATCC 29521, DSM 20456 Requiere técnicas especializadas para lograr la anaerobiosis estricta y para los estudios metabólicos Identificación no confiable a menos que se utilicen procedimientos especiales; la característica más di recta y confiable es la demostración de F6PPK en extractos celulares GÉNERO: BREVIBACILLU S (19) Bacilos grampositivos Formadores de esporas; las esporas distienden el esporangio Aerobios Glucosa negativos Manitol: ácido (+) Xilosa negativos Citrato variables Indol negativos Lecitinasa negativos Voges-Proskauer (VP) negativos 10 especies: B. agri, B. borstelenis, B. brevis, B. centrosporus, B. choshinensis, B. formosus, B. laterosporus, B. parabrevis, B. reuszeri, B. thermoruber Especie tipo: B. brevis ATCC 8246, NCIB 9372, NCTC 2611 GÉNERO: BREVIBACTERIU M (26, 33, 40) Bacilos grampositivos irregulares que se decoloran con facilidad. Dispuestos en forma aislada, en pares y a menudo en formaciones en V. No forman micelios. En cultivos viejos aparecen con formas cocoides No formadores de esporas Aerobios obligados (estrictos) Catalasa positivos No encapsulados Inmóviles Oxidasa variables O/F de la glucosa: O (oxidativos) o inertes (-) Temperatura óptima de crecimiento: B. casei y B. epidermidis 20-37°C; B. linens y B. iodinum 20-30°C (21) No son ácido-alcohol resistentes Ausencia de ácido micólico en las células CAMP negativos

474

Esquemas de identificación

Todas las cepas son proteolíticas 10 especies: B. casei, B. epidermidis, B. frigoritolerans, B. halotolerans, B. iodinum, B. linens, B. liquefaciens, B. mcbrellneri, B. otitidis, B. stationis Especie tipo: B. linens ATCC 9172, ATCC 14929

Cuadro 43-6. Diferenciación de las especies de Brevibacterium aisladas con más frecuencia P ru e b a

B. caseiab

B. epiderm idisbc

B. iodinumd'e,f

B. linens 8

Pigmentación de la colonia 9 *1 Oxidasa n o 3 -> n o 2 TSI (ALC/NC) Color de la reacción w/KOH Cristales de yodinina formados Crecimiento a 37°C Crecimiento a 42°C Crecimiento en NaCI al 6,5% Hidrólisis de la caseína DNasa Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina Hidrólisis del hipurato Hidrólisis del almidón U reasa Voges-Proskauer (VP)

Blanco-amarilla

Gris-blanca

Amarillo-naranja +w

+ +

Gris-blanca +' + NR

G G G + +

+ G G G + +

NGk NG G + +

+ +

NG1 NR G +w + NR + -

+ +

—

+ + -

+ -

ALC/NC, alcalino/sin cambios; G, crecimiento; NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; +w, positivo débil. Datos de las referencias 21,26. a Encontrado en quesos; B. casei posee olor a queso. b Diferenciación entre B. caseiy B. epidermidis sólo por la composición de menaquinona en moles %; relación G:C y va lores de apareamiento de bases DNA-DNA. c Flora normal de la piel; por lo común no patógeno. d Encontrado sólo en la leche. eAntes Chromobacterium iodinum. 1Puede mostrar cristales de yodinina intracelulares, brillo metálico, color púrpura (derivados de fenazina). 9En agar nutritivo. h Cuando se incuba a la luz; la producción de pigmento depende de la luz. Ei pigmento no se desarrolla si las placas se exponen a la luz después de que se hayan desarrollado por completo las colonias y haya cesado el crecimiento (40). 1Fuerte. 1Puede ocurrir algún grado de crecimiento. k Pocas cepas pueden mostrar crecimiento.

GÉNERO:BROCHOTHRIX (26, 40) (Nota: El género puede confundirse con el género Kurthia: las especies de Brochothrix producen ácido a partir de una amplia variedad de azúcares; Kurthia no es sacarolítico (40).) Bacilos grampositivos no ramificados dispuestos en forma aislada, en cadenas o en largas cadenas fila mentosas que se pliegan en masas anudadas. En cultivos más viejos tienen aspecto cocoide. Algu nas células pierden su capacidad de retener la coloración de Gram No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa positivos (dependiendo del medio y con la incubación a 20°C) No encapsulados Inmóviles a 22°C Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 20-25°C; por lo común no pueden crecer a 35-37°C No pigmentados No hemolíticos en agar sangre (BA) Ausencia de ácido micólico en las células No son ácido-alcohol resistentes 2 especies: B. campestris, B. thermosphacta Especie tipo: B. thermosphacta', ATCC 11509

B a c te r ia s g r a m p o s itiv a s

475

Cuadro 43-7. D ifere n cia ció n de las esp e cies de B roch othrix Prueba

B. campestris

B. therm osphacta 3

-> n o 2 NaCI al 6,5% H2S Ramnosa Hidrólisis del hipurato Indol Rojo de metilo (MR) Voges-Proskauer (VP)

G + A +

G + -

+ + +

+ +

no3

A, producción de ácido (+); G, crecim iento. a A ntes M ic r o b a c te r iu m th e r m o s p h a c tu m . Las cepas de B . th e r m o s p h a c ta se confunden con m ayor probabilidad con los géneros L a c t o b a c illu s y L is t e r ia (40).

GÉNERO: B U T V R IV IB R IO (2 6 , 3 3 , 4 0 ) Bacilos grampositivos y gramnegativos curvos dispuestos en forma aislada, en cadenas y en filamentos que pueden ser helicoidales. Se colorean como gramnegativos pero la pared celular es del tipo grampositivo No formadores de esporas

Anaerobios obligados (estrictos) Catalasa negativos No encapsulados Móviles; pocos flagelos polares o subpolares; rápidos y vibratorios O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C; lento < 30°C No patógenos 2 especies: B. crossotus, B. fibrisolvens Especie tipo: B. fibrisolvens ATCC 19171 Cuadro 43-8. D ifere n cia ció n de las e sp e cies de B utyrivibrio Prueba

B. crossotus

B. fibrisolvens

Flagelo polar único N 0 3 -> n o 2 Producción de butirato Producción de H2 Indol Hidrólisis de la esculina Glucosa Sacarosa

—

+ -

+ +

V A A

Aw -

A, producción de ácido (+); w, reacción débil; V, reacción variable.

GÉNERO: C A S E O B A C T E R (2 6 , 4 0 ) C. polymorphus trasladado al género Corynebacterium como Corynebacterium polymorphus (11) GÉNERO: C E L L U L O M O N A S (19 , 2 6 ) Bacilos grampositivos pero que se decoloran con facilidad, irregulares, rectos o ligeramente curvos en culti vos jóvenes. Dispuestos en pares y bacilos y a menudo exhiben una formación en V. En ocasiones ramifi cados pero no forman micelios. Las células en los cultivos más viejos pueden ser bacilos cortos o cocos No formadores de esporas Anaerobios facultativos; algunas cepas crecen mal en anaerobiosis

Catalasa positivos No encapsulados Movilidad variable; por lo común positiva con 1 a pocos flagelos Oxidasa negatives O/F de la glucosa: F (fermentativos) y O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30°C No son ácido-alcohol resistentes Ausencia de ácido micólico en las células Reducción de los nitratos positiva

476

E s q u e m a s d e id e n tific a c ió n

CAMP negativos Caseína negativos Hidrólisis de la esculina positivos Licuefacción de la gelatina, 22°C, positivos 10 especies: C. biazotea, C. cellasea, C. cellulans, C. fermentans, C.fimi, C. flavigena, C. gélida, C. hominis, C. turbata, C. uda Especie tipo: C. flavigena ATCC 482, CCM 1926, NCIB 8073

GÉNERO: CLOSTRIDIUM (26, 33, 40) Bacilos grampositivos en cultivos jóvenes, dispuestos en cadenas cortas con extremos redondos o en pun ta. Por lo común pleomórficos Endosporas ovales o esféricas Anaerobios obligados (estrictos); unas pocas especies pueden crecer en presencia de aire (p. ej., C. carnis, C. histolyticum y C. tertium; aerotolerantes) Catalasa variables, por lo común negativos; en algunas cepas pueden detectarse cantidades mínimas (40) No encapsulados M ovilidad variable; flagelos peritncos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 10-65°C 131 especies: C. absonum, C. aceticum, C. acetireducens, C. acetobutylicum, C. acidiurici, C. aerotolerans, C. aldrichii, C. algidicamis, C. aminophilum, C. aminovalericum, C. arcticum, C. argentinense, C. aurantibutyricum, C. baratii, C. beijerinckii, C. bifermentans, C. botulinum, C. butyricum, C. cadaveris, C. car-

Cuadro 43-9. C a ra cte rística s dife re n cia le s de las e sp e cies de Clostridium con e sporas su b te rm i

Indol Licuefacción de la gelatina, 2 2 °C Lecitinasa Lipasa Hidrólisis de la esculina Hidrólisis del almidón Ureasa de Christensen Voges-Proskauer (VP)

Sí V+ 3 So1 V

Sí 3 . So1

NG NG V VD +

NG NG NR C NR

NG NG + D V

NG NG V VD V

_ + + -

+ + +

+ + + -

_ -

+ + \r + -

_ _ -

C clostrldioforme

Sí « , 3, y So lk V

C celatum

Sí Y .. SoIJ

O Ü2 o 4= ■a cJ

5 55 -5 o o

Sí Y , So1 V

No a, 3 Som V

Sí 3 . Solm +

Sí

y .

NG NR

NG NG NR AC +

C butyri cum

C botuli num

C. bifer mentans

Aerotolerante Toxigénico Hemolisis, 5 % SBA Esporas, forma y ubicación n o 3 -> n o 2 Crecimiento en NaCI al 6 ,5 % Bilis al 2 0 % Digestión de la carne cocida Leche H2S Movilidad

C argenti nense3

P r u e b a

C baratii

n a le s a isla d a s con m á s frecuencia

ACGW -

+ V + -

NG NG

+ +

So1’"1'" V

NG V NR C V

V V + -

NR NR

So10 NR NR

+ -

So, esporas subterminales ovales; Sr, esporas subterminaíes redondas; SBA, agar con sangre de oveja; NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; V, resultados variables; V+, variable, por lo común positivo; V-, variable, por lo común negativo; D, digestión; C, coá gulo; A, producción de ácido (+); G, gas. Datos de las referencias 2, 26, 30, 33, 40. a Antes C lostridium b otulinum G y algunas cepas no toxigénicas de C lo strid iu m hastifo rm e y C lostridium s u bte rm in a le (43). b Clasificación como C lostridium c h a u v o e io C lo strid iu m tesen. Patógenos para herbívoros (vegetales). c Especies de clostridios toxigénicos más comunes. C. difficile distinguido con facilidad de C. sporogenes, al cual se asemeja íntimamente desde el punto de vista fenotípico, por su capacidad de fermentar el manitol y por su incapacidad de digerir la carne o la leche o de produ cir lipasa (40). d C. haem oiyticum y C. n o v y i figuran entre los patógenos bacterianos conocidos más exigentes para su desarrollo y sensibles al oxígeno (43). e Clostridios de la gangrena gaseosa aislados con más frecuencia: C. novyi, C. perfrin g e ns y C. se pticu m ; C. p e rfrin g e n s es el patógeno bacteriano que se encuentra más ampliamente (39). f Hemolisis sinérgica (fenómeno CAMP) entre C. pe rfrin g e n s y S tre p to co ccus a galactiae (39). 8 La mayoría de los clostridios son anaerobios obligados; sin embargo, C. histolyticum , C. c a rnis y C. te rtiu m crecen en presencia de aire en medios enriquecidos; a menudo confundidos con bacilos aerobios (p. ej., lactobacilos) dado que son catalasa negativos y no forman es poras en condiciones aerobias (2). . Doble zona de hemolisis; a y p. 1Las esporas pueden distender las células. (co n t.)

B a c te r ia s g r a m p o s itiv a s

477

o ü d °

>, O £-° £ 3 -£= O

No P . So1'"1 -

No T Sop -

Sí y . Sol -

NG NG

NG NG NR

NG NG

AC + + _

NR V NR NR

NR NR

+ + + +

O l i d ° +3 Sí p So m' NG NG + D V +x -

+ -

? O c O

Ir 0 0O. n o 2 H2S (TSI) F OF de la glucosa Movilidad, 22°C Hidratos de carbono Arabinosa Dextrán NR A Fructosa Galactosa A Glucosa Lactosa V+ Maltosa A Mañosa Rafinosa A Ribosa — Salicina \T Sacarosa V Trehalosa Xilosa Otras pruebas + Fosfatasa alcalina Hidrólisis de la escullna — Licuefacción de la gelatina, 22°C Glucógeno Hidrólisis del hipurato V + Rojo de metilo (MR) Pirazinamidasa v+ U reasa ONPG CAMP Requiere suero -

C. afermentansb

P ru e b a

Erysipelothrix rhusiopathiae C amycolatum 8

e n lo s s e re s h u m a n o s ,

+ NR

A -■*

NR -

A -

NR NR

A A

NR -

NR NR -

A A

NR -

A A A

V+ -

NR -

V A A

_ aa

A A

—

“

—

NR -

NR NR

+ + +

+ +

NR -

NR NR

NR -

+ -

+ + NR +

—

V +

+ +

(S, beta; y, gamma (ausencia de hemólisis); NR, no se dispone de resultados; A, producción de ácido (+); V, resultados variables; V+, variable, por lo común positivo; V“ , variable, por lo común negativo; SBA, ayar con sangre de oveja. Datos de las referencias 19, 26, 33, 40. a C. amycolatum es tal vez sinónimo con CDC grupos F2 y F12, 11, I2, G1 y G2. b C. aterrnentans CDC grupo ANF1; C. afermentans subesp. afermeníans y C. aíermentans subesp. lipophilum. c C. accolens CDC grupo 6 . d C. bovis es un patógeno veterinario del ganado vacuno e C. cystitidis antes C. renale de tipo III (40). f C. ulcerans ahora en el grupo C. diphtheriae (31). C. ulcerans ya no es más una especie válida; sin embargo, la biblio grafía clínica a menudo retiene el nombre. 9 Dentro de las corinebacterlas C.jeikeium (antes CDC JK g p ) es el patógeno aislado con más frecuencia de las mues tras clínicas (33). h Antes Corynebacterium murium\ encontrado en ratas. 1 C psewlodiphtheiiticum antes Corynebacterium hofmannir, patógeno humano raro. Pueden ser Usados por los bacte riófa*gos de C. diphtheriae y por eso pueden producir toxina diftérica (12). i Encontrado en ovejas, cabras, caballos y otros animales de sangre callente pero raras veces en los seres humanos. An tes Corynebacterium ovis. La toxina Inhibe la acción de la fS-lisina estafilocócica (1). k Encontrado en cabras, cerdos y ovejas. 1Antes Corynebacterium flavidum\ raras veces patógeno. mNo produce halo en el medio de Tlnsdale. (cont.)

B a c te r ia s g r a m p o s it v a s

485

C pseudodiphthericum 1

C. pseudotuber culosis 1

C. striatum 1

C. vitarumen

+ NR -

+ NR +

+ V +

+ vpq V*

+ Vp

+ +r -

+ NR +

NF +

+s NF

+ y V

a -

+ P -

0 /-u

V A -

A V A

V A -

A A

A A A

NR NR A NR A

V A -

A A Vy NR A A

A V V NR Abb

A A NR A A V -

Listeria monocy togenes

C pllosum

+ NR +

C C S c CD

Erysipelothrix rhusiopathiae

C. mycetoides

E 3 días), células cocoides No formadores de esporas

Aerobios estrictos (obligados) Catalasa positivos No encapsulados Movilidad por lo común positiva a 20-25°C; cepas ocasionales inmóviles; flagelos peritiicos Oxidasa negativos O/F de la glucosa: NF (no fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-30°C No son ácido-alcohol resistentes Ausencia de ácido micólico en las células

Pueden exhibir H2S en el fondo del tubo de TSI (19) Crecimiento característico en “plumas de ave” en las superficies de medios que contengan gelatina como nutriente Rara vez implicados en infecciones humanas; no obstante, se asemejan a las especies de Bacillus 3 especies: K. gibsonii, K. sibirica y K. zopfli Especie tipo: K. zopfii ATCC 33403, NCTC 10597, NCIB 9878 Cuadro 43-28. D ife re n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e K urthia P ru e b a

Colonias de color crema o amarillo Crecimiento a 45°C Crecimiento en NaCI al 7,5% n o 3 -> n o 2 Esculina Licuefacción de la gelatina, 22°Ca Fosfatasa

K. gibsonii

K. sibirica

K. zopfii

G G G

NG NG G

NG G NG

G, crecimiento; NG, sin crecimiento. a La concentración y la marca de la gelatina utilizada son importantes para las placas de gelatina nutritiva; no todas las marcas permiten el típico crecimiento exuberante (40). Extracto de carne (Lab Lemco polvo, Oxoid) 4g Peptona (Difeo) 5g Extracto de levadura (Difeo) 2g NaCI 5g Gelatina (BDH) 100g Agua destilada 1L pH 7 Esterilizar 115°C, 30 min para cantidades de hasta 100 mL Inocular con la cepa de referencia de K. zopfii, NCIB 9878

GÉNERO: LACTOBACILLUS (26, 33, 40) Bad los delgados largos grampositivos; algunos cocobacilos cortos o formas espiraladas (cocobacilos corineformes) por lo común en cadenas cortas o en forma aislada. Algunas cepas exhiben cuerpos bipo lares, granulaciones internas o un aspecto en cuentas de collar No formadores de esporas Anaerobios facultativos o estrictos (obligados); 20% son anaerobios obligados; en ocasiones microaerófilos. Crecen mal en presencia de aire; el crecimiento aumenta con tensión reducida de oxígeno. El aislamiento de algunos anaerobios se incrementa por el dióxido de carbono (C 0 2) No producen catalasa ni citocromo; algunas cepas son positivas (26) No encapsulados

498

Esquemas de identificación

Reducción de los nitratos negativa; en ocasiones positiva, pero sólo cuando el pH final es > 6,0 (40) Movilidad rara; flagelos peritricos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-40°C Raras veces patógenos; la identificación a nivel de especie es difícil y, dada la baja patogenicidad, por lo común no está indicada; sin embargo, se asemejan a los microorganismos grampositivos cocoides catalasa negativos 80 especies: L. acetotolerans, L. acidophilus, L. agilis, L. alimentarias, L. amylophilus, L. amylovorus, L. animalis, L. aviarius, L. aviarias subesp. araffinosus, L. aviarius subesp. aviarius, L. bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. casei subesp. casei, L. catenaformis, L. cellobiosus, L. collinoides, L. coryniformis, L. coryniformis subesp. coryniformis, L. coryniformis subesp. torquens, L. crispatus, L. curvatus, L. curvatus subesp. curvatus, L. curvatus subesp. melibiosus, L. delbrueckii, L. delbrueckii subesp. bulgaricus, L. delbrueckii subesp. delbrueckii, L. delbrueckii subesp. lactis, L. farciminis, L. fermentum, L. fructivorans, L. fructosas, L. gallinarum, L. gasseri, L. graminis, L. hamsteri, L. helveticus, L. hilgardii, L. hom*ohiochii, L. intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kefiranofaciens, L. kefirgranum, L. kefiri, L. lindneri, L. malefermentans, L. mali, L. maltaromicus, L. murinus, L. oris, L. pañis, L. parabuchneri, L. paracasei, L. paracaseii subesp. paracaseii, L. paracaseii subesp. tolerans, L. parakefir, L. paraplantarum, L. pentosus, L. plantarum, L. pontis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rogosae, L, ruminis, L. sakei, L. sakei subesp. carnosus, L. salcei subesp. sake i, L. salivarías, L. salivarius subesp. salicinius, L. salivarías subesp. salivarius, L. sanfranciscensis, L. sharpeae, L. suebicus, L. uli, L. vaccinostercus, L. vagin*lis, L. vitulinus, L. zeae Especie tipo: L. delbrueckii subesp. delbrueckii ATCC 9649, NCIB 8130 (Véase Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology, vol. 2, para las reacciones bioquímicas completas.) Cuadro 43-29. E sp e cie s de Lactobacillus a isla d a s co n frecuencia de m ue stra s clín ica s P ru e b a

L. acidophilus

L. casei

L. plantarum

p-hemólisis n o 3 -> n o 2 H2S (TSI/KIA) Crecimiento a 10°C Crecimiento a 45°C Manitol Rafinosa Arginina Esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C

—

G NG

G G A

Indol

PYR

G V V A

—

NG, sin crecimiento; G, crecimiento; V, reacción variable; A, producción de ácido (+); PYR, pirrolidonil arilamidasa.

GÉNERO: L A C T O C O C C U S (26) Cocos grampositivos esféricos a ovoides dispuestos en pares; forman cadenas cortas en medios líquidos No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30°C Por lo común grupo N de Lancefield 8 especies: L. garveiae, L. lactis, L. lacíis subesp. cremoris, L. lactis subesp. hordniae, L. lactis subesp. lactis, L. piscium, L. plantarum, L. rafjinolactis Especie tipo: L. lactis subesp. lactis ATCC 19435, NCTC 6681, NCIB 668

B a c te r ia s g r a m p o s itiv a s

L. lactis subesp. hordmae

L. lactis subesp lactis 3

L. p is :: um

L plantarum

L. raffinolactis

Hemolisis, 5% SBA Crecimiento 13 a: 10°C 40°C 45°CC Crecimiento en NaCI al 0,5% NaCI a! 4,0% Lactosa Manitol Rafinosa Arginina Bilis-escuiina LAP + PYR + \/ancomicina (30 pg)

L lactis subesp. cremoris

P ru e b a

L a c to c o c c u s

L. garveiae

Cuadro 43-30. D ifere n cia ció n de esp e cies de

G G NG

G NG NG

G V+ NG

G NG NG

NG G A V+

NG NG A

NU NG

NG NR A A A

NG G

NG G A v-

+ + + + S

+ +

+ + + + S

+ + + S

NG NG A V A v+ + + S

+ + + S

499

+ S

A -

a, alfa; G, crecimiento; NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; SBA, agar con sangre de oveja; V, resul tados variables; V+, variable, por lo común positivo, V", variable, por lo común negativo; A, producción de ácido (+); S, sensible (susceptible); LAP, leucina aminopeptidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa. Datos de la referencia 26. a Streptococcus lactis subesp Hacetilactis y Lactobacillus xylosus son sinónimos de Lactococcus lactis subesp. lactis (

20 ) .

6 Se recomiendan las pruebas de temperatura en el desarrollo para diferenciar lactococos de estreptococos y enteroco-

cos. c La mayoría de las cepas

no crecerán a 45°C en < 48 h (19).

GÉNERO: LEUCONOSTOC (26, 33, 40) Cocos grampositivos que son más largos que anchos cuando se disponen en los pares y cadenas ca racterísticos; en ocasiones bacilos cortos con extremos redondeados en cadenas largas No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 20-30°C Crecimiento lento; colonias pequeñas; crecimiento con formación de “slime” en los medios que contie nen sacarosa Se asemejan a estreptococos viridans desde el punto de vista morfológico 11 especies: L. argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. fallax, L. gelidum, L. lactis, L. mesenteroides, L. mesenteroides subesp. cremoris, L. mesenteroides subesp. dextranicum, L. mesenteroides subesp. mesenteroides, L. pseudomesenteroides Especie tipo: L. pseudomesenteroides subesp. mesenteroides ATCC 8293, NCIB 8023

50 0

E s q u e m a s d e id e n tific a c ió n

L. mesenteroides subesp. cremoris

L. mesenteroides subesp. dextranicum

L. mesenteroides subesp. mesenteroides

L. pseudomesenteroides

Prueba

Crecimiento a 372C Pigmentación (amarillo limón) n o 3 -> n o 2 Hemolisis en SBA al 5% Arabinosa Fructosa Maltosa Melibiosa Salicina Sacarosa Trehalosa Arginina Indol Esculina LAP PYR Vancomicina (30 pg)

NG v-

V +

A A V V A

A A A A A A

Y V A A V+ V V A

A A A

A A

A A A

A A V A A A A

A -

L lactis

L. gelidum

V +

L carnosum

L. citreum

Cuadro 43-31. Diferenciación de las especies de Leuconostoc aisladas con más frecuencia

A A A V A A

V V -

V, reacciones variables; V+, variable, por lo común positivo; V- , variable, por lo común negativo; G, crecimiento; NG, sin crecimiento; A, producción de ácido (+); R, resistente; LAP, leucina aminopeptidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa; y, gamma (ausencia de) hemolisis. Datos de las referencias 26 y 33.

GÉNERO:

L IS T E R IA

(26, 33, 40)

Bacilos grampositivos, cortos, no ramificados, con extremos redondeados; algo más pequeños que la m a yoría de los bacilos grampositivos. Las células más viejas son gramvariables. Pueden aparecer con for ma cocoide. Dispuestos en forma aislada y en cadenas cortas; raras veces como filamentos largos ex cepto en cultivos viejos. Pueden estar dispuestos en pares que causan confusión con Streptococcus pneumoniae No formadores de esporas Aerobios a anaerobios facultativos Catalasa positivos; producen citocromos; cepas ocasionales negativas (26) No encapsulados Móviles cuando crecen a 20-25°C (temperatura ambiente) en caldo nutritivo; movilidad caracterís tica, ya que dan vueltas de uno de sus extremos al otro en las preparaciones húmedas; 5 flagelos peritricos Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) u O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-37°C No son ácido-alcohol resistentes Ausencia de ácido micólico en las células 8 especies: L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. ivanovii subesp. ivanovii, L. ivanovii subesp. loncloniensis, L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri Especie tipo: L. monocytogenes ATCC 15313, NCTC 10357 (no hemolítica) Colonias grises azuladas con la iluminación normal y en agar nutritivo, característico brillo azul verdoso con luz transmitida oblicua L. monocytogenes: zona estrecha de (3-hemólisis y prueba de CAMP positiva. L. monocytogenes se di ferencia de los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) por ser catalasa positivo y por hidrólisis de la esculina positiva. Sólo L. monocytogenes causa infección en los seres humanos (33); L. ivanovii cau sa ocasionales abortos en los animales; cuestionable en los seres humanos. Las otras especies no son

B a c te r ia s g r a m p o s itiv a s

501

patógenas. Se propone que L. monocytogenes y L. ivanovii sean consideradas CAMP positiva con R. equi (exhiben formas circulares o en raqueta y formas semicirculares o en pala, respectivamente)

Cuadro 43-32. Diferenciación de e sp e c ie s d e Listeria3___________________________________ en o c

Catalasa P hemolisis, 5% SBA CAMP w/S. aureush CAMP w/R. equih H2S/TSI H2S PbAc1 Reducción de los nitratos Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Manitol a-metil-D-manósido Ribosa Ramnosa Almidón soluble Xilosa Otras pruebas Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C Hidrólisis del hipurato Indol Rojo de metilo (MR) U reasa Voges-Proskauer (VP) Patoqenicidad para el ratón

> O C CC > _]

+ +e

L welshimei

P ru e b a

Is O)

O >s O o c o E _j

L seeligeri

-D _

L. innocua

0 O)

+ +W,f

+ +f.g +

A A A A V

A A

A V

A NR

V NR A

A -

NR A

+w, débilmente positivo; A, producción de ácido (+); V, resultados variables; NR, no se dispone de resultados. Datos de las referencias 26, 33, 40. a Las especies de Listeria a menudo se confunden con Brochothrix, Erysipelothrix, Lactobacillus y Kurthia (49); Listeria denitrificans fue transferido al género Jonesia, Jonesia denitrificans. b L. grayiy L. murrayi se combinan en una única especie, L. grayi. c L. ivanovii separada en L. ivanovii y L. ivanovii subesp. londoniensis por dos hidratos de carbono; L. ivanovii es ribosa positivo (A) y manosamina negativo (-); L. ivanovii subesp. londoniensis es ribosa negativo (-) y manosamina positivo (A ).

" Unica especie patógena para los seres humanos; sin embargo, deben identificarse a nivel de especie debido a que todas las especies pueden contaminar los alimentos, pero sólo L. monocytogenes es de interés en salud pública. e Zonas amplias o múltiples. f Zonas estrechas. 9 Cepas ocasionales son negativas para (3-hemólisis. h Prueba CAMP con Staphylococcus aureus y fíhodococcus equi. ' La prueba del acetato de plomo es más sensible que el medio TSI para la detección del H2S. ' Pequeña cantidad. k Resultado positivo en pocas horas.

GÉNERO: MICROBACTERIUM (26, 33) Bacilos grampositivos delgados, irregulares en cultivos jóvenes; dispuestos en forma aislada o en pares con algunos dispuestos en ángulo para dar una formación en V No formadores de esporas Aerobios; anaerobios débiles crecimiento posible C atalasa positivos No encapsulados Movilidad variable, por lo común negativa; si es positiva, 1-3 flagelos. Sólo las especies pigmentadas de naranja

502

E squem as

de identificación

M. impértale y M. arborescens son móviles a 28°C (19) O/F de la glucosa: O (oxidativos) o F (débilmente fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30°C No son ácido-alcohol resistentes Ausencia de ácido micólico en las células CAMP variables; en ocasiones M. arborescens es CAMP positivo (19) Esculina positiva, pero puede ser tardía 6 especies: M. arborescens, M. aurum, M. dextranolyticum, M. imperiale, M. lacticum, M. laevaniformans Especie tipo: M. lacticum ATCC 8180, NCIB 8540

Cuadro 43-33.

D ife re n c ia c ió n d e a lg u n a s e s p e c ie s d e

P rue ba

M. arborescens

M. imperiale

NO, NO, H2S DNasa Arabinosa Sacarosa Xilosa

—

+ + Aw Aw Aw

+ A A V

Microbacterium M. lacticum M. laevaniformans + + + + -

A -

A, producción de ácido (+); Aw, débilmente ac.do

GÉNERO: MICROCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos dispuestos en pares, tétradas o racimos irregulares; no en cadenas No formadores de esporas

Aerobios estrictos (obligados) Catalasa positivos No encapsulados Inmóviles Oxidasa variables; por lo común positivos pero débiles O/F de la glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-37°C Colonias pigmentadas de rojo-amarillo variable

Resistentes a la lisostafina 2 especies: M .luteusyM . lylae Especie tipo: M icrococcus luteus ATCC 4698, NCIB 9278, NCTC 2665

Cuadro 43-34.

D ife re n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e

Micrococcus

P ru e b a

M. luteus

M. lylae

Catalasa Hemolisis 5% SBA Pigmentación, 5% SBA Oxidasa

+ y Amarilla +

+ Ácido en aerobiosis de Glucosa y Crema-blanca Glicerol + Lactosa Galactosa Mañosa G Arginina dihidrolasa Citrato (Simmons) G ONPG G Hidrólisis de la esculina V Licuefacción de la gelatina Movilidad Lisozima Bacitracina (0,04U)a

NOg -» N 0 2 Crecimiento a 37°C Crecimiento en NaCI al 6,5% NaCI al 7,5% NaCI al 10%

G G G V

P ru e b a

M. luteus

M. lylae

S S

RS S

y, gamma hemólisis (ausencia de hemolisis); SBA, agar con sangre de oveja; V, resultados variables; G, crecimiento; S, sensible; RS, levemente resistente; U, unidades. Datos de las referencias 26, 33 y 40. a Sensibilidad a la bacitracina > 10 mm.

B a c te r ia s g r a m p o s itiv a s

503

Género: M o b ilu n c u s (26, 41) Bacilos gramvariables delgados, curvos, con extremos fusiformes. Gramvariables o gramnegativos, pero la pared celular es del tipo grampositivo. Variables en forma y tamaño y se disponen en forma aisla da, pero a veces en pares con aspecto de ala de gaviota. No formadores de esporas

Anaerobios No encapsulados Catalasa negativos M óviles por flagelos multilaterales o subpolares Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos); débiles Temperatura óptima de crecimiento: 37°C Presencia de ácido micólico en las células; más grande y más complejo (C60-C90) 4 especies: M. curtisii, M. curtisii subesp. curtisii, M. curtisii subesp. holmesii, M. mulieris Especie tipo: M. curtisii subesp. curtisii ATCC 35241 No figura en el Bergey’s M anual o f Systematic Bacteriology, establecido por Spiegel y Roberts (41); el género puede ser un sinónimo de Falcivibrio (41)

Cuadro

4 3 -3 5 . D ife re n c ia c ió n d e e s p e c ie s d e M obiluncus

M. curtisii P ru e b a

subesp. curtisii

subesp. holmesii

M. mulieris

NO, NO, h 2s Glucosa Fructosa Lactosa Maltosa Manitol Ribosa Almidón Arginina-NH Hidrólisis de la esculina Hidrólisis del hipurato Indol Hidrólisis del almidón

—

y-vw yvw

y-VW

y -v w

yvw

yvw yvw

Aw -

V V A

vw v

A, producción de ácido (+); w, si es positivo, reacción débil; vw, si es positivo, reacción muy débil; V, resultados variables; V” , variable, por lo común negativo.

GÉNERO: M YCOBACTERIUM (26, 33, 40) Bacilos grampositivos delgados, rectos o ligeramente curvos. No se tiñen con facilidad con la colora ción de Gram; débilmente positivos, pero por lo común no se tiñen. Algunas veces exhiben fila mentos ramificados o crecimiento símil micelio sólo visible con aumento No formadores de esporas Aerobios; crecimiento lento, 2-60 días

Catalasa positivos No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-45°C

Acido-alcohol resistentes 83 especies Algunas especies son exigentes y requieren suplementos especiales para el crecimiento (p. ej., M. para tuberculosis) o no son cultivables en los medios habituales para micobacterias (p. ej., M. leprae) Especie tipo: M. tuberculosis ATCC 27294 (.Nota: El cultivo y la identificación de las micobacterias no se realizan de manera sistemática en la m a yoría de los laboratorios; por lo común se realizan en laboratorios más grandes (p. ej., laboratorios de

504

Esquemas de identificación

salud pública). La identificación a nivel de especie requiere pruebas bioquímicas extensas. Véase el Bergey’s M anual o f Systematic Bacteriology, vul. 2, para las especies y pruebas de identificación.) GÉNERO: N O C A R D IA (26, 40) Bacilos grampositivos a gramvariables; pueden ser cocoides Producción de micelios e hifas aéreas; algunos filamentos ramificados. Las bacterias pueden fragmen tarse en bacilos y cocos (19) No formadores de esporas Aerobios obligados (estrictos); mesófilos

Catalasa positivos O/F de la glucosa: O (oxidativos) Inmóviles

Acido-alcohol resistencia variable, por lo común positiva Nitrato variables Presencia de ácido micólico en las células 14 especies: N. asteroides, N. brasiliensis, N. brevicatena, N. carnea, N. coeliaca, N. corynebacterioides, N. farcinica, N. globerula, N. nova, N. otitidiscaviarum, N. pseudobrasiliensis, N. seriolae, N. transvalensis, N. vaccinii Especie tipo: N. asteroides ATCC 19247

N transvalensis

NG + +

V+

N nova

v+ -

N. farcimca

N. brasiliensis

42°Ca Hidrólisis de la caseína Hidrólisis de la tirosina Hidrólisis de la xantina Ramnosa Arilsulfatasab Hidrólisis de la gelatina

N asteroides

Prueba

N otitidiscaviarum

Cuadro 43-36. C a ra c te rís tic a s b io q u ím ic a s d e la s e s p e c ie s d e Nocardia a is la d a s c o n m á s fre c u e n c ia

V+

G V

—

V+

—

+ -

G, crecimiento; NG, sin crecimiento; V+, reacción variable, por lo común positiva; V , reacción variable, por lo común ne gativa. Datos de la referencia 19. a Después de 3 días de incubación. b Después de 14 días de incubación.

GÉNERO: O E R S K O V IA (26, 40) Las especies de Oerskovia fueron transferidas al género Cellulomonas y se eliminó el género Oerskovia. GÉNERO: P A E N IB A C IL L U S (19) Bacilos grampositivos

Formadores de esporas; las esporas distienden el esporangio Aerobios 26 especies: P. aliginolyticus, P. alvei, P. am ylolyticus, P. apiarius, P. azotofixans, P. campinasensis, P. chibensis, P. chondroitinus, P. curdlamolyticus, P denitritiformis, P. glucanolyticus, P. illinoisensis, P. kobensis, P. larvae, P. larvae subesp. larvae, P. larvae subesp. pulvifaciens, P. lautus, P lentimorbus, P. macerans, P. macquariensis, P. pabuli, P. peoriae, P. polymyxa, P. popilliae, P. thiaminolyticus, P. validus Especie tipo: P polymyxa ATCC 842, CCM 1459, NCTC 10343

Bacterias grampositivas 505 Cuadro 4 3 -3 7 . C a ra cte rística s b io q u ím ic a s de la s e sp e cie s de P aen ibacillu s a isla d a s con m á s frecue ncia Prueba

P. alvei

P. macerans

P. polymyxa

Anaerobiosis Glucosa Manitol Xilosa Citrato Indol Lecitinasa

G A A A

G A V A

+ -

—/wa

A, producción de ácido (+); G, crecimiento; V, reacción variable. a Débil, sólo visible debajo de las colonias.

GÉNERO: P E D IO C O C C U S (26, 33, 40) Cocos grampositivos dispuestos en pares o tétradas, nunca alargados No formadores de esporas Anaerobios facultativos Por lo común catalasa negativos; carecen de citocromos No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-40°C NaCl al 6,5%: crecimiento variable No crece a 10° ni a 45°C LAP positivos PYR negativos Bilis-esculina positivos No patógenos para los seres humanos; a menudo confundidos con micrococos; similares desde el punto de vista morfológico. La mayor parte de las especies aisladas son positivas frente a la reacción de

arginina 7

especies: P. acidilactici, P. damnosus, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. urinaeequi Especie tipo: P. damnosus ATCC 29358, NCDO 1832

506

P ru e b a

R acldilactici

P. damnosus

P d e xtrn icu s

P inopinatus

P parvulus

P pentosaceus

P urinaeequi

Catalasa n o 3 -> n o 2 Crecimiento a 10°C 35°C 40°C 50°C Crecimiento a pH 4,2 pH 7,5 pH 8,5 Crecimiento en NaCI al 4% NaCI al 6,5% NaCI al 18% L-Arabinosa Dextrán Glicerol Almidón Indol Arginma Hidrólisis de la esculina Hidrólisis del hipurato LAP PYR Vancomicina (30 pg)

—

NG G G G

NG NG NG NG

NG G G NG

NG G NG NG

NG G G NG

G G V

G NG NG

NG G NG

NG V NG

G G NG

G G V

NG G G

G G NG V 4

NG NG NG

G NG NG

G V NG

G G NG

G G NG A

G G NG V A

—

■

+ +

—

G, crecimiento; NG, sin crecimiento, V, resultados variables, A, producción de ácido (+), LAP, leucina aminopeptidasa, PYR, pirrolidomla rilamidasa, R, resistente Datos de las referencias 26, 40

Esquemas de identificación

Cuadro 43-38. D ife re n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e Pediococcus

Bacterias grampositivas 507 GÉNERO: PEPTOCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos esféricos dispuestos en pares, tétradas, gramos, masas irregulares o cadenas cortas No formadores de esporas

Anaerobios estrictos (obligados) Por lo común catalasa negativos; pueden ser débilmente positivos No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (débilmente fermentativos) o - (inertes) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C Indol negativos Nitrato no reducido Coagulasa negativos Esculina negativos Almidón negativos Ureasa negativos Hidratos de carbono: no atacados

Producción de H2S a partir de las peptonas (medio de sulfuro-indol-movilidad) Requiere medios enriquecidos desde el punto de vista nutricional Pigmentación negra en agar sangre; pueden variar del color negro al verde oliva al mostaza. La pigmen tación puede no visualizarse a simple vista; utilizar microscopia de disección. La pigmentación se acla ra con rapidez cuando se expone al aire. La pigmentación débil o las colonias más viejas exhiben un color mostaza 1 especie: P. niger ATCC 27731. Rara vez recuperado de fuentes humanas (86) P. niger se diferencia de las especies de Peptostreptococcus por la pigmentación negra y la reacción de catalasa

GÉNERO: PEPTOSTREPTOCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos o gramvariables que en ocasiones presentan una forma ovoide con disposición va riable: pares, tétradas, grumos o cadenas Las células jóvenes de P. anaerobius son elongadas en cadenas (33). mis células de P. productus pueden ser elongadas; se asemejan a cocobacilos (33). P. vagin*lis, P. lacrimalis, P lactolyticus y P. hydrogenalis, cadenas cortas o masas No formadores de esporas

Anaerobios Catalasa negativos; pocas cepas producen una reacción débil o una reacción de seudocatalasa (p. ej., P. asaccharolyticus) No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C

Requiere medios enriquecidos desde el punto de vista nutricional 16 especies: P anaerobius, P. asaccharolyticus, P. barbesae, P. hard, P. heliotrinreducens, P hydrogenalis, P. indolicus, P. ivorii, P. lacrimalis, P. lactolyticus, P. magnus, P. micros, P. octavius, P. prevotii, P. tetradius, P vagin*lis Especie tipo: P. anaerobius ATCC 27337

508

Esquemas de identificación

Cuadro 43-39.

D ife r e n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e in fe c c io n e s h u m a n a s

Peptostreptococcus

q u e p u e d e n p r o d u c ir

NR NR

Awo V - 0 +w V + -

P vagin*lis

NR NR

V V Aw

V -

— + -

V -

P tetradius

+ -

P prevotii

NR A A A NR A NR + NR NR NR

P micros

NR NR

P lactolyticus

P hydrogenalis

+ -

+ + -

NR NR NR NR NR NR

C/5 3 C O) ce £ □_

_ +d +d -

§ < 0

+ -

NR A A NR A NR NR NR NR

P lacrimalis

V +d -

P indolicus

1 1

O >

O CC .£= O O ce cn ce Q_

0 1

O > s*

g
NO 2 Glucosa Lactosa Celobiosa Maltosa D-Manosa Sacarosa Indol Escullna U reasa Fosfatasa alcalina a-Glucosidasa P-Glucuronidasa Amoníaco a partir de: Glutamato Glicina

i O > £

P ru e b a

P anaerobius 3-15

-O C/) D

V NR A Aw A Aw A NR A NR —0 +w NR + NR _ NR +w NR + NR -

NR NR

V, resultados variables; NR, no se dispone de resultados; A, producción de ácido (+); Aw, débilmente ácido. Datos de las referencias 26, 33, 40. a R a n a e r o b i u s presenta un olor dulce picante (33). b Más comunes (33): P . m a g n u s , P . a n a e r o b i u s y P . a s a c c h a r o i y t i c u s c P . a s a c c h a r o i y t i c u s presenta una leve pigmentación amarilla en agar sangre (BA) (33). d C e p as ocasionales son negativas.

GÉNERO: PROPIONIBACTERIUM (2, 26, 33, 40) Bacilos grampositivos, cortos, rectos, uniformes o pleomórficos con extremos redondeados; “difteroides anaerobios”. En cultivos jóvenes, delgadas ramificaciones; en cultivos más viejos, bacilos cortos con un extremo redondeado, otros fusiformes o cocobacilares, pueden simular estreptococos. Se colorean de manera menos intensa; pueden tener un aspecto en cuentas de collar. Dispuestos en pares, en con figuración Y y V, en líneas paralelas formando empalizadas, con células esféricas hinchadas o en

grumos con aspecto de “letras chinas” No formadores de esporas

Anaerobios obligados (estrictos); algunas cepas aerotolerantes pueden crecer mejor en anaerobiosis Catalasa variables; por lo común positivos No encapsulados Inmóviles Reducción de los nitratos variable O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento; 30-37°C CAMP positivo: P. acnés', CAMP variable: P. granulosum No son ácido-alcohol resistentes 12 especies: P. acidipropionici, P. acnés, P. avidum, P. cyclohexanicum, P. freudenreichii, P. freudenreichii subesp. freudenreichii, P. freudenreichii subesp. shermanii, P. granulosum, P jensenii, P. lymphophilum, P. propionicus, P. thoenii Especie tipo: P. freundenreichii subesp. freudenreichii ATCC 6207, CCM 1857, N CTC 10470

Cuadro

4 3 -4 0 . C a racterísticas dife ren ciales de la s especies de P ropionibacterium a isla d a s con m ás frecue ncia

Prueba

Pigmentación de la colonia Catalasa p-hemóllsls en SBA al 5% NO, -4 NO, Hidratos de carbono Amigdalma l-Arabinosa Celoblosa Glucosa Glicerol Maltosa Manltol Sacarosa Otras pruebas Indol Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina CAMP w/S. aureus

P. propiomcusa

P acidipropiomci

Blanca-grisblanca +

Crema-blanca - Blanca-gris amarilla V+ V+ V + +

A A A A A A A

V+

A V+

A A A vA

A A -

— -

A Vb A A A

P. acnés

P. avidum

+ +c -

P. granulosum

Blanca-crema Crema-tostada Blanca-gris o rosa + + + + V V

+° +

P freudenreichii

P jensemi

P lymphophllum

Crema-bíanca- Blanca rosa v+ V+

P thoenii Naranja-rojacastaña + +

V+

V-

—

A A A V+ A

A A A A A

A A A

A ra c h m a

sea eliminado y

B acterias gram positivas

V, resultados variables; V +, variable, por lo común positivo; V “, variable, por lo común negativo, SBA , agar con sangre de oveja, A, producción de ácido (+) Datos de las referencias 26, 33, 40. a Antes A c t i n o m y c e s p r o p i o m c a y m ás tarde una única especie en el género A r a c h m a Charfreitag, Collins y Strackebrandt (5) recomiendan que el género la única especie sea transferida al género P r o p i o m b a c t e r i u m como P p r o p i o n i c u s . b Serovariedad 1, variable, serovariedad 2, por lo común negativa c Fuerte.

509

510

Esquemas de identificación

GÉNERO: RO D O C O C CU S (26, 40) Bacilos o cocos grampositivos; bacilos a un micelio vegetativo extensamente ramificado; fragmentos de bacilos No formadores de esporas Aerobios Catalasa positivos Inmóviles O/F de la glucosa: NF (no fermentativos) Reducción de los nitratos variable Ureasa: variables Presencia de ácido micólico en las células

Por lo común parcialmente ácido alcohol resistentes 12 especies: R. coprophilus, R. equi, R. erythropolis, R.fascians, R. globerulus, R. marinonascens, R. opacus, R. percolatus, R. rhodnii, R. rhodochrous, R. ruber, R. zopfii Especie tipo: R. rhodochrous ATCC 13808, NCTC 10210 íntimam ente relacionado con especies de Corynebacterium, M ycobacterium y Nocardia

GÉNERO: ROTHIA (26, 33, 40) Bacilos grampositivos irregulares, coloreados de manera no uniforme; deformaciones irregulares y extre mos en forma de clavas que dan un aspecto cocobacilar; bacterias corineformes. Pueden ser bacilos fi lamentosos con ramificaciones después de varios días de incubación en medios líquidos No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa positivos Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C Presencia de ácido micólico No son ácido-alcohol resistentes 1 especie: R. deníocaríos a ATCC 17931 Se diferencia de las especies de Nocardia por su capacidad de fermentar los hidratos de carbono CDC Grupo 4: microorganismos símil R othia: H2S positivos y licuefacción de la gelatina positivos Cuadro 43-41. C a racterísticas b io q u ím ica s de R othia den tocario sa -> n o 2 Lactosa Maltosa Mañosa Sacarosa Xilosa no3

+ -

A -

Esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C Indol Ureasa Voges-Proskauer (VP)

+ V -

V, resultados variables; A, producción de ácido (+).

GÉNERO: SA R C IN A (26) Cocos grampositivos dispuestos en paquetes cuboides de ocho o más elementos; algunas células en for m a aislada, en pares y en tétradas; por lo común aplanados en las áreas que contactan las células ad yacentes No formadores de esporas

Anaerobios estrictos (obligados) Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-37°C 2 especies: S. ventriculii y S. maxima Especie tipo: S. ventriculii ATCC 19633

Bacterias grampositivas 511 Cuadro 4 3 -4 2 . D ife re n cia ció n de las e sp e cie s de

S a rc in a

Prueba

S. ventriculii

S. maxim a

Formación de celulosa Producción de etanol Producción de butirato Melibiosa Xilosa

+ +

— -

A -

A, producción de ácido (+).

GÉNERO: STAPHYLOCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos dispuestos en forma aislada, en pares o en forma similar a racimos de uvas irre

gulares Coagulasa variables No formadores de esporas Anaerobios facultativos (excepto S. saccharolyticus que exhibe un desarrollo más rápido y abundante en condiciones de aerobiosis (40)) Catalasa variables; por lo común positivos (S. aureus subesp. anaerobius y S. saccharolyticus son catalasa negativos y por lo común sólo crecen en anaerobiosis) Cápsula variable; por lo común negativa, pero si se presenta, la formación de cápsula es limitada Inmóviles Oxidasa variables; por lo común negativos (S. caseolyticus, S. lentus, S. sciuri y S. vitulus son positivos con la reacción para oxidasa modificada) O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-37°C

Sensibles a la lisis por la lisostafina, pero resistentes a la lisozima 44 especies: S. arlettae, S. aureus subesp, anaerobius, S. aureus subesp. aureus, S. auricularis, S. capitis subesp. capitis, S. capitis subesp. ureolyticus, S. caprae, S. camosus, S. caseolyticus, S. chromogenes, S. cohnii subesp. cohnii, S. cohnii subesp. urealyticum, S. delphini, S. epidennidis, S. equorum, S.felis, S. gallinarum, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus, S. hyicus subesp. hyicus, S. intermedius, S. kloosii, S. lentus, S. lugdunensis, S. lutrae, S. muscae, S. pasteuri, S. piscifermentans, S. pulvereri, S. sac charolyticus, S. saprophyticus subesp. bovis, S. saprophyticus subesp. saprophyticus, S. schleiferi, S. schleiferi subesp. coagulans, S. schleiferi subesp. schleiferi, S. sciuri, S. sciuri subesp. carnaticus, S. sciuri subesp. rodentium, S. sciuri subesp. sciuri, S. simulans, S. vitulus, S. wam eri, S. xylosus Especie tipo: S. aureus subesp. aureus ATCC 12600, NCTC 8532 (Notas: S. aureus subesp. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. saprophyticus su besp. saprophyticus son las especies de Staphylococcus aisladas con más frecuencia asociadas con in fecciones humanas. S. lutrae es una especie nueva coagulasa positiva.) (véanse Cuadros 43-43, 43-44 y 43-45)

512

Esquemas de identificación

Cuadro 43-43. Diferenciación de las especies de Staphylococcus

a is la d a s c o n m á s fre c u e n c ia

S. schleiferi subesp coagulaos

S. schleiferi subesp schleiferi

S. saprophyticus sub esp. saprophyticus

+ -

G G

G V+

G G

Gw NG

G V

G G

G V

NR NR

G G

v -w

NR G

NR NR

NR G

DE'

V V V

+9 -

+ -

DS'

S. epiderm idis

S. haemolyticus

S- lugdunensis

— Catalasa 3 Oxidasab n o 3 -> n o 2 Pigmento de la colonia 0 Cápsula Crecimiento en: yw e Aerobiosis Anaerobiosis* G3 Crecimiento en agar con NaCI: 1 0 % (p/vol) G V 15% (p/vol) Crecimiento a : NR 15°C 45°C NG + Estafilocoagulasah Factor de agregación' NR Fibrinolisina + Nucleasa termoestable Hemolisinas (hemolisis) + DNasa + Ácido (en aerobiosis) a partir de: L-Arabinosa D-Celobiosa P-D-Fructosa A NR D-Fructosa D-Galactosa a-Lactosa Maltosa A D-Manitol D-Manosa D-Melecitosa Rafinosa D-Ribosa Salicina

S aureus subesp l aureus

Prueba

S aureus subesp. anaerobius

que producen infecciones en los seres humanos

+ -

V+ V

+ w -

+ _

+ d

G G

G Gw

v+ +

+ +

v~w

A -

NR NR

A -

NR NR NR

A A A A

A A

NR NR A V

V V

NR V

A V

A A A

—

Sacarosa

Trehalosa D-Turanosa Xilitol D-Xilosa

(continúa)

Bacterias grampositivas 513

S schleiferi sub e sp schleiferi

S lugdu nen sis

S h a em o lyticu s

S schleiferi sub esp co a g u la n s

+ + +

S . saproph yticus su b esp. saprophyticus

Fosfatasa alcalina + NR Arginina dihidrolasa + Hialuronidasa NR Ornitina descarboxilasa NR Pirrolidonil arilam idasa Hidrólisis de la esculina NR U reasa V oges-Proskauer (V P )° p-Glucosidasa p-Glucuronidasa p-Galactosidasa — P ruebas de sensibilidad R esistencia a la novobiocina9 R esistencia a la polimixina Bq N R

S e p id e rm id is

Otras pruebas"1

S a u re u s sub esp a u re u s

P ru e b a

S. a u re u s sub e sp a n a e ro b iu s

Cuadro 43-43. ( C o n tin u a c ió n ) V ,

v _w NR

+ + NR

+ + NR -

V+n

+ V V

+ NR -

NR + +

+ + +

+ + V

V + +

+ + V

—

V+

NR + NR NR NR

V+ V V —

+ -

+ +k -

V+

V, reacciones variables; V +, variable, por lo común positivo; V , variable, por lo común negativo; w, reacción débil; NR, no se dispone de resultados; A, resultado positivo con producción de ácido (+); p/vol, peso por volum en; DE, diferencia ecotipos; DS, diferencia subespecies no separadas en el cuadro. Datos de las referencias 26, 33, 40. a Producida por células que desarrollan en aerobiosis; cepas ocasionales son catalasa negativas; ausente en m utantes respiratorio deficientes. S. a u re u s subesp. a n a e ro b iu s es catalasa negativo y por lo com ún sólo crece en anaerobiosis. b Prueba de oxidasa m odificada para la detección de citocrom o c. c M edio de detección visual positivo de los pigm entos carotenoides (p. ej., amarillo, am arillo-naranja, naranja) durante el desarrollo de la colonia a tem peratura norm al o ambiente. La pigm entación no siem pre es una característica confiable para la identificación. d Las cepas encapsuladas producen colonias que son más pequeñas y m ás convexas que las de las cepas no encap suladas y que presentan un aspecto húm edo brillante (4). e En agar P o agar con sangre de bovino, de oveja o hum ana a 34-37°C, S. a u re u s subesp. a n a e ro b iu s crece con m u cha lentitud en presencia de aire; requiere el agregado de sangre, suero o yem a de huevo para el crecim iento en el ais lam iento prim ario en agar. f Sím bolos para el m edio de tioglicolato sem isólido: G, crecim iento m oderado o intenso en la porción inferior del tubo en 18-24 h; V, crecim iento denso en la porción superior del tubo y m enos crecim iento en la porción anaeróbica inferior; cre cim iento no visible en la porción superior del tubo en 48 h, pero crecim iento difuso débil o pocas células dispersas en la porción inferior en 72-96 h. 9 Si desarrolla, el crecim iento puede ser tardío. h C oagulasa libre; prueba en tubo; plasm a de conejo. ' C oagulasa ligada; prueba en portaobjeto; plasm a de conejo o humano. ¡ DE: diferencia ecotipos. k Tardío. 1DS: subespecies diferenciadas por pruebas, no separadas en el cuadro. m Detectadas sobre todo por pruebas com erciales, rápidas, diferenciales. "A ctiv id a d de fosfatasa alcalina negativa en alrededor de 6-15% de las cepas de S. e p id e rm id is , resultado que depen de de las m uestras de la población. 0 Acetoína. p Positivo: MIC > 1,6 pg/m L o un diám etro de la zona de inhibición del crecim iento < 16 mm con disco de novobiocina de 5pg. q Positivo: diám etro de la zona de inhibición del crecim iento < 10 mm con disco de polim ixina de 300 U.

514

Esquemas de identificación

Cuadro 43-44.

D ife re n c ia c ió n d e o tra s e s p e c ie s m e n o s c o m u n e s d e c a u s a r in fe c c io n e s e n lo s s e re s h u m a n o s y e n o tro s p rim a te s &

(f) O

P ru eb a

C a ta la s a c O x id a s a d n o 3 -> n o 2 P ig m e n to d e la c o lo n ia ' C á p s u la C re c im ie n to en A e ro b io s is A n a e ro b io s is 8 C re c im ie n to en a q a r c o n NaCI: 1 0 % (p/vol) 15% (p/vol) C re c im ie n to a 15°C 4 5 °C E s ta filo c o a g u la s a h F a c to r de a g re g a ció n ' F ib rin o lis in a N u c le a s a te rm o e s ta b le H e m o lis in a s (h e m o lisis) D N a sa A c id o (en a e ro b io s is ) a p a rtir de L -A rabinosa D -C elobiosa b-D -F ructosa D -Fucosa D -G alactosa a -L a c to s a M a lto sa D-M anitol D -M anosa D -M elecitosa R a fin o sa D -R ibosa S a lic in a S a c a ro s a T re h a lo s a D-Turanosa X ilitol D -Xilosa O tra s p ru e b a s 1 F osfa ta sa a lc a lin a A rg in in a d ih id ro la s a H ia lu ro n id a s a O rn itin a d e s c a rb o x ila s a P irro lid o n il a rila m íd a s a H id ró lis is de la e s c u lin a U rea sa

I
z >

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Varios Oral D Ninguno (XW a

Pyo Be

O "O

co =3

*3 CT (D

o 05 O 03 O CO r C

« o

Oral Oral Nin- NR guno NR Y

Otro NR

(y )-

+ -

Pyo, piógeno; NR, no se dispone de resultados; NG, sin crecimiento; V, resultados variables; V+, variable, por lo común positivo; V- , variable, por lo común negativo; S, sensible (susceptible); R, resistente; w, reacción débil. Datos de las referencias 26 y 40. a S. a g a la c tia e está encapsulado. b S. b o v is podría ser renombrado S. in u iin a c e u s (2). Incapaz de crecer en medios con sal. c Grupo “ S. m ille ri” compuesto de las tres especies denominadas antes como: S. a n g in o s u s , S. c o n s te lla tu s y S. in te rm e d iu s. (c o n tin ú a )

G G

G V V

V NG V

G NG V

V V V

G NR G

G NG NG

G NG V

G NR NG

NG NG

NR NG

NG V

NG V+

NG V

NR NR

NG G

G NG

NG NG

A V NR — A

A V VA A

V A A A A A

A A A A NR A A A

V+ A A NR A V+

A V+ V V NR A

A V A V NR V V

A A

A NR NR -

A A A y-

A -

A A A A

A V

V V'

+ +

NR +

V +

NR V

V +

— +

V+

G G

V G

G G

V NG V

G NG V

V NG V

G NG NG

NG V

G V

NG V

V' V

V+ V V V NR V+ V

A V — V NR V V V

A A A A NR A A A

+ V

V V

_ V

Varios Varios Oral Pyo D, InR o S cierto Occ E NR a a, y a, y a, p

G G

V G

Oral Ninguno

S vestibulari

G G

Oral Oral A menudo K H a a, y

-C CL O E a> jr

S uberis

G G

Oral Nin guno

S. suis

Pyo E, P, U oV P- Y

S sobrinus

Oral Ninguno a, p

S sanguis

Oral Ninguno a

Oral Ninguno

S ratti

Oral Ninguno a, y

CL co

S porcinus

Oral Occ FoG a

C O E D

S. oralis

S mitis

S. mutans

S salivarius

Bacterias grampositivas 527

V+

NR A ~ A

Sol

NR V

NR +

_ +

_ V

NR NR NR

V -

NR NR NR

+ + -

NR NR NR

V _

—

NR NR

V+

—

+ -

NR R

R R

NR R R

+ NR

NR NR NR NR R

d S. p n e u m o n ia e está encapsulado. e S. a g a la c tia e puede m ostrar reactividad serológica cruzada entre los grupos B y G (40). 1Medio de tioglicolato. 9 La prueba CAMP es un fenóm eno lítico denom inado más tarde por las iniciales de sus autores originales: Christie, Atkins y Munch-Petersen. El factor CAM P no es específico para el grupo B; puede ser positivo con los grupos C, F y G; una prueba para la hem olisis sinérgica. h Si es positivo, puede ser tardío.

528

Esquemas de identificación

GÉNERO: TURICELLA (33) Bacilos grampositivos, largos, irregulares, pleomórficos No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa positivos No encapsulados Inmóviles Ausencia de ácido micólico en las células Necesitan suero para su crecimiento Característica clave: C A M P positivos 1 especie: T. otitidis DSM 8821 Según Ruimy y col. (35), la validez es dudosa ya que el género Turicella claramente pertenece al género Coiynebacterium.

Cuadro 43-50. Características bioquímicas de Turicella otitidis -> n o 2 CAMP Esculina U reasa no3

Glucosa Lactosa Maltosa Mañosa Sacarosa

~ -

GÉNERO: VAGOCOCCUS (26, 33, 40) Cocos grampositivos, ovales, o bacilos cortos; dispuestos en forma aislada, en pares o en cadenas cortas No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa negativos No encapsulados M ovilidad variable, por lo común positiva; flagelos peritricos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-35°C Algunas especies pertenecen al gm po N de la clasificación serológica de Lancefield La patogenicidad no es clara El género no está incluido en el M anual de Bergey; establecido por Collins y col. (8) 2 especies: V.fluvialis y V. salmoninarum Especie tipo: V. fluvialis ATCC 49515, NCDO 2497

Cuadro 43-51. Diferenciación de las especies de Vagococcus Prueba V. salmoninarum V. fluvialis LAP h 2s Crecimiento a 40 C Glicerol Sorbitol

+ -

G V A

+ + NG -

V, resultados variables; A, producción de ácido (+); G, crecimiento; NG, sin crecimiento.

GÉNERO: XANTHOBACTER (26, 40) Bacilos grampositivos o gram variables; pleomórficos. Pared celular de tipo gramnegativo No formadores de esporas Aerobios obligados (estrictos)

Catalasa positivos Movilidad variable; flagelos peritricos Temperatura óptima de crecimiento: 25-30°C No son ácido-alcohol resistentes 4 especies: X. agilis, X. autotrophicus, X. flavus, X. tagetidis Especie tipo: X. autotrophicus ATCC 35674

Bacterias grampositivas 529 ADVERTENCIAS Cuando se utilizan los cuadros de identificación sea consciente de que los resultados mencionados fue ron compilados a partir de las referencias citadas. No obstante, los microorganismos vivientes a menudo dan resultados contradictorios debido a la mutación o al tipo de medio utilizado para el aislamiento, el cultivo, la identificación y el mantenimiento de los mismos. Con frecuencia, la identificación apropiada del género o del género y la especie requiere algunas con sideraciones: a) la muestra o fuente clínica, b) la morfología en la coloración de Gram y c) las caracterís ticas del cultivo (p. ej., pigmentación, hemolisis) junto con las pruebas bioquímicas. En algunos casos se requieren comprobaciones serológicas y de toxinas para la confirmación. Es necesario ser flexible cuando se interpretan los resultados bioquímicos. Todos los microorganismos no siempre exhiben todos los resultados de la batería de pruebas bioquímicas que figuran en los cuadros. A veces es necesario “el mejor encaje” para la identificación. Cuantos más resultados puedan obtenerse, mejores posibilidades de una identificación correcta.

530

Esquemas de identificación

Diagrama 43-1.

Separación de las bacterias grampositivas por la forma. Bacilos

Especies de Abiotrophia? Especies de Acetobacterium Especies de Actinom yces Especies de Am ycolatopsis Especies de A rcanobacterium 1 Especies de A rth 'o b a c te fi 5 Especies de Aureobacteríum Especies de Bacillus Especies de Bifídobacteriurrfi Especies de Brevibacillus Especies de Brevibacterium 4 Especies de Brochothrix4 Especies de Butyrivibrio Especies de Cellulom onas ( Oerskovia )45 Especies de Clostridium Especies de C orynebacterium (Caseobacter) polym orphus

Especies de C orynebacterium Derm abacter hominud?6 Erysipelothrix rhusiopathiae Especies de Eubacterium 5 Especies de Falcivibrio G ardnerella vagin*lis Especies de Gordonia5 Jonesia denitrificans* Especies de Kurthia4 Especies de L a cto b a cillu s Especies de LeuconostoS Especies de Listeria 9 Especies de M icrobacterium Especies de M obiluncus Especies de M ycobacterium Especies de Nocardia 7 Especies de Paenibacillus Propionibacterium (Arachnia propionica) propionicus Especies de Propionibacterium Especies de R hodococcuS Rothia de n to ca rio sS Especies de Tsukam urella12 Turicella otitidis 13 Especies de Vagococcus5 Especies de X anthobactei 6

Véase diagrama 43-2

Cocos (esferas)

Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de Abiotrophia de A erococcus de Alloiococcus de Arcanobacterium 1 de A rth ro b a c te fi 5 de Bifidobacterium 3 de Brevibacterium 4 de Brochothrix4 de Cellulom onas4? de Clostridium 13 de Coprococcus

C orynebacterium (Caseobacter) polym orphus Especies de Corynebacterium Especies de Deinococcus Derm abacter ho m in u S ? Especies de Enterococcus 11 Especies de EubacteriurrP Especies de Exiguobacterium Especies de Gemella Globicatella sanguis Especies de Gordonia 5 8 Helococcus kunzii Jonesia denitríficans4 Especies de Kurthia4 Especies de Lactobacillus? Especies de Lactococcus Especies de LeuconostoS Especies de Listeria 9 Especies de M icrococcus Especies de Nocardia1 Especies de Pediococcus Peptococcus niger Especies de Peptostreptococcus? Especies de Piopionibacterium 10 Especies de Rhodococcus5 Rothia dentocariosaP Especies de Sarcina Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de Streptococcus Especies de Tsukam urella 12 Turicella otitidis 13 Especies de Vagococcus? Especies de X anthobactei 6

Véase diagrama 43-32

1 Los cultivos viejos de Arcanobacterium exhiben bacilos y cocos irregulares y son difíciles de distinguir de las especies de Corynebacterium. 2 En la etapa estacionaria, casi todas las células de las especies de Arthrobacterson cocoides. 3 Las células viejas de las especies de Bifidobacterium presentan formas cocoides hinchadas 4 Las células de cultivos viejos aparecen con forma cocoide. 5 Formas de bacilos y cocos. 6 Las células de Dermabacter hominus son difíciles de distinguir de las especies de Corynebacterium 7 Pueden aparecer cocoides. 8 Las células pueden tomar un aspecto cocobacílar. 9 Las células de Listeria pueden aparecer cocoides; dispuestas en pares y a menudo confundidas con células de Strep

tococcus pneumoniae. 10 Los cultivos viejos exhiben bacilos cortos con extremos redondeados a menudo fusiformes o cocobacilares y pueden

parecer estreptococos; “dlfteroides anaerobios”. 11 En ocasiones cocobacilos cuando se cultiva y colorea con Gram a partir de un crecimiento en agar. 12 Las especies de Tsukamurella pueden fragmentarse en bacilos y cocos (19). 13 Bacilos pleomórficos.

Bacterias grampositivas 531 Diagrama 43-2.

Diferenciación de bacilos grampositivos por los requerimientos de oxígeno (0 2). Aerobios/anaerobios facultativos

Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de de

Actinom yces Am ycolatopsis ArcanobacteriurrP Aureobacterium Bacillus3 Bifidobacterium * BrevibacteriurrP Brochothrix Clostridium carnis1 Clostridium histolyticum 1 Clostridium tertium 7 Especies de C orynebacterium Derm abacter hominus Prysipelothrix rhusiopathiae G ardnerella vagin*lis Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia3 Especies de L a c to b a c illu s 9 Especies de Leuconostoc Especies de Listeria Especies de M icrobacterium 10 Especies de M ycobacterium 12 Especies de Nocardia5 Especies de Propionibacterium 11 Especies de Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Tsukamurella5

Anaerobios Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de de de de

A rcanobacteriurrf Bifidobacterium 4 Butyrivibricri Clostridium 7 EubacteriurrP Falcivibrio L a cto b a cillu S 9 M icrobacterium 10 M obiiuncus Propionibacterium 11

__________ Véase diagrama 43-3___________________________Véase diagrama 43-16___________________ 1 Los géneros Abiotrophia, Acetobacterium, Arthrobacte', Brevibacillus, Cellulomonas, FaenibaciHus, Turicella, Vagococ-

cus y Xanthobacter no están incluidos en ningún esquema posterior de bacilos grampositivos. 2 En anaerobiosis crecen mejor que en aerobiosis. 3 Algunas especies son aerobios obligados (estrictos) (p. e ;, B firmus, B. megaterium, B. sphaericusy B. subtilis) (33). 4 Pocas especies pueden crecer en aire con C 0 2 al 10%. 5 Aerobios obligados (estrictos). 6 Anaerobios obligados (estrictos). 7 Pocas especies capaces de crecer en aire; aerotolerantes (p. ej,, C. carnis, C. histolyticum y C. tertium). 8 El 20% de los microorganismos son anaerobios obligados (estrictos) (33); en ocasiones microaerófilos. Crecen mal en

presencia de aire; el desarrollo se incrementa con la reducción de la tensión de oxígeno. El aislamiento de algunos anae robios aumenta con el C 02. 9 Anaerobios facultativos o anaerobios obligados (estrictos). 10 Las especies de Microbacterium son aerobias; es posible un crecimiento débil en anaerobiosis. 11 Algunas cepas aerotolerantes, pero crece mejor en anaerobiosis. 12 Crecimiento lento; 2-60 días.

532

Esquemas de identificación

Diagrama 43-3.

Diferenciación de bacilos grampositivos aerobios o anaerobios facultativos por la reacción de catalasa. + Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

Catalasa Especies de Actinom yces 1 Especies de ArcanobacteriurrP Especies de Bifidobacterium *

de de de de de de de de de

Actinom yces 1* Am ycolatopsis ArcanobacteriumP Aureobacterium Bacillus3 Bifidobacterium * Brevibacterium Brochothrix3 Corynebacterium Derm abacter hominus Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Lactobacillus Especies de Listeria1 Especies de M icrobacteriurrfi Especies de M ycobacterium Especies de Nocardia Especies de Propionibacterium 1 Especies de Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Tsukamurella 9

Clostridium carnisP Clostridium h isto lyticu rrf Clostridium tertiurrf3 Erysipelothrix rhusiopathiae Gardnereita vagin*lis Especies de Lactobacillus' Especies de Leuconostoc Especies de Propionibacterium 1 Especies de Tsukamurella9

Véase diagrama 43-4

Véase diagrama 43-8

1 Catalasa variables. 2 Algunas cepas de A. haemolyticum exhiben una actividad débil, pero por lo común es negativa. 3 Catalasa variables, por lo común positivas; unas pocas especies son negativas, pero raras veces se han visto en labo

ratorios clínicos. 4 Raras reacciones positivas cuando crecen en aire con C 0 2 (33). 5 La catalasa depende del medio y la temperatura de incubación; incubación a 20SC. 6 Clostridium variable, por lo común negativo; pueden detectarse trazas en algunas cepas (27). 7 Raras cepas negativas (26). 8 La catalasa no se realiza de manera sistemática.

, Oxidación Ácido alcohol Resistencia Ramificación Hitas aéreas

+ V V +

i---------------------------- \ Especies de Mycobacterium

Especies de Nocardia

9 No se conoce la reacción de catalasa; tratadas como variable.

Bacterias grampositivas 533

Diagrama 43-4. Diferenciación inicial de los bacilos grampositivos, aerobios a anaerobios faculta tivos, catalasa positivos. Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de Actinom yces de Am ycolatopsis de Arcanobacterium de Aureobacteríum de Bacillus de Bifidobacterium de Brevibacterium

Especies de Brochothrix Especies de Corynebacterium D erm abacter hominus

Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Listeria

Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de

M icrobacterium M ycobacterium Nocardia Propionibacterium Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Tsukamurella

Morfología celular

Cadenas (esporas)

Micelio o hlfas aéreas o ambos

Especies de Bacillus

Especies de Am ycolatopsis Especies de Nocardia Especies de Rhodococcus

Para la identificación véase B e rg e y’s M anual o f Syste m atic Bacteriology vol. 2

Véase diagrama 43-9

Bacilos pleomórficos (cocobacilos)

Especies de Actinom yces A rcanobacterium haem olyticum Especies de Aureobacteríum Especies de Bifidobacterium Especies de Brevibacterium Especies de Brochothrix Especies de C orynebacterium Derm abacter hom inus Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Listeria Especies de M icrobacterium Especies de M ycobacterium Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa Especies de Tsukamurella Véase diagrama 43-5

534

Esquemas de identificación

Diagrama 43-5.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, pleomórficos (cocobacilos), no formadores de esporas, aerobios a anaerobios facultativos, catalasa positivos. Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de

Actinom yces Arcanobacterium Aureobacterium Bifidobacterium Brevibacicrium Brochothrix

Especies de Corynebacterium D erm abacter hominus Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Listeria

Especies de M icrobacterium Especies de M ycobacterium Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa

Especies de Tsukamurella

Ácido alcohol resistencia

í Especies de M ycobacterium (intensa )123 Especies de Gordonia (por lo común parcial mente ácido alcohol resistente) Especies de Tsukamurella (débil a intensa)

F (fermentativo)

Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de

Actinom yces Arcanobacterium Aureobacterium Bifidobacterium Brevibacterium Brochothrix C orynebacterium Derm abacter hominus Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Listeria Especies de M icrobacterium Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa

O/F de la glucosa

NF(no fermentativo)

I Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de

Actinom yces Arcanobacterium Bifidobacterium Brochothrix Corynebacterium 45 Derm abacter hom inus Jonesia denitrificans Especies de Listeria p Especies de Microbacterium? Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa

Especies Especies Especies Especies Especies Especies

Véase diagrama 43-6

Véase diagrama 43-7

de de de de de de

Aureobacterium? BrevibacteriurrP Corynebacterium 4 Kurthia L is te ria M icrobacterium 6

1 Las especies de Mycobacterium requieren medios y condiciones especiales para el crecimiento; pruebas no realizadas de rutina en la mayoría de los laboratorios. Las muestras se envían a los laboratorios de Salud Pública y a otros labora torios de referencia para la identificación de género y especie. 2 Oxidativas (O); lentas y débiles. 3 Oxidativas (O) o inertes (-) 4 Fermentativas (F), oxidativas (O) o inertes (-). 5 Fermentativas (F) u oxidativas (O). 6 Oxidativas (O) o débilmente fermentativas (F).

Bacterias grampositivas 535 Diagrama 43-6.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, pleomórficos (cocobacilos), no formadores de esporas, aerobios a anaerobios facultativos, catalasa positivos, que no son ácido alcohol resistentes y que fermentan la glucosa. Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de

Actinom yces Arcanobacterium Bifidobacterium Brevibacterium B rochothrix

Especies de C orynebacterium D erm abacter hom inus Jonesia denitrificans Especies de Listeria

Especies de M icrobacterium Especies de Prcpionibacterium Rothia dentocariosa

Movilidad

C orynebacterium aquaticum Corynebacterium m atruchotii Jonesia denitrificans Especies de Listeria1 Especies de M icrobacterium^

Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de

Actinom yces Arcanobacterium Bifidobacterium Brevibacterium Brochothrix Corynebacterium Derm abacter hom inus Especies de Listeria12 Especies de M icrobacterium^ Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa

Especies de Actinomyces.ias especies se diferencian mejor por electroforesis en gel (40); sin embargo, véa se cuadro 43-1 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Arcanobacterium: véase cuadro 43-3 para diferenciar especies. Arcanobacterium haemolyticum CAMP inversa positiva. Especies de Bifidobacteriunr. requieren técnicas especializadas para la anaerobiosis estricta y/o estudios metabólicos. Especies de Brevibacterium: véase cuadro 43-6 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Brochothrix. inmóviles a 22eC; veáse cuadro 43-7 para diferenciar las especies. Especies de Corynebacterium : véanse diagramas 43-10 a 43-14 para diferenciar las especies. Derm abacter hom inus: véase cuadro 43-20 para las características bioquímicas. Jonesia denitrificans: véase cuadro 43-27 para las características bioquímicas. Especies de Listeria: véase diagrama 43-15 para diferenciar las especies. Especies de M icrobacterium : véase cuadro 43-33 para diferenciar algunas especies. Especies de Propionibacterium: véase cuadro 43-40 para diferenciar las especies. Rothia dentocariosa: véase cuadro 43-41 para las características bioquímicas. 1 Móviles cuando crecen a 20-25°C (temperatura ambiente) en caldo nutritivo; movilidad característica, ya que da vuel tas de uno de sus extremos al otro en las preparaciones húmedas. 2 Movilidad variable, por lo general negativa; sólo las especies pigmentadas de naranja M. imperiale y M. aibor¿>scens son móviles a 28eC (19).

536

Esquemas de identificación

Diagrama 43-7. Diferenciación de los bacilos grampositivos, pleomórficos (cocobacilos), no formadores de esporas, aerobios a anaerobios facultativos, catalasa positivos, que no son ácido alcohol resistentes y son no termentadores. Especies de Brevibacterium Especies de Aureobacterium +

Especies de Corynebacterium

Especies de Corynebacterium Especies de Kurthia

Especies de M icrobacterium Especies de Listeria

Ácido micólico en las células

Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de

Aureobacterium Brevibacterium Kurthia Listeria M icrobacterium

Especies de Aureobacterium : véase cuadro 43-4 para diferenciar algunas especies. Especies de Brevibacterium : véase cuadro 43-6 para diferenciar las especies. Especies de Corynebacterium : véanse diagramas 43-10 a 43-14 para diferenciar las especies. Especies de Kurthia: crecimiento característico en “plumas de ave” en las superficies de medios que contengan gelatina como nutriente; resultan críticas la concentración y la marca comercial; véase cuadro 43-28 para diferenciar las especies. Especies de Listeria: véase diagrama 43-15 para diferenciar las especies. Especies de M icrobacterium : v3éase cuadro 43-33 para diferenciar algunas especies.

Bacterias grampositivas 537

Diagrama 43-8. Identificación de los bacilos grampositivos, aerobios a anaerobios facultativos, catalasa negativos. Especies Especies Especies Especies

Clostridium histolyticum^ Clostridium tertiurri2 •Erysipelothrix rhusiopathiae G ardnerella vagin*lis 3

Especies de Actinom yces 1 Especies de Arcanobacterium Especies de Bifidobacterium Clostridium carnis2

de de de de

Lactobacillus Leuconostoc Propionibacterium Tsukamurella4

Especies de Actinom yces : las especies se diferencian mejor por electroforesis en gei (25); sin embargo, véase cuadro 43-1 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. A. israelii, A. naeslundii y A, odontoiyticus catalasa negativos, exhiben H2S en TSI. Arcanobacterium haemolyticum: CAMP inversa positivo; véase cuadro 43-3 para diferenciar tres especies. Especies de Bifidobacterium : requieren técnicas especializadas para la anaerobiosis estricta y/o estudios metabólicos Clostridium carnis, C. histolyticum, C. tertium:

-A------------------------------------Manitol A Melibiosa

C. C.

C. tertium

I C.

carnis

carnis histolyticum

DNasa

l C. histolyticum

Erysipelothrix rhusiopathiae: H2S positivo en TSI; véase cuadro 43-22 para las características bioquímicas. G ardnerella vagin*lis j véase cuadro 43-25 para las características bioquímicas. Especies de Lactobacillus: véanse B ergey’s M anual o f System atic Bactenology , vol. 2, y cuadro 43-29

para la diferenciación de las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Leuconostoc. véase cuadro 43-31 para la diferenciación de las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Propionibacterium: véase cuadro 43-40 para la diferenciación de las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Tsukamurella: acido alcohol resistencia débil a intensa. 1 Catalasa variable. 2 Clostridium carnis, C. histolyticum y C. tertium son aerotolerantes, pero cuando se cultivan en aerobiosis no forman

esporas. 3 Se observa reacción de catalasa falsa positiva cuando el crecimiento para esta prueba se toma a partir de medios que contienen sangre humana (p. ej., agar vagin*lis). 4 No se conoce la reacción de catalasa; considerada como variable.

538

Esquemas de identificación

Diagrama 43-9.

Diferenciación de las especies de B a c illu s rormadoras de esporas aisladas con más frecuencia. B. anthracis B. cereus B. circulans

B. coagulans B. firmus B. licheniform is

B. m egaterium B. pum ilus B. sphaerícus

B. stearotherm ophilus B. subtilis

Fenilalanina Voges Proskauer*1 B. firmus B. m egaterium * B. sphaerícus

Bacillus m egaterium

B. B. B. B. B. B.

a n th ra cis c e re u s c o a g u la n s * lich e n ifo rm is p u m ilu s s u b tilis

C it rato Hidrólisis del almidón

~ r Bacillus firmus

circulans coagulans* m egaterium * stearotherm ophilus

Véase el M anual de B e rg e yv ol. 2, para diferenciar las especies

Bacillus sphaerícus

Indol Hidrólisis del almidón

I B. B. B. B. B.

anthracis cereus coagulans licheniform is subtilis

Véase el M anual de B e rg e y m \. 2, para diferenciar las especies * Resultados variables. 1 1ncubar un adicional de 24 h a 37gC.

B. B. B. B.

1 Bacillus pum ilus

Bacterias grampositivas 539

Diagrama 43-10. Diferenciación inicial de las especies de C o ry n e b a c te ñ u m más frecuentes que pueden producir infecciones humanas. C. C. C. C. C. C. C.

amycolatum aferm entans accolens bovis callunae cystitidis diphtheiiae biotipo gravis

C. diphtheríae biotipo mitis C. diphtheríae biotipo interm edius C. diphtheriae biotipo belfanti C. flavescens

+ +

C. m atruchotii C. aquaticum *

Reducción de nitrato Movilidad

C. accolens C. diphtheriae biotipo gravis biotipo m itis biotipo interm edius C. glutam icum C. k u ts c h e ri *1 C. pilosum C. pseudodiphtheriae C. pseudotuberculosis*2 C. vitarum en C. xerosis

Véase diagrama 43-11

C. pseudodiphtheriae C. pseudotuberculosis C. renale C. striatum C. vitarum en C. xerosis C. aquaticum

~ r Corynebacterium aquaticum *

C. am ycolatum C. aferm entans C. bovis C. calliunae C. cystitidis C. diphtheriae biotipo belfanti C. flavescens C. jeikeium C. kutscheri'' C. m inutissim um C. m ycetoides C. pseudotuberculosis’2 C. renale C. striatum

Véase diagrama 43-12

Galactosa

Corynebacterium aquaticum

C. glutam icum C. jeikeium C. kutscheri C. m atruchotii C. m inuiissim um C. m ycetoides C. pílosum

i Corynebacterium m atruchotii

* Resultados variables. 1 Reducción de nitratos negativa en cepas provenientes de ovejas y cabras y positiva en las cepas provenientes de ca ballos y ganado bovino ( 1 2 ). 2 Los estudios realizados por Knight (29) y Biberstein y Knight (4) mostraron que las cepas equinas reducen los nitratos, mientras que las cepas ovinas fueron positivas.

540

Esquemas de identificación

Diagrama 43-11. Diferenciación de las especies de C orynebacterium inm óviles, con reducción de nitratos positiva. C. pse u do d ip h t'ie ia e C. pseudotuberculosis C. vitarum en C. xerosis

C. diphtheriae biotipo inteririedius C. glutam icum C. kutscheri C. pilosum

C. accolens C, diphtheriae biotipo gravis C. diphtheriae biotipo mitis A

Maltosa *1 U reasa

1 C. glutam icum C. kutscheri C. pilosum C. pseudotuberculosis C. vitarumen

C. diphtheriae biotipo gravis C. diphtheriae biotipo interm edius C. diphtheriae biotipo mitis C. xerosis?

C orynebacienum pseudodiphtheriae

C. accolens C. xerosis2

I Sacarosa

Corynebacterium xerosis

C orynebacterium accolens

p3456 Hemolisis, 5% SBA y Pirazinamidasa +

Corynebacterium

Corynebacterium diphtheriae biotipo m itis*

C. diphtheriae biotipo gravis* C. diphtheriae biotipo interm edius*

Comprobación de virulencia de la toxina + Esculina + Rojo de metilo + + Pirazinamidasa +

í C orynebacterium vitarum en

I C. kutscheri C. pilosum

C. glu ta m icu m ** C. pseudotuberculosis

C o ryn e b a d e ' n o 2 Manitol

Listeria welshim erí *

L innocua L. welshim erí

Xilosa

í Listeria welshim erí

*No se dispone de resultados en la reducción de nitratos; tratado como variable. 1 Pequeñas cantidades.

1 Listeria innocua *1

Bacterias grampositivas 545

Diagrama 43-16. Diferenciación inicial de los bacilos grampositivos anaerobios. Especies Especies Especies Especies

de de de de

A rcanobacterium 1 Bifidobacterium Butyrivibrio Clostridium

Especies de Microbacterium? Especies de M obiluncus Especies de Propionihacterium

Especies de Eubacterium Especies de Faicivibrio Especies de Lactobacillus

Esporas

Especies de Clostridium

Véanse cuadros 43-9 a 43-16 Véanse diagramas 43-17 a 43 25

Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de de de

Catalasa

Especies de Arcanobacterium ' *123 Eubacterium lentum 45 Especies de Lactobacillus? Especies de M icrobacterium Especies de Propionibacterium *6

Véase diagrama 43-26

Arcanobacterium Bifidobacterium Butyrivibrio Eubacterium Faicivibrio Lactobacillus M icrobacterium M obiluncus Propionibacterium

Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de

Arcanobacterium *3 Bifidobacterium 7 Butyrivibrio Eubacterium 4 Faicivibrio Lactobacillus? M obiluncus Propionibacterium propionicus Propionibacterium acidopropionici * Propionibacterium a cn é s* Propionibacterium je n se n ii* Propionibacterium lym phophilum *

Véase diagrama 43-28

* Reacciones variables. 1 El crecimiento en anaerobiosis es mejor que en aerobiosis. 2 Las especies de Microbacterium son aerobias; es posible un actividad débil en anaerobiosis. 3 Catalasa variables; por lo común negativas; algunas cepas exhiben una actividad débil. 4 Cepas ocasionales de E. lentum son catalasa positivas. 5 Algunas cepas positivas (26). 6 Catalasa variables; por lo común positivas. 7 Catalasa negativas; rara reacción positiva cuando crecen en aire con C 02.

546

Esquemas de identificación

Diagrama 43-17. Diferenciación inicial de las especies de Clostridium grampositivas, anaerobias, formadores de esporas, con esporas subterminales ovales. C. C. C. C. C. C.

argentinense barata biferm entans botulinum butyricum celatum A

Glucosa Lactosa

C. baratiP C. butyricum C. ce la tu m ** C. ch a u voe i2 C. clostridioforme*, C. penringensP C. putríficum C. septicum? C. sphenoides * C. sym biosum *,**

Véase diagrama 43-18

C. histolyticum C. m alenom inatum C. novyi C. perfringens C. putrificum C. septicum

C. chauvoei C. clostridioform e C. difficile C. faiiax C. glycolicum C. haem olyticum

C. C. C. C. C.

sordellii sphenoides sporogenes subterm inale sym biosum

C. biferm entans C. botulinum 3’4 C. clostridioform e*,** C. difficile C. fallax C. g lyco licu m ** C. haem olyticum C. m alenom inatum ** C. novyp’4 C. sordelliP C. sphenoides* C. sporogenes4 C. sym biosum ’, * '

C. ce la tu m " C. closirídloform e”, C. sym biosum *,**

C. argentinense C. clostridioform e*,** C. glycolicum ** C. histolyticum C. m alenom inatum ** C. subterm inale C. sym biosum *,**

Véase diagrama 43-20

Véase diagrama 43-19 +

Esculina

C. celatum C. clostridioform e

A Aw

Clostridium sym biosum

Ramnosa Xilosa

í Clostridium clostridioform e Clostridium celatum *1 5 4 3 2

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Fermentación débil de la lactosa. 2 Pruebas de anticuerpos fluorescentes disponibles para la identificación. 3 El cultivo, el aislamiento y la identificación de C. botulinum deben realizarse sólo en los laboratorios de referencia. 4 La prueba de neutralización de la toxina es necesaria para la identificación de C. botulinum y C. novyi A y B; también es necesaria la prueba de la toxina para algunas especies de C. sporogenes que son difíciles de diferenciar de C. botu linum proteolítico (ABF). 5 Los clostridios aislados con más frecuencia son C. perfringens y C. ramosum.

Bacterias grampositivas 547 Diagrama 43-18.

Diferenciación de las especies de C lostridium g lucosa positivas y lactosa positivas con esporas sub term in ales ovales. C. C. C. C.

C. clostridioform e C. perfñngens C. putrificum

baratii butyricum celatum chauvoei

Movilidad Lecitinasa + Licuefacción de la gelatina, 22°C Hidrólisis del + almidón +

+ + -

C. ce la tu m ** C. chauvoei1 C. putrificum ** C. septicum 1 C. sym biosum *, **

C. butyricum C. sphenoides*

Clostridium perfringens

C. C. C. C. C.

C. septicum C. sphenoides C. sym biosum

Movilidad Lecitinasa Licuefacción de la gelatina, 22°C + Hidrólisis del + almidón +

T Clostridium baratii

celatum ** clostridioform e* putrificum ** sphenoide * sym biosum *, **

Véanse cuadros 43-9 y 43-12 para diferenciar las especies * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Pruebas de anticuerpos fluorescentes disponibles para la identificación.

— C. clostridioform e* C. sym biosum *,**

Clostridium symbiosum*,

548

Esquemas de identificación

Diagrama 43-19. D iferenciación de las especies de C l o s t r i d i u m glucosa positivas y lactosa negativas con esporas subterminales ovales. C. C. C. C. C.

biferm entans botulinum clostridioform e difficile fallax 4-

C. fallax C. sphenoides*

C. glycolicum C. haem olyticum C. m alenom inatum C. novyi

+ -

+ + -

+ -

Hidrólisis d e la escu lin a

Lecitinasa Lipasa

C. C. C. C.

“

C. novyi A 3 C. botulinum 3z-3

C. C. C. C.

C. clostridiofom ie C. glycolicum * C. sphenoides*

Véanse cuadros 43-9 y 43-12 para diferenciar las especies*1

biform entans haem olyticum novyi B3 sordellii

' Clostridium botulinum 1 3

(ABCDF)

(BCDEF)

Prueba de neutrali zación de la toxina

Hidrólisis del almidón -

Clostridium sporogenes3

sordellii sphenoides sporogenes sym biosum

Pruebas de neutrali zación de la toxina C. C. C. C. C.

difficile glycolicum m alenom inatum n o vyi C sym biosum *

Véanse cuadros 43-9 y 43-12 para diferenciar las especies

* Resultados variables. 1 El cultivo, el aislamiento y la identificación de C. botulinum sólo deben realizarse por los laboratorios de referencia 2 Si la lecitinasa es positiva, muy pequeñas cantidades. 3 La prueba de neutralización de la toxina es necesaria para la identificación de C. botulinum y C. novyi A y B; también es necesaria la prueba de la toxina para algunas especies de C. sporogenes, que son difíciles de diferenciar de C. bo tulinum proteolítico (ABF).

Bacterias grampositivas 549 Diagrama 43-20.

Diferenciación de especies de C lostndium g lucosa negativas y lactosa negativas, con esporas sub term in ales ovales.

C. subterm inale C. sym biosum

C. histolyticum C. m alenom inatum

C. argentinense C. clostridioform e C. glycolicum

Licuefacción de la gelatina, 22°C Hidrólisis de la esculina +

í Clostridium glycolicum * ,**

C. clostridioiorm e C. glycolicum *, **

C. argentinense C. glycolicum *,** C. histolyticum C. subterm inale C. sym biosum *, **

Véanse cuadros 439 y 43-12 para dife renciar las especies

Coágulo Aw A A

Leche Galactosa Trehalosa Mañosa

I Clostridium clos tridioforme y Clostridium glycolicum

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable.

C. glycolicum *, ** C. m alenom inatum C. sym biosum *, **

Véanse cuadros 439 y 43-12 para dife renciar las especies

550

Esquemas de identificación

Diagrama 43-21.

Diferenciación inicial de las especies de C lo s trid iu m grampositivas, anaerobias, formadoras de esporas, con esporas terminales. C. C. C. C.

baratii cadaveris carnis celatum

C. C. C. C.

A A

C. C. C. C. C. C. C. C.

baratii2 c a rn is * ce la tu m ’"' indolis**2 le p tu m *,** paraputrificum ram osum 1 tertium 2

Véase diagrama 43-22

cochlearium hastiform e indolis innocuum

C. C. C. C. C.

Glucosa Lactosa

cadaveris carnis* leptum *,** m alenom inatum ** putrefaciens

Véase diagrama 43' 23

C. putrificum C. ram osum *1 C. tertium C. tetani

C. leptum C. m alenom inatum C. paraputrificum C. putrefaciens

C. celatum ** C. indolis**2 C. leptum *,**

Véase diagrama 43-24

C. C. C. C. C. C.

cochlearium hastiform e innocuum leptum *,** m alenom inatum ** tetani

Véase diagrama 43-25

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Clostridios aislados con más frecuencia: C. perfringens y C. ramosum; C. ramosum resistente a la CIM estándar de los agentes antimicrobianos. 2 Fermentación débil de la lactosa.

Bacterias grampositivas 551 Diagrama 43-22.

Diferenciación de las especies de C lo s t r id iu m g lucosa positivas y lactosa positivas con esporas term in ales ovales o redondas.

C. barata C. carnis C. celatum

C. indolis C. leptum C. paraputrificum

NG Aerotolerante NG

H2S

•

C. carnis C. tertium

Indol

C. baratii* C. paraputrificum * C. ram osum

C. baratii* C. celatum * C. leptum C. paraputrificum *

C. celatum * C. indolis

Aw Manitol A Trehalosa A Xilosa

Clostridium tertium

C. ram o su m *1 C. tertium

Rafinosa Aw A Salicina A Trehalosa

A Melibiosa A Rafinosa

Clostridium celatum

C. baratii C. paraputrificum

Clostridium indolis

Clostridium carnis

Sí c +

Clostridium ram osum

No A, C + -

No C + -

No Toxigénico No C Leche ^ Movilidad - Lecitinasa +

No Toxigénico Sí - Lecitinasa +

J Clostridium paraputrificum

Clostridium baratii

Clostridium. leptum

Clostridium celatum Clostridium paraputrificum * No se dispone de resultados; tratado com o variable. 1 C lostridios aislados con más frecuencia; C. perfringens y C. ramosum.

Clostridium baratii

552

Esquemas de identificación

Diagrama 43-23. Diferenciación de las especies de Clostridium glucosa positivas y lactosa negativas con esporas terminales ovales o redondas. i C. putrefaciens

C. leptum C. m alenom inatum

C. cadaveris C. carnis

+ + +

h 2s Movilidad Indol

+ +

~ C. cadaveris** C. m alenom inatum * , "

C. cadaveris * C. m alenom inatum *, **

i Clostridium m alenom inatum * ** Clostridium carnis

Digestión de la carne cocida C, D Leche

i Clostridium C. leptum C. m alenom inatum *,

I Clostridium cadaveris

Clostridium m alenom inatum

Digestión de la carne cocida C. D Leche ~ + Licuefacción v w de la gelatina

A V

M altosa Sacarosa

i Clostridium leptum

Clostridium cadaveris

Clostridium m alenom inatum Clostridium m alenom inatum

Resultados variables.

* No se dispone de resultados; tratado como variable.

putrefaciens

Bacterias grampositivas 553 Diagrama 43-24.

Diferenciación de las especies de Clostridium g lucosa negativas y lactosa positivas con esporas term in ales ovales o redondas. C. c e la tu m

C. le p tu m

C. in d o lis

C + -

AC + A

Leche Movilidad Trehalosa

i C lo s trid iu m in d o lis

í C lo s trid iu m c e la tu m

Clostridium leptum

Diagrama 43-25. D ife re n c ia c ió n d e la s e s p e c ie s d e Clostridium glucosa negativas y lactosa negativas co n e s p o ra s terminales o v a le s o re d o n d a s. C. c o c h le a riu m

C. in n o c u u m C. le p tu m

C. h a s tifo rm e

C. C. C. C. C.

H2S

C. innocuum C. tetani * I

c o c h le a riu m h a s tifo rm e le p tu m m a le n o m in a tu m te ta n i*

Toxigemco Maltosa

C. m a le n o m in a tu m C. te ta n i

Sí + + No

No -

Toxigénico No Movilidad Licuefacción de la gelatina, 22°C

r▼~ C lo strid iu m te ta n i

1 C lo s trid iu m te ta n i

C. le p tu m C. m a le n o m in a tu m *

C. c o c h le a riu m C. h a s tifo rm e C. m a le n o m in a tu m *

Véanse cuadros 43-15 y 43-16 para diferenciar las especies

Resultados variables.

C lo str id iu m in n o c u u m

554

Esquemas de identificación

Diagrama 43-26.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, anaerobios, catalasa positivos. Especies de Arcano-

Especies de Lactobacillus Especies de M icrobacterium

bacterium Eubacterium lentum

Reducción de nitratos

Especies de Arcano-

Especies de Propionibacterium

Especies de Arcanobacte-

bacterium * E. lentum M. lacticum P. acidipropionici P. acnés P. freu d e n re ich ir P. lym phophilum * P. propionicus

rium *

Especies de Lactobacillus M. ar'oorescens M. im periale M. laevaniform ans P. avidum P. freudenreichii* P. granulosum P. je n se n ii R lym phophilum * P. thoenii

Véase diagrama 43-27 +

H2S (TSI fondo del tubo)

Eubacterium lentum

Especies de Arcanobacterium M. lacticum P. acidipropionici P. acnés P. freudenreichii P. lym phophilum P. propionicus

A-

Propionibacterium acnés

CAMP CAMP inversa L-Arabinosa

A. pyogenes** A. bernardiae** P. acidipropionici P freudenreichii

Arcanobacterium haem olyticus

Véanse cuadros 43-3 y 43-40 para la diferenciación Reacción variable. 1 No se dispone de resultados; tratado como variable.

A. pyogenes** A. bernardiae** M. lacticum P. lym phophilum P. propionicus

Véanse cuadros 43-3, 43-33 y 43-40 para la diferenciación

Bacterias grampositivas 555 Diagrama 43-27. Diferenciación de los bacilos grampositivos, anaerobios, catalasa positivos, que no re

ducen los nitratos. Especies de Arcanobacterium Especies de Lactobacillus

Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium

M icrobacterium atborescens M icrobacterium im pel íale M icrobacterium laevaniform ans Propionibacterium avidum

freudenreichii granulosum je n senii lym phophilum thoenii

H2S

M. M.

Especies de Arcanobacterium Especies de Lactobacillus

arborescens laevaniform ans

---------------------------------------------- M. im periale Especies de Propionibacterium

I Arcanobacterium haem olylicum :

Véase cuadro 43-33 para diferenciar algunas especies

+ +

+ -

Especies de Lactobacillus P. granulosum * P. lym phophilum

P. freudenreichii P. je n se n ii

Propionibacterium thoenii

Beta hemolisis (5% SBA) Hidrólisis de la escullna

Propionibacterium granulosum '

Amlgdalina L-arabinosa Licuefacción de la gelatina

Propionibacterium avidum

P. avidum P. thoenii

CAMP inversa positivo; véase cuadro 43-3 para di ferenciar tres especies

A A A

L-arabinosa Maltosa Manitol Sacarosa

Propionibactehum je n se n ii

Propionibacterium freudenreichii

Especies de Lactobacillus-, véase B ergey’s M anual o f System atic Bacteriology, volu men 2, y cuadro 43-29 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. Especies de Propionibacterium: véase cuadro 43-40 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. Resultados variables.

556

Esquemas de identificación

Diagrama 43-28.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, anaerobios, catalasa negativos. Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de

Arcanobacterium Bifidobacterium Butyrivibrio Eubacterium Falcivibrio Lactobacillus M obiluncus

Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium Propionibacterium

acnés acidipropionici ¡ensenii Iym phophiium propionicus

Movilidad

Especies de Butyrivibrio' E. com besii** E. dolichum ** E. eligens E. lentum ** E. m oniliform e E. rectale* E. siraeum E. tenue E. tim idum ** Especies de Falcivibrio Especies de M obiluncus

Especies de Arcanobacterium Especies de Bifidobacterium E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E.

aerofaciens bitorm e brachy com besii** contortum cylindroides dolichum ** formicigenerans hadrum hallii lentum ** lim osum nitritogenes

Véase d agrama 43-29

E. E. E. E. E. E. E. E. E.

nodatum ram ulus rectale* saburreum siraeum * tenue* lim id u m ** tortuosum vontriosum Especies de Lactobacillu & P. propionicus P. acidipropionici P. acnés P. ¡ensenii P. Iym phophiium

Especies de Arcanobacterium : Arcanobacterium haem olyticum CAMP inversa positivo; véase cuadro 43-3 para diferenciar tres especies.

I Especies de Bifidobacterium: requiere técnicas especia lizadas para la anaerobiosis estricta y estudios metabólicos.

I Especies de Eubacterium Especies de Lactobacillus Especies de Propionibacterium

Véase diagrama 43-30 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Movilidad rápida y vibratoria. 2 Movilidad positiva rara.

Bacterias grampositivas 557 Diagrama 43-29.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, anaerobios, catalasa negativos, que son móviles. Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium

Especies de Butyrivibrio Eubacterium com besii Eubacterium rlolichum Eubacterium eligens + -

B. fibrisolvens* E. com besii* E. re tía le

lentum m oniliform e retía te siraeum

Producción de butirato Hidrólisis de la esculina

B. B. E. E. E.

crossotus fibrisotvens * co m b e sii* dolichum m oniliform e Especies de Mobiluncus**

Véase diagrama 43-29 _____________________

Eubacterium tenue Eubacterium tim idum Especies de Falcivibrio Especies de M obiluncus

E. elig e n s* E. siraeum *

Hidrólisis v + del almidón —

Eubacterium siraeum

E. eligens* E. lentum E. sira eu m * E. tenue E. timidum

Especies de Falcivibrio Especies de Mobiluncus**

Eubacterium eligens

Especies de Butyrivibrio: véase cuadro 43-8 para diferenciar las especies. Especies de Eubacterium: véase cuadro 43-23 para diferenciar las especies que pueden causar infecciones humanas. Especies de Falcivibrio: véase cuadro 43-24 para diferenciar las especies. Especies de M obiluncus: véase cuadro 43-35 para diferenciar las especies. Resultados variables. ' No se dispone de resultados; tratado como variable.

558

Esquemas de identificación

Diagrama 43-30.

Diferenciación de los bacilos grampositivos, anaerobios, catalasa negativos, inmóviles. Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacte/ium Eubacterium Eubacterium

Especies de Arcanobacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium Eubacterium

aerofaciens biform e brachy com besii contortum cylindroides dolichum form icigenerans hadrum hallii

Propionibacterium acnés

lentum lim osum nitritogenes nodatum ram ulus rectale saburreum siraeum tenue tim idum

-> n o 2 Indol

no3

— Especies de Arcanobacterium E. brachy E. lentum E. nitritogenes E. tortuosum * F. acidipropionici P lym phophilum P. propionicus

Véase cuadro 43-3 para diferenciar tres especies; A. haem oiyticum es CAMP inversa positivo

Eubacterium tortuosum Eubacterium ventrisum Especies de Lactobacilus Propionibacterium acidipropionici Propionibacterium acnés Propionibacterium je n se n ii Propionibacterium lym phophilium Propionibacterium propionicus

E. saburreum E. tenue e . tim idum **

i +

Hidrólisis de |a eSculina Licuefacción de la oelatina.

I Eubacterium saburreum

Eubacterium tim idum Eubacterium tenue

1 Eubacterium 1 nitritogenes*

Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina, 22° C +

1 E. brachy E. nitritogenes* E. tortuosum P. acidipropionici

E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E.

aerofaciens biform e com besii contortum cylindroides dolichum form icigenerans hadrum hallii lim osum nodatum ram ulus rectale siraeum tim idum ** tortuosum * ventriosum Especies de Lactobacillus P. je n se n ii P. lym phophilum * .

Véase diagrama 43-3

Propionibacterium propionicus

E. lentum P. propionicus* P. lym phophilum

Véanse cuadros 43-23 y 43-40 para la diferenciación * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratados como variable. 1 Licuefacción de la gelatina, si es positiva, débil.

Bacterias grampositivas 559 Diagrama 43-31.

Diferenciación de los bacilos grampositlvos, anaerobios, catalasa negativos, inmóvi les, que no reducen los nitratos y son indol negativos. Eubacteríum Eubacterium Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum

Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum

aerofaciens biform e com besii contortum cylindroides dolichum

+ +

E. com besii* E. lim osum *

+ -

form icigenerans hadrum hallii lim osum nodatum ramulus rectate

Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum Eubacteríum

siraeum timidum tortuosum vcntriosum Especies de Lactobacillus Propionibacterium je n se n ii Propionibactenum lymphophilum

Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C +

E. E. E. E. E.

aerofaciens* b ifo rm e * contortum cytindroides h a d ru m * E. lim o su m * E. ram ulus E. rectale E. sira eu m * E. tortuosum E. tortuosum P. je n se n ii

E. co m b e sii* E. dolichum *

Véanse cuadros 43-23 y 43-40 para la diferenciación * Resutados variables. 1 Si es positiva la licuefacción de la gelatina, es débil.

E. aerofaciens* E. b ifo rm e * E. dolichum * E. form icigenerans E. hadrum * E. hallii E. nodatum E. siraeum * E. tim idum Especies de Lacto bacillus P. lym phophilum

560

Esquemas de identificación

Diagrama 43-32.

Diferenciación inicial de los cocos grampositivos de acuerdo con los requerimientos de oxígeno (0 2). Aerobios/anaerobios facultativos

Especies de Abiotrophia Especies de A erococcus 1 Alíoiococcus otitidis2 Especies de A rcanobacterium *3 Especies de Arthrobacter Especies de Brevibacteriurri2 Especies de Brochothrix Especies de Cellulom onas *5 Especies de Clostridium *7 Especies de Corynebacteríum Especies de Deinococcus D erm abacter hominus Especies de Enterococcus Especies de Exiguobacterium Especies de Gemella Globicateüa sanguis Especies de Gordonia Helcococcus kunzii Jonesia denitrificans Especies de Kurthia2 Especies de Lactobacillus *8 Especies de Lactococcus Especies de Leuconostoc Especies de Listeria Especies de Micrococcusk Especies de Nocardia2 Especies de Pediococcus Especies de Propionibacterium *9 Especies de Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de Streptococcus Especies de TsukamurelleP Turicella otitidis Especies de Vagococcus Especies de Xanthobacteri

Véase diagrama 43-33

Anaerobios

Especies de A rca n o ba cte riu rrf3 Especies de Bifidobacterium * Especies de Cellulomonas? Especies de CiostridiurrP-1 Especies de CoprococcusP Especies de Eubacteriurrri Especies de Lactobacillus*8 Peptococcus n ig e fi Especies de Peptostreptococcus Especies de Propionibacterium *9 Especies de Sarcina 6 Streptococcus pleom orphus

Véase diagrama 43-46*1 9 8 7 6 5 4 3 2

* Resultados variables. 1 Microaerófilos a anaerobios facultativos; crecen mejor con una tensión de oxígeno reducida; crecimiento escaso en anaerobiosis. 2 Aerobio estricto (obligado). 3 Crecimiento en anaerobiosis mejor que en aerobiosis. 4 Pocas especies pueden crecer en aire con 10% de C 0 2 (26). 5 Algunas cepas crecen escasamente en anaerobiosis. 6 Anaerobios estrictos (obligados). 7 Pocas especies capaces de crecer en aire (p. ej., C. carnis, C. histolyticum y C. tertium)\ aerotolerantes. 8 Anaerobios facultativos o estrictos (obligados); 20% de anaerobios obligados; en ocasiones microaerófilos. Desarrollan mal en aire; el crecimiento se incrementa con tensión de oxígeno reducida. El aislamiento de algunos anaerobios se in crementa por el dióxido de carbono (C02). 9 Por lo general anaerobios estrictos (obligados); algunas cepas son aerotolerantes, pero crecen mejor en anaerobiosis.

Bacterias grampositivas 561 Diagrama 43-33.

Diferenciación de los cocos grampositivos aerobios a anaerobios facultativos por la reacción de catalasa. Catalasa

Especies de Aerococcus *1 Alloiococcus otitidis*2 Especies de Arcanobacterium *3 Especies de Arthrobacter Especies de Brevibacteríum Especies de Brochothrix* Especies de Cellulom onas Especies de Clostridium *5 Especies de Corynebacterium Especies de Deinococcus Derm abacter hominus Especies de Exiguobacterium Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Lactobacillus*6 Especies de Listeria*7 Especies de M icrococcus Especies de Nocardia Especies de Propionibacterium*8 Especies de Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Staphylococcus* Stom atococcus m ucilaginosusw Especies de Tsukam urella** Turicella otitidis Especies de Xanthobacter

Véase diagrama 43-34

Especies de Abiotrophia Especies de Aerococcus *1 Alloiococcus otitidis *2 Especies de Arcanobacterium *3 Especies de Clostridium *5 Especies de Enterococcus Especies de Gemella G lobicatella sanguis Helcococcus kunzii Especies de Lactobacillus*6 Especies de Lactococcus Especies de Leuconostoc Especies de Listeria1 Especies de Pediococcus Especies de Propionibacterium *8 Especies de Staphylococcus *123456789 Stom atococcus m ucilaginosus 10 Especies de Streptococcus Especies de Tsukam urella** Especies de Vagococcus

Véase diagrama 43-41

* R esultados variables.

** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Si es positiva la reacción de seudocatalas, es débil debido a una reacción de catalasa no hemo (30). 2 Catalasa positivo, pero débil; catalasa negativo sólo cuando se cultiva en medios desprovistos de sangre entera (p. ej., agar chocolate). 3 Algunas cepas exhiben actividad débil; por lo común, negativa. 4 La catalasa depende del medio y de la temperatura de incubación; incubación a 20°C (12). 5 Catalasa variables, por lo común negativas; en algunas cepas pueden detectarse rastros (40). 6 Algunas cepas catalasa positivas (26). 7 Catalasa positivas, producción de citocromos; cepas ocasionales negativas (26). 8 Catalasa variables; por lo común positivas. 9 S. aureus subesp. anaerobius y S. saccharolyticus son catalasa negativos y por lo común sólo desarrollan en anaerobiosis. 10 Catalasa variable; si es positivo, débil.

562

Esquemas de identificación

Diagrama 43-34.

Diferenciación de los cocos grampositivos, aerobios a anerobios facultativos, catalasa positivos. Especies de Aerococcus Alloiococcus otitidis Especies de Arcanobacterium Especies de Arthrobacter Especies de Brevibacterium Especies de B rochothrix Especies de Cellulom onas Especies de Clostridium Especies de Corynebacterium

Especies de Deinococcus Derm abacter hominus Especies de Exiguobacterium Especies de Gordonia Jonesia denitrificans Especies de Kurthia Especies de Lactobacillus Especies de Listeria Especies de M icrococcus

O/F de la glucosa

Especies de Nocardia Especies de Propionibacterium Especies de Rhodococcus Rothia dentocariosa Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de Tsukamurella Turicella otitidis Especies de Xanthobacter

Especies de Aerococcus Alloiococcus o titid is** Especies de Arcanobacterium Especies de Brochothrix Especies de Cellulom onas *2 Especies de Clostridium Especies de Corynebacterium *3 Especies de Deinococcus Derm abacter hom inis Especies de Exiguobacterium Especies de G ordonia ** Jonesia denitrificans Especies de Lactobacillus Especies de Listeria *4 Especies de Propionibacterium Rothia deníocariosa Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de Tsukamurella** Turicella otitidis** Especies de X an th o b acte r**

Alloiococcus otitidis** Especies de Arthrobacter Especies de Brevibacterium 1 Especies de Cellulom onas*2 Especies de C orynebacterium *3 Especies de Gordonia** Especies de Kurtnia Especies de Listeria '4 Especies de Micrococcus Especies de Nocardia Especies de Rhodococcus Especies de Tsukamurella ** Turicella o titidis** Especies de X anthobacter**

Véase diagrama 43-35

Véase diagrama 43-401 4 3 2

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 O (oxidativas) o inertes (-). 2 F (fermentativas) y O (oxidativas). 3 F (fermentativas), O (oxidativas) o inertes (-). 4 F (fermentativas) u O (oxidativas).

Bacterias grampositivas 563 Diagrama 43-35.

Diferenciación de los cocos grampositivos aerobios a anaerobios facultativos catalasa positivos, que fermentan la glucosa. Especies de Aerococcus Alloiococcus otitidis Especies de Arcanobacterium Especies de Brochothrix Especies de Cellulom onas Especies de Clostridium Especies de Corynebacteríum

Especies de Deinococcus

Especies de G ordonia* (por lo común parcial) Especies de Tsukamurella

Corynebacteríum bovis Corynebacteríum coyieae** Corynebacteríum glucuronolyticum Corynebacterium aferm entans subesp. aferm entans* Corynebacterium striatum Listeria m onocytogenes Listeria seeligeri Propionibacterium granulosum * Propionibacterium acnés Turicella otitidis

+ +

1 Corynebacterium glucuronolyticum

Rothia dentocariosa

Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus

Especies de Tsukamurella Turicella otitidis

Especies de Xanthobacter

Ácido alcohol resistencia CAMP (w/S. aureus)

+ -

Especies de Propionibacterium

D erm abacter hominus Especies de Exiguobacterium Especies de Gordonia Especies de Jonesia denitrificans Especies de Lactobacillus Especies de Listeria

“

n o 3-> n o 2

Movilidad Glucosa A

Especies de Aerococcus Alloiococcus otitidis Especies de Arcanobacterium Especies de Brochothrix Especies de Cellulom onas Especies de Clostridium Especies de C orynebacterium * Especies de Deinococcus D erm abacter hominus Especies de Exiguobacterium Jonesia denitrificans Especies de Lactobacillus Especies de Listeria* Especies de Propionibacterium * Rothia dentocariosa Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginous Especies de Xanthobacter

C. afermentans sub Véase Diagrama 43-36 esp. aferm entans Turicella otitidis

Listeria se e lig e ri*

C. bovis C. striatum P. granulosum L. m onocytogenes L. seeligeT P. acnés

Sacarosa

____ I Hidrólisis de la esculina

L. m onocytogenes L. seeligeri

A A

2-Metil-D-manósido Ramnosa Xilosa

Listeria m onocytogenes

Resultados variables. ' No incluido en los cuadros.

O. striatum P granulosum

Propionibacte rium acnés

b o v is

Licuefacción de la gelatina 22°C

C orynebacterium striatum Listeria seeliger *

C o r y n e b a c te r iu m

Propionibacte rium granulosum

Acido micólico en las células

Turicella otitidis

Corynebacterium aferm entans subesp. afer m entans

564

Esquemas de identificación

Diagrama 43-36.

Diferenciación de los cocos grampositivos, aerobios a anaerobios facultativos, catalasa positivos, que fermentan la glucosa, no son ácido alcohol resistentes y son CAMPnegativos. Especies de Aerococcus Alloiococcus otitidis Especies de Arcanobacterium Especies de B rochothrix Especies de Cellulom onas Especies de Clostridium Especies de Corynebacterium

Especies de Deinococcus D erm abacter hominus Especies de Exiguobacterium Jonesia denitríficans Especies de Lactobacillus Especies de Listeria

Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de Xanthobacter

Movilidad

Alloiococcus otitidis'"' Especies de Cellulom onas’' Especies de C lostridium ” Especies de C orynebacterium ” Especies de Exiguobacterium Jonesia denitríficans Especies de Lactobacillus” Especies de Listeria*2 Especies de X anthobacter*

Véase diagrama 43-37

Especies de Aerococcus A lloiococcus o titid is” ” Especies de Arcanobacterium Especies de Brochothrix 1 Especies de Cellulom onas* Especies de C lostrídium * Especies de C orynebacterium ” Especies de Deinococcus D erm abacter hominus Especies de Lactobacillus*3 Especies de Listeria*2 Especies de Propionibacterium Rothia dentocariosa ■Especies de Staphylococcus Stom atococcus m ucilaginosus Especies de X anthobacter

Especies de Aerococcus: véase cuadro 43-2 para diferenciar las especies. Alloiococcus otitidis**: véase la descripción del género. Especies de Arcanobacterium: A. haemolyticum, CAMP inversa positivo; véase cuadro 43-3 para diferen ciar especies. Especies de Brochothrix. véase cuadro 43-7 para diferenciar las especies. Por lo común no crece a 35-37°C; rango 20-25°C; MR positivo y VP positivo. Especies de Cellulomonas: véase la descripción del género. Especies de Clostridium*: véanse diagramas 43-17 y 43-21 para diferenciar las especies aerotolerantes: C. carnis, C. histolyticum y C. tertium. Especies de Corynebacterium *: véanse diagramas 43-10 a-43-14 para diferenciar las especies. Especies de Deinococcus: véase cuadro 43-19 para diferenciar las especies encontradas con más frecuencia. Derm abacter hominus: véase cuadro 43-20 para las características bioquímicas. Especies de Exiguobacterium : véase la descripción del género. Jonesia denitríficans: véase cuadro 43-27 para las características bioquímicas. Especies de Lactobacillus*: véase cuadro 43-29 para la diferenciación de las especies aisladas con más frecuencia de las muestras clínicas. Especies de Listeria *: véase diagrama 43-15 para diferenciar las especies. Especies de Propionibacterium: véase cuadro 43-40 para diferenciar las especies. Rothia dentocariosa: véase cuadro 43-41 para las características bioquímicas. Stom atococcus m ucilaginosus: véase cuadro 43-46 para las características bioquímicas. Especies de Xanthobacter. véase la descripción del género.*1 3 2 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 1nmóvil a 22°C. 2 Móvil cuando crece en caldo nutritivo a temperatura ambiente (20-25°C); movilidad característica, ya que dan vueltas de uno de sus extremos al otro en preparaciones húmedas. 3 Raras veces movilidad positiva.

Bacterias grampositivas 565 Diagrama 43-37.

Diferenciación inicial de las especies de S ta p h y lo c o c c u s catalasa positivas1 aisladas con más frecuencia de los seres humanos, otros primates, alimentos y animales. Estafilocoagulasa2 (libre o en tubo)

S. aurous subesp. aureus S. delphini3 S. hyicus* S. intermediusP S. sc h le ife ri subesp. coagulans

S. haem olyticus

S. arlettae S. auricularis S. capitis subesp. capitis S. capitis subesp. ureolyticus S. caprae S. carnosus S. caseolyticus S. chrom ogenes S. cohnii subesp. cohnii S. cohnii subesp. urealyticum S. epiderm idis S. equorum S. felis S. gallinarum

S. hom inis S. hyicus* S. kloosii S. lentus S. lugdunensis S. m uscae S. pa steu ri S. pisciferm entans S. saprophyticus sub esp. saprophyticus S. schleiferi subesp. schleiferi S. sciuri S. sim ulans S. vitulus S. warned S. xylose

Véase diagrama 43.38

Staphylococcus aureus subesp. aureus

Cápsula Factor de agregación (ligada/portaobjeto) Voges-Proskauer (VP)

S. delphini

Staphylococcus schleiferi subesp. coagulans

Staphylococcus interm edius*

Staphylococcus hyicus Staphylococcus interm edius*

I A1234 7 56 A

Staphylococcus interm edius

Maltosa Trehaiosa

Siaphylococcus delphini

Staphylococcus hyicus

* Reacciones variables. 1 Todas las especies de Staphylococcus son catalasa positivas excepto S. aureus subesp, anaerobius y S. saccharoly-

ticus, ambos exhiben cree miento sólo en anaerobiosis. S. aureus subesp. aureus es variable para la producción de ca talasa, por lo común positivo. 2 La prueba de coagulasa es el criterio final habitual para la diferenciación de las especies de Staphylococcus; sin em bargo, algunas cepas de S. aureus pierden su actividad de coagulasa. Los criterios adicionales dependen de la fermen tación anaerobia de la glucosa y del manitoi. 3 Aislado a partir de delfines. 4 Una de las principales especies animales aisladas de muestras veterinarias; aislada de cerdos. 5 Aislado a partir de mordeduras de perros, carnívoros y otros mamíferos y aves. 6 Las cepas encapsuladas producen colonias que son más pequeñas y más convexas que ias cepas no encapsuladas y presentan un aspecto brillante y húmedo (40). 7 La reacción positiva puede ser tardía.

566

Esquemas de identificación

Diagrama 43-38. Diferenciación de las especies de S ta p h y lo c o c c u s catalasa positivas, coagulasa nega tivas, aisladas con más frecuencia de los seres humanos, otros primates, alimentos y animales. Fosfatasa alcalina U reasa S. c a p ra e S. c h ro m o g e n e s **12 S. c o h n ii subesp. u re a ly tic u m S. e p id e rm id is * S. e qu o ru rrP S. fe lis 3 S. g a llin a ru m 4 S. h y ic u s * 5 S. k lo o s ii "6 S. p is c ife rm e n ta n s 79 8 S. s im u la n s 13 S. x y lo s e

S. a rle tta e S. c a rn o s u s8 S. c h ro m o g e n s * 1 S. h y ic u s *® S. le n tu s 3 S. kloosii*® S. m u s c a e 10 S. s a p ro p h y tic u s subesp. s a p ro p h y tic u s S. s c h te ife ri subesp. s c h le ife r i11 S. s c iu r i12’13

S. c a p itis subesp.

S. a u ric u la ris S. c a p itis subesp. c a p itis S. c a s e o ly tic u s 15 S. c o h n ii subesp. c o h n ii S. h a e m o ly tic u s S. kloosii*® S. lu g d u n e n s is * S. v itu lu s 16

v re o ly tic u s S. e p id e rm id is ' S. h o m in is S. k lo o s ii 16 S. lu g d u n e n s is * S. p a s te u r i14 S. w a rn e d S. x y lo s e *

:Véase diagrama 43-39

NOg -> NOg _ A _ +

A A

S. g a llin a ru m S. k lo o s ii '

Arabinosa _ Raflnosa Arginina + Resistencia a la novobiocina

S ta p h y lo c o c c u s

S. e q u o ru m S k lo o s ii * S. x y lo s e

klO O S li *

S. S. S. S.

S. S. S. S. S.

c a rn o s o s c h ro m o g e n e s h y ic u s m uscae s c h le ife ri subesp. s c h le ife ri S. s c iu ri

S. a rle tta e S. k lo o s ii* S. s a p ro p h y tic u s

subesp. s a p ro p h y tic u s

S ta p h y lo c o c c u s k lo o s ii* S ta p h y lo c o c u s Fructosa A c o h n ii subesp. Mañosa Aw e p id e rm id is u re a ly tic u m * A Xilosa c a p ra e c h ro m o g e n e s 1 S ta p h y lo c o c c u s c o h n ii subesp. a rle tta e u re a ly tic u m * fe lis 3 Oxidasa _ h y ic u s *5 S. k lo o s ii Esculina _ p is c ife rm e n ta n s S. s a p ro p h y tic u s Resistencia a s im u la n s subesp. la novobiocina s a p ro p h y tic u s

Véanse cuadros 43-44 y 43-45 para la diferenciación

S. ie n tu s S. s c iu ri

S. c a rn o s u s S. c h ro m o g e n e s S. h y ic u s * S. Ie n tu s S. m u s c a e S. sch le ife ri subesp. s c h le ife ri

______ I_______ Véanse cuadros 43-43, 43-44 y 43-45 ________para la diferenciación________ * Resultados variables. 1 S. c h ro m o g e n e s aislado del ganado vacuno 2 S. e q u o ru m aislado de los caballos. 3 S. fe lis aislado de gatos. 4 S. g a llin a ru m aislado sobre todo de los derivados de los pollos. 5 S. h y ic u s aislado de los cerdos. 6 S. k lo o s ii aislado de una variedad de mamíferos. 7 S. p is c ife rm e n ta n s aislado de peces. 8 S. c a rn o s u s aislado de carnes fermentadas; p. ej., salchichas y salames. 9 S. Ie n tu s aislado de cabras y ovejas. 10 S. m u s c a e aislado de una diversidad de animales. 11 S. sch le ife ri subesp. sch le ife ri e s un patógeno en países europeos, si bien ra ra s v e c e s s e o b s e rv a en los E s ta d o s U nidos (33). 12 S. s c iu ri aislado de roedores y ciertos mamíferos. 13 Reacción de fosfatasa alcalina débil; puede ser tardía. 14 S. p a s te u ri raras veces se encuentra en muestras clínicas. 15 S. ca s e o ly tic u s es una de las principales especies animales aisladas de muestras veterinarias, a partir de la leche y sus derivados. 16 S. vitu lu s aislado de ungulados y derivados de la leche y de la carne.

Bacterias grampositivas 567

Diagrama 43-39. Diferenciación de ios especies de S ta p h y lo c o c c u s catalasa positivas, coagulasa nega tivas, fosfatasa alcalina negativas, aisladas con más frecuencia de seres humanos, otros primates, alimentos y animales. S.auricularis S. capitis subesp. capitis S. capitis subesp. ureolyticus S. caseoiyticus S. cohm i subesp cohnii

A A

epiderm idis* haem ol ; leus hom inis klo o sii* S. lugdunensis

A A

S. cohnii subesp. cohnii * S. xylose

Mañosa A A Trehalosa + Resistencia a la novobiocina

Staphylococcus lugdunensis

A Xilosa + B galactosidasa

S w h y lo c o c c u s xylose

S. pasteuri S. vitulus S. Mamen S. xylose

S. S. S. S.

Turnosa Aw V P-galactosidasa -

Staphylococcus Staphylococcus S. cohnii subcohnii sub esp cohnii kloosii esp. cohnii S. vitulus

S. auricularis S. caseoiyticus* S. haem olyticus S. h o m in is* S. p a steu ri S. warned

Véanse cuadros 43-43, 43-44 y 43-45 para la diferenciación

+ Oxidasa + p-glucosidasa -

Staphylococcus vitulus

Síaphvlococcus vitulus*

S. capitis subesp. capitis S. capitis subesp. ureolyticus S. epiderm idis*

S. cohnii sub esp. cohnii* S. kloosii S. vitulus*

A -

Staphylococcus cohnii subesp. cohnii*

S. caseoiyticus* S. epiderm idis* S. hom inis*

U reasa

]

S. capitis subesp. ureolydcus S. epiderm idis

Staphylococcus capitis subesp. capitis

Manltol A + Resistencia a la polimixina B

I Staphylococcus epiderm idis

Resultados variables.

1 Staphylococcus capitis subesp. ureolyticus

PYR

Staphylococcus caseoiyticus

S. epiderm idis S. hom inis

+ Resistencia a la polimixina B

f Staphylococcus epiderm idis

1 Staphylococcus hom inis

568

Esquemas de identificación

Diagrama 43-40.

Diferenciación de los cocos grampositivos, catalasa positivos, que no fermentan ia glucosa (NF, no termentadores). Alloiococcus otitidis Especies de Arthrobacter Especies de Brevibacterium Especies de Cellulomonas* Especies de Corynebacterium *

+ + Especies de Especies de Especies de Especies de

Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de

+ G ordonia1 Nocardia? Rhodococcus1 Tsukam urella3

G ordonia** Kurrhia Listeria * M icrococcus Nocardia

Especies de Rhodococcus Especies de Tsukamurella Turicella otitidis

Especies de Xanthobacter

Ácido alcohol resistencia Ácido micólico en las células

Especies de C orynebacterium

Alloiococcus otitidis Especies de A rthrobacter Especies de Brevibacterium Especies de Cellulom ona* Especies de Kurthia Especies de Listeria Especies de M icrococcus Turicella otitidis Especies de Xanthobacter

Alloiococcus otitidis : véase descripción del género. Especies de Arthrobacter. véase descripción del género. Especies de Brevibacterium: véase cuadro 43-6 para diferenciar las especies. Especies de C e llu lo m o n a *: véase descripción del género. Especies de Corynebacterium : véase diagrama 43-10 a 43-14 para diferenciar las especies. Especies de G oidonia: véase descripción del género. Especies de Kurthia: véase cuadro 43-28 para diferenciar las especies. Especies de Listeria: véase diagrama 43-15 para diferenciar las especies. Especies de Nocardia: véase cuadro 43-36 para diferenciar las especies. Especies de M icrococcus: véase cuadro 43-28 para diferenciar las especies. Especies de Rhodococus: véase descripción del género. Especies de Tsukarella: véase descripción del género. Turicella otitidis: véase cuadro 43-50 para las características bioquímicas. Especies de Xanthobacter. véase descripción del género.

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Por lo común parcialmente ácido alcohol resistentes. 2 La propiedad de ácido alcohol resistencia es variable, por lo común positiva. 3 Ácido alcohol resistencia débil a fuerte.

Bacterias grampositivas 569

Diagrama 43-41.

Diferenciación de los cocos grampositivos aerobios a anaerobios facultativos que son catalasa negativos.*1 Especies de A b io tro p h ia Especies de A e ro c o c c u s *' A llio c o c c u s otitidis*2 Especies de A rca n o b a cte r*3 Especies de C lo strid iu m *4 Especies de E n te ro co ccu s Especies de G am ella

Movilidad LAP8 PYR9 NR Resistencia a ia vancomicina + -

Especies de A b io tro p h ia * A lio io co ccu s otitidis* Especies de E n terococcus*

Especies de P ro p io n ib a cte riu m *6 Especies de S ta p h ylo co ccu s*7

G lobicatella sang uis H e lco co ccu s k u n z ii Especies de L a c to b a c illu s ’ Especies de Lacto co ccu s Especies de L e u co n sto c* Especies de Listeria *5 Especies de P e dioco ccus

S tom ato coccus m ucila g in o su s*

Especies de S tre p to c o c c u s * Especies de T suka m urella* Especies de Vagococcus

+ + S

Especies de

Especies de Especies de

E n te ro co ccu s*

Especies de A b io tro p h ia *

Especies de L a c to b a c illu s **10

L e u co n o sto c

A b io tro p h ia * A e ro c o c c u s u rin a e S to m a to co ccu s m u cila g in o su s*

Especies de P e dioco ccus

Especies de A b io tro p h ia *

A e ro c o c c u s viridans

A e ro c o c c u s otitidis*

Especies de

E n te ro co ccu s G e m e lla h a e m o lysa n s H e lco co ccu s k u n z ii**

E n te ro co ccu s G em e lla m o rb illo ru m 11 Especies de Lacto co ccu s S to m a to co ccu s m u cila g in o su s*

Especies de S tre p to co ccu s 12

Especies de A b io tro p h ia : véase la descripción del género. Especies de Aerococcus'. véase cuadro 43-2 para diferenciar las especies A lio io co ccu s otitidis: véase la descripción dei género. Especies de A rca n o b a cte ríu m : véase cuadro 43-3 para diferenciar especies. Especies de C lo strid iu m : véanse diagramas 43-17 y 43-21 para diferenciar las especies aerotolerantes. Especies de G em e lla : véase cuadro 43-26 para diferenciar las especies. G lobicatella sang uis: véase la descripción del género. Especies de H e lcococcu s: véase la descripción del género. Especies de L a cto b a cillu s : véase cuadro 43-29 para diferenciar las especies aisladas con más frecuencia. Especies de L actococcus: véase cuadro 43-30 para diferenciar las especies. Especies de Leu consto c: véase cuadro 43-31 para diferenciar las especies aisladas más frecuentes. Especies de Liste ria :\/é a se diagrama 43-15 para diferenciar las especies. Especies de P e diococcus: véase cuadro 43-38 para diferenciar las especies. Especies de S ta phylococcus: véanse diagramas 43-37 a-43-39 para diferenciar las especies. S to m a to co ccu s m ucilagin osus: véase cuadro 43-46 para las características bioquímicas. Especies de T sukam urella: véase la descripción del género. Espacies de Vagococcus: véase cuadro 43-51 para diferenciar las especies. Especies de E n terococcus: véase diagrama 43-42. Especies de S tre p to co ccu s: véanse diagramas 43-43 a 43-45.

* Reacciones variables.

** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Catalasa negativos o débiles (seudocatalasa); debido a la catalasa no hémica (32). 2 Catalasa positivo pero débil; catalasa negativo sólo cuando se cultivan en medios exentos de sangre entera (p. ej., agar chocolate). 3 Algunas cepas exhiben actividad débil; por lo común catalasa negativo. 4 S ólo C. carnis, C. histolyficum y C. tertium son aerotolerantes; catalasa variable, por lo común negativo. 5 Catalasa positivos, cepas negativas raras (26). 6 Algunas cepas aerotolerantes; por lo común anaerobios estrictos (obligados); crecen mejor en anaerobiosis; catalasa variables. 7 Staphylococcus aureus subesp. anaerobius y Staphylococcus saccharolyticus catalasa negativos y por lo común sólo crecen en anaerobiosis. 8 LAP: leuclna aminopeptidasa. 9 PYR: pirrolidonll arilamidasa. 10 No se dispone de resultados para la resistencia a la vancomicina. 11 Según Facklam y Washington (17), con el objeto de evitar falsos negativos, la reacción de PYR debe realizarse con un inoculo grande. 12 Estreptococos del grupo A son PYR positivos; otras especies son negativas.

570

Esquemas de identificación

Diagrama 43-42.

Diferenciación de las especies de E n te ro c o c c u s . E. E. E. E. E. E.

avium casseliflavus cecorum columbae dispar durans

E. faecalis E. faecalis varíante E. íaecium E. flavescens E. gallinarum E. hirae

A A A

A A

tnterococcus saccharolyticus* E. faecalis* E. mundtii* E. solitarius

+ A

Manitol Sorbitol Sorbosa Arginina

E. casseliflavus* E. durans* E. ‘aecalis* E. faecium* E. flavescens E. gallinarum E. mundtii*

E. malodoratus E. mundtii E, pseudoavium E. raffinose E. saccharolyticus E. solitarius E. suifureus A

A A A

E. avium E. malodoratus E. pseudoavium E. raffinose E. saccharo lyticus

,Enterococus casseliflavus*

+ E. dispar E. durans* E. faecalis va riante E. faecium* E. hirae

C ontinúa en la página siguiente

Pigmentación amarilla A Lactosa

E. cecorum E. columbae E. suifureus

Enterococcus faecalis

Pigmentación NR amarilla NG NaCI al 6,5% G PYR 2

+ Enterococcus solitarius

Enterococcus mundtii

Manitol Sorbitol Sorbosa Arginina

G +

Enterococcus

cecorum

- Sacarosa + P YU 1 -

Enterococcus suifureus E. faecium* E. hirae Enterococcus dispar

A +

E. durans E. faecium*

Enterococcus faecalis variante

Arabinosa Hidrólisis del hipurato

Enterococcus faecium

Enterococcus columbae

Enterococcus hirae

45°C Arabinosa Glicerol

Enterococcus faecium

NG -

Enterococcus

durans

(continúa)

Bacterias grampositivas 571

Diagrama 43-42 (continúación)

A A +

G Telurito al 0,04% NG + PYU (piruvato)

E. casseliflavus E. gallinarum*

E. durans E. faecium E. flavescens E. gallinarum* E. nundtii

Enterococcus faecalis

Melibiosa Sacarosa Voges-Proskauer

Enterococcus pseudoavium

Enterococcus raffinose

Enterococcus avium E. malodoratus E. saccharolyticus

+ Pigmentación amarilla Glicerol A - Hidrólisis del hipurato + + Movilidad

A A

r tn lc rx o c c u s casseliflavus

Enterococcus gallinarum

Enterococcus malodoratus

—

+ Pigmentación — amarilla G G 45°C A A Arabinosa Adonitol

+ G A A

Adonitol Ramnosa

Enterococcus durans

Enterococcus flavescens

y E. faecium E. gallinarum*

Enterococcus mundtii

Tetrazolio al 0,01%

Enterococcus gallinarum * Reacciones variables.

1PYU: piruvato. 2 PYR: pirrolidonil-p-naftilamida (pirrolidonil arilamidasa).

Enterococcus faecium*1 2

Enterococcus saccharolyticus

572

Esquemas de identificación

Diagrama 43-43.

Diferenciación de las especies de S tre p to c o c c u s beta (P) hemolíticos. S. equi subesp. equi S. equi subesp. zooepidemicus S. iniae* S. intestinalis

S. agalactiae* S. canis S. dysgalactiae subesp. equisimilis S. equi

“S. S. S. S. S.

milled”*1 pneumoniae*2 porcinus* pyogenes suis*

Hidrólisis del hipurato Otros estreptococos beta (P)

Streptococcus agalactiae

CAMP-positivo Optoquina: S (sensible, susceptible) Encapsulado Grupo serológlco B de Lancefield A + +

Sorbitol Fosfatasa alcalina Hidrólisis de la esculina

A + -

S. equi subesp. zooepidemicus* “S. milled”* S. porcinus*

I______ , + B-glucuronidasa

S. iniae** S. intestinalis** S. pneumoniae* S. suis

S. canis S. dysgalactiae subesp. equisimilis* S. equi* S. iniae** S. intestinalis** “S. milled”*

Manitol Raflnosa Trehalosa A

S. equi subesp, “Streptococcus zooepidemicus milled" S. porcinus*

I____ , A

Treh alo sa

Streptococcus pneumoniae*3

Streptococcus Streptococcus equi subesp. porcinus zooepidemicus

Streptococcus iniae

Streptococcus pneumoniae*3

S. dysgalactiae sub esp. equisimilis* S. equi* S. equi subesp. equi “S. milled”* S. pyogenes |3-glucuron¡dasa

S. dvsgalactiae subesp. equisimilis Streptococcus S. equi intestinalis S. equi sub esp. equi

Streptococcus suis

“S. milled” S. pyogenes**

Véase cuadro 43-48 para la diferenciación

C ontinúa en la página siguiente

Ribosa S. canis S. iniae “S. millerr*

S. dysgalactiae su besp. equisimilis* S. equi S. intestinalis “S. millerl’**

Véase cuadro 43-48 para la diferenciación

(continúa)

Bacterias grampositivas 573

Diagrama 43-43. (Continuación)

A A

Ribosa Trehalosa

Streptococcus pyogenes*

Streptococcus equi subesp. equi

S. dysgalactiae subesp. equisim ilis S. equi

Véase cuadro 43-48 para diferenciar las especies*1 4 3 2

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Grupo S. milleri compuesto de las tres especies originales: S. anginosus, S. constellatusy S. intermedius. 2 S. pneumoniae en ocasiones exhibe beta (fi) hemolisis. 3 S. pneumoniae'.

Encapsulado Soluble en bilis Optoquina: S (sensible, susceptible) Morfología de la colonia + Colonias mucoides grandes + Crecimiento confluente Tipo III

Tipo I u otros tipos

4 S. pyogenes:

Optoquina: R (resistente) Bacitracina: S (sensible, susceptible) Grupo serológico A de Lancefield Estreptolisina O y S.

574

Esquemas de identificación

Diagrama 43-44. Diferenciación de de las especies de Streptococus alfa (a) o gamma (y) hemolíticus. S. acidom inim us

S. p o icin u s*

S. gordonii S. hyointestinalis S. iniae* S. m acacae “S. m illed” S. m itis S. m utans S. oralis S. pneu m oniae*

S. agalactiae* S. alactolyticus S. bovis S. crícetus S. dow nei S. dvsgalaciiae subesp. dysgalactiae S. equinus S. ferus

S. S. S. S. S. S. S. S.

ratti salivaríus sanguis sobrinus suis* therm ophilus uberis vestibularís

Hidrólisis del hipurato

S. acidom inim us S. agalactiae S. uberis S. vestibularis *

A A

Todos estreptococcus a o

y excepto S. agalactiae

y S. uberis NaCI al 6,5 % G Salicina a + Voges-Proskauer (VP) -

G A

Ribosa Sorbitol A

" 1 S. acidom inim us * S. alactolycus S. cricetus* S. porcinus* S. suis** S. vestibularis**

Streptococcus acidom inim us

Streptococcus uberis

S treptococcus agalactiae

Streptococcus vestibularis

Streptococcus soDiinus

Véase diagrama 43-45

CAMP-positivo Optoquina: S (sensible, susceptible) Capsulados Grupo serológico B de Lancefield

S. alactolyticus* S. suis** S. vestibularis**

A A

A A A

Lactosa Rafinosa Sorbitol ~

S. acidom inim us

Streptococcus cricetus

S. porcinus*

r Streptococus alactolyticus

S. suis**

Inulina

Streptococcus suis

Streptococcus p o rcin us*

S. vestibularis

Ribosa

.I Streptococcus porcinus

^ Streptococcus acidom inim us

G Bilis al 40% NG A Inulina

Streptococcus suis * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 La reacción positiva puede ser tardía.

Streptococcus vestibularis

S. alactolyticus S. vestibularis

Lactosa Rafinosa

í Streptococcus alactolyticus

A -

l Streptococcus vestibularis

Bacterias grampositivas 575

Diagrama 43-45. Diferenciación de las especies de S tre p to c o c c u s alfa (a) o gamma (y) hemolíticos que son negativos para la hidrólisis del hipurato y no crecen en NaCI al 6,5%. S. acidom inim us * S. bovis S. cricetus* S. downei S. dysgalactiae subesp. dysgalactiae S. equinus* S. ferus*

A -

A +

A A +

S. acidominimus S. bovis* S. cricetus S. downei S. ferus* S. iniae** S. m acacae** “S. m ille d ”* S. m utans S. porcinus S. ratti S. uberís**

S. gordonii S. hyointestinalis S. in ia e *,** S. m acacae “S. m illeri” * S. m itis* S. m utans S. oralis * S. pneum oniae

“S. m illed"* S. sobrinus

porcinus* ratti salivarius * sanguis sobrlnus* su is* therm ophilus** uberís ** S. vestibularis

A Manitol A Salicina A - Voges-Proskauer +

S. m acacae** “S. m ille d ”* S. pneum oniae 1

S. m aca ca e **

S. S. S. S. S. S. S. S.

S. ferus* S. iniae** S, m aca ca e * “S. m ille d ’'* S. sanguis S. uberís**

S. acidom inim us* S. b o vis* S. equinus* S. hyointestinalis “S. m illed” * S. salivarius* S. suis** S. vestibularis*

S. equinus* “S. m illed"* S. oralis * S. thermophilus *

S. dysgalactiae subesp. dys galactiae* S. gordonii “S. m illed"* S. mitis * S. salivarius* S. sanguis* S. suis ** S. vestibularis*

Véase cuadro 43-49 para diferenciar las especies * Resultados variables ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 S. pneumoniae encapsulado, soluble en bilis, optoquina: S (sensible, susceptible).

S. dysgalactiae subesp. dysga lactiae “S. m illed”* S. m itis* S. o ralis* S. pneum oniae 1 S. therm ophilus

576

Esquemas de identificación

Diagrama 43-46.

Diferenciación de los cocos grampositivos anaerobios. Especies Especies Especies Especies

de de de de

C e llu lo m o n a s

Especies de CoprococcusP Especies de E u bacte riurrP Especies ae L a cto b a cillu s 5

Especies d e P e p to stre p to co ccu s Especies d e P ro p io n ib a c te ríu rrf Especies d e S a rcin a

C lo strid iu m 5 6 *

P e p to co ccu s n ig e r 34

S tre p to co ccu s p le o m o rp h u s

A rca n o b a cte riu m *12 B ifid o b a cte riu m

C a talasa

Especies Especies Especies Especies Especies Especies

Especies de A rca n o b a cte riu m Especies de C e llu lo m o n a s Especies de C lo s trid iu m * E u b a cte ríu m le ntu m 7

Especies d e L a cto b a cillu s*8 P e p to co ccu s n ig e i 9

Especies d e P e ptostreptococcus*101 Especies de P ro p io n ib a cte riu m

E u bacte ríum le n tu m **

E u b a cte ríu m le n tu m ** P e p to co ccu s n ig e r

Especies de P e p to stre p to co ccu s Especies de P ro p io n ib a cte riu m

B ifid o b a cte riu m C lo strid iu m * C o p ro co ccu s E u b a cte ríu m L a cto b a cillu s *

Especies de P e p to stre p to co ccu s Especies de P ro p io n ib a cte riu m Especies de S a rcin a S tre p to co ccu s p le o m o rp h u s

Especies de A rca n o b a cte riu m Especies de C e llu lo m o n a s* Especies de C lo s trid iu m * Especies de L a cto b a cillu s

A rca n o b a cte riu m

P e p to co ccu s niger*

Movilidad Especies de C e llu lo m o n a s * Especies de C lo s trid iu m *

de de de de de de

M o vilid a d

Especies de C lo strid iu m * Especies de E u b a cte ríu m * Especies de L actobacillus ' 1 P e p to co ccu s n ig e r*

Especies d e Especies d e Especies d e Especies d e Especies d e Especies de

A rca n o b a c te riu m * B ifid o b a cte riu m C lo s trid iu m * C o p ro co ccu s E u bacto ríum 7 L a c to b a c illu s *

P e p to co ccu s n ig e fi

Especies de P e p to stre p to co ccu s* Especies de P ro p io n ib a cte riu m * Especies de S a rcin a S tre p to c o c c u s p le o m o rp h u s

anaerobios y Propionibacterium -. difíciles de dife renciar con precisión a nivel d e género sin el análisis d e los productos finales (19).

B ifid o b a cte riu m , E u bacte ríum , L a cto b a cillu s

Especies de A rca n o b a cte riu m : v éase cuadro 43-3 para diferenciar tres especies. A. h a e m o lyticu m CAMP inversa positivo Especies de B ifid o b a cte riu m : véanse la descripción del género y diagrama 43-28. Especies de C e llu lo m o n a s : v éa se la descripción del género. Especies de C lostridium : véan se cu w v w Especies de E ubacteríum : véase 3-23 para las especies que pueden cau sar infecciones hum anas y diagram as 43-28 a 43-31. Especies de Lactobacillus: v éa se cuadro 43-29 y diagrama 43-28 para la diferenciación de las especies aisladas con frecuencia de m uestras clínicas. P e p to co ccu s niger. v éa se la descripción del género HS2 positivo en el medio SIM. Especies de P e p tostreptococcus : v éase cuadro 43-39 para la diferenciación d e las especies que pueden cau sar infecciones huma nas y diagrama 43-47. Especies de P ropionibacte rium : v éanse cuadro 43-40 y diagram as 43-26, 43-27, 43-30 y 43-31 para diferenciar las especies aisladas con m ás frecuencia. Especies de Sarcina: v éa se cuadro 43-42 para la diferenciación d e las especies. S tre p to co ccu s p le o m o rp h u s: véase cuadro 43-47 para las características bioquímicas; H2S débilmente positivo (+). * R e sultados variables. ** N o s e d isp o n e d e resultado s; tra ta d o c o m o varia b le . 1 El cre cim ie n to en a n a e ro b io s is e s m e jo r q u e e n aerobiosis. 2 A lg u n a s c e p a s cre ce n e sca sa m e n te e n a na ero biosis. 3 A n a e ro b io s e stricto s (obligados). 4 P o cas esp e cie s ca p a ce s d e c re c e r e n p re se n cia d e a ire (p. ej., C. cam is, C. h is to ly tic u m y C. tertium ); aerotole rantes. 5 F a cu lta tivo s o a na e ro b io s e stricto s (obligado s); 2 0 % a n a e ro b io s o b liga dos; en o ca sio n e s m icroaerófilo s; c re ce n m a l e n pre se n cia d e a ire ; e i d e sa rro llo se in cre m e n ta c on la te n sió n d e o xíg e n o reducida. El a isla m ie n to d e a lg u n o s a n a e ro b io s se in cre m e n ta c o n e l d ió x id o d e c a rb o n o ( C 0 2). 6 P o r lo co m ú n ana e ro b io s e stricto s (obligado s); a lg u n a s ce p a s a e rotole rantes, pero cre ce n m e jo r en ana ero biosis. 7 C e p a s o c a sio n a le s de E u b a cte ríu m le n tu m son c a ta la s a positivas. 8 A lg u n a s c e p a s so n ca ta la sa p o sitiva s (26). 9 V a riable , p o r lo com ún neg ativo; p u e d e s e r p o sitivo débil. 10 P o cas ce p a s d éb ile s o pro d u ce n u n a reacció n d e s e u d o ca ta ia sa (p. e j., P. saccharolyticus). 11 M ovilidad rara.

Bacterias grampositivas 577

Diagrama 43-47. Diferenciación de las especies de Peptostreptococcus anaerobios. + +

Peplostreptococcus indolicus

Coagulasa N 0 3 -> N 0 2 Indol

Peptostreptococcus prevotii*

+ A

P anaerobius P asaccharolyticus*1 P. hydrogenalis P. lacrim alis P. m agnus P. m icros P. p re vo tii* R tetradius P. vagin*lis

U reasa Lactosa

Peptostreptococcus asaccharolyticus*

Peptostreptococcus vagin*lis **

P. lactolyticus P. vagin*lis**

1 P. anaeiobius P. asaccharolyticus P. hidrogenalis P. lacrimalis P. magnus P. micros P. prevotii* P. vagin*lis**

Véase cuadro 43-39 para diferenciar las especies que pueden causar infecciones humanas * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Cepas ocasionales son indol negativas (-).

P. pre vo tii* P. tetradius

P. vagin*lis**

578

Esquemas de identificación

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42.

43.

44.

45.

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CAPÍ TULO

Bacterias gramnegativas

C lasific ac ió n ..................................................................................................................................................... 580 Cambios en la nomenclatura de los bacilos gramnegativos y de los cocos gram negativos/Referencias.............................................................................................584 Descripciones y cuadros de los géneros ......................................................................................................592 Advertencias ..................................................................................................................................................... 647 Diagramas Bacilos Gramnegativos aerobios y anaerobios facultativ o s.........................................................................647 Gramnegativos microaerófilos y anaerobios ..................................................................................665 Cocos Gramnegativos aerobios y anaerobios facu ltativ o s.........................................................................664 Gramnegativos microaerófilos y anaero b io s.................................................................................... 671 Referencias ..................................................................................................................................................... 672

CLASIFICACIÓN Esquema general propuesto en el B ergey’s M anual o f Systematic Bacteriology, 2da edición.

Volumen 2: Proteobacterias Reino: Proteobacteria

SECCIÓN XV: a-PROTEOBACTERIAS Clase I: Rhodospirilli Orden IV: Sphingomonadales Familia: Sphingomonadaceae Sphingomonas: 23 especies Orden V: Caulobacterales Familia: Caulobacteraceae Brevundimonas: 7 especies Orden VI: Rhizobiales Familia I: Rhizobiaceae Agrobacterium : 5 especies Familia III: Bartonellaceae Bartonella: 14 especies Familia IV: Brucellaceae Brucella: 1 especie Ochrobactrum: 2 especies Familia VI: Bradyrhizobiaceae Afipia: 3 especies

Bacterias gramnegativas 581 Familia VII: M ethylobacteriaceae Methylobacterium: 10 especies Familia X: Ilyphomicrobiaceae Xanthobacter: 4 especies SECCIÓN XVI: (3-PROTEOBACTERIAS Clase: Neisseriae Orden I: Neisseriales Familia: Neisseriaceae Neisseria: 21 especies Kingella: 3 especies Chromobacterium: 1 especie Eikenella: 1 especie Orden II: Burkholderiales Familia I: Burkholderiaceae Burkholderia: 17 especies Ralstonia: 5 especies Familia III: Alcaligenaceae Alca!¡genes: 3 especies Bordetella: 7 especies Taylorella: 1 especie Familia IV: Comamonadaceae Comamonas: 2 especies Leptothrix: 1 especie SECCIÓN XVII: 5-PROTEOBACTERIAS Clase: Zymobacteria Orden II: Xanthom*onadales Familia: Xanthom*onadaceae Xanthom*onas: 22 especies Stenotrophom*onas: 2 especies Orden III: Cardiobacteriales Familia I: Cardiobacteriaceae Cardiobacterium: 1 especie Suttonella: 1 especie Orden IV: Thiotrichales Familia III: Francisellaceae F r a n c is e lla : 5 especies Orden V: Legionellales Familia I: Legionellaceae L e g io n e lla -. 39 especies Orden VIII: Pseudomonadales Familia I: Pseudomonadaceae P s e u d o m o n a s : 76 especies A c i d o v o r a x : 7 especies C h r y s e o m o n a s : 1 especie F la v im o n a s : 1 especie J a n th i n o b a c te r iu m : 1 especie M o r o c o c c u s : 1 especie O lig e lla : 2 especies Familia II: Moraxellaceae M o r a x e lla : 13 especies A c in e t o b a c te r : 1 especies P s y c h r o b a c t e r : 5 especies Orden IX: Alteromonadales

582

Esquemas de identificación

Familia: Alteromonadaceae S h e w a n e l l a : 12 especies Orden X: Vibrionales Familia: Vibrionaceae V ib r io : 39 especies Orden XI: Aeromonadales Familia: Aeromonadaceae A e r o m o n a s : 22 especies Orden XII: Enterobacteriales Familia: Enterobacteriaceae (véase cap. 45) Orden XIII: Pasteurellales Familia: Pasteurellaceae P a s t e u r e l l a : 19 especies H a e m o p h i l u s : 17 especies A c ti n o b a c il lu s : 16 especies

SECCIÓN XIX: 8-PROTEOBACTERIAS Clase: Campylobacteres Orden I: Campylobacterales Familia I: Campylobacteraceae C a m p y l o b a c te r . 18 especies Familia 11: Helicobacteraceae H e l i c o b a c t e r : 18 especies W o lin e lla : 1 especie

Volumen 3: Bacterias grampositivas con bajo contenido de G + C (DNA con bajo contenido de guanina más citosina; bacterias con formas más regulares) SECCIÓN XX: CLOSTRIDIOS Y MICROORGANISMOS RELACIONADOS

Clase: Clostridia Orden I: Clostridiales Familia II: Peptostreptococcaceae P e p to s t r e p t o c o c c u s : 15 especies Familia III: Eubacteriaceae T is s ie r e lla : 3 especies Familia IV: Lachnospiraceae B u ty r iv ib r io : 2 especies Familia V: Peptococcaceae A c id a m in o c o c c u s : 1 especie M e g a s p h a e r a : 2 especies S e le n o m o n a s : 11 especies M i t s u o k e l l a : 1 especie V e illo n e lla : 7 especies S u c c i n i v i b r i o : 1 especie

SECCIÓN XXI: MOLLICUTES Clase: Mollicutes Orden: Mycoplasmatales Familia I: Mycoplasmataceae M y c o p la s m a '. 104 especies U re a p la s m a -, 6 especies Familia II: Acholeplasmataceae A c h o le p l a s m a : 13 especies

Bacterias gramnegativas 583 S E C C IÓ N XXII: BACILO S Y LACTO BACILO S

Clase: Bacilli Orden II: Lactobacillales Familia VIII: Staphylococcaceae G e m e lla : 4 especies

Volumen 4: Bacterias grampositivas con alto contenido de G + C (DNA con alto contenido de guanina más citosina; bacterias con formas irregulares) S E C C IÓ N XXIII: C LA SE A C T IN O B A C TE R IA

Subclase V: Actinobacteridae Orden I: Actinomycetales Suborden I: Actinomycineae Familia: Actinomycetaceae M o b ilu n c u s : 3 especies Orden II: Bifidobacteriales Familia: Bifidobacteriaceae G a r d n e r e lla : 1 especie

Volumen 5: Planctomicetos, Espiroquetas, Fibrobacterias, Bacteroides y Fusobacterias Reino: Bacteroides Division I: Bacteroides S E C C IÓ N XXVII: B A C T E R O ID E S

Clase I: Bacteroides Orden: Bacteroidales F am ilial: Bacteroidaceae B a c te r o id e s : 25 especies A n a e r o r h a b d u s : 1 especie C e n tip e d a : 1 especie M e g a m o n a s : 1 especie A n a e r o b io s p ir i ll u m : 1 especie S u c c in im o n a s : 1 especie Familia III: Porphyromonadaceae P o r p h y r o m o n a s : 12 especies Familia IV: Prevotellaceae P r e v o te lla : 26 especies S E C C IÓ N X X V III: FLA VO B ACTERIAS

Clase II: Flavobacteria Orden: Flavobacteriales Familia I: Flavobacteriaceae F la v o b a c te r iu m : 19 especies W e e k s e lla : 1 especie C a p n o c y to p h a g a : 7 especies S E C C IÓ N XXX: FU S O B A C T E R IA S

Reino: Fusobacteria Clase: Fusobacteria Orden: Fusobacteriales Familia: Fusobacteriaceae

58 4

Esquemas de identificación

Fusobacterium: 20 especies Propionigenium : 2 especies Leptotrichia: 1 especie Streptobacillus: 1 especie (Nota: En este esquema de clasificación de Bergev se enumeran sólo los microorganismos que se tra tan en este capítulo o los géneros y especies nuevos mencionados en la Nueva Nomenclatura. Cortesía del esquema del Dr. George Garrity, Director, Bergey’s M anual Trust.)

CAMBIOS EN LA NOMENCLATURA DE LOS BACILOS GRAMNEGATIVOS Y DE LOS COCOS GRAMNEGATIVOS (Nota: Bergey’s M anual o f Determinative Bacteriology, 9na edición, fue impreso en 1994; en conse cuencia, las referencias a nuevos géneros y especies se refieren a las mencionadas desde 1995 a 1999.)

Definiciones Basónimo: nombre original de una nueva combinación Sinónimo: Objetivo: más de un nombre Subjetivo: nombre diferente a tipos diferentes; publicado primero, “senior” ; último, “junior” comb, nov.: combinación nueva; especie transferida a otro género o subespecie transferida a otra especie gen. nov.: género nuevo sp. nov.: especie nueva nomen dubium: nombre dudoso Nombre actual

Nombre antiguo (basónimo(s) y sinónimo(s))

Achromobacter piechaudü Alcaligenes piechaudii Achromobacter ruhlandii Alcaligenes ruhlandii Achromobacter xylosoxidans subesp. denitrificans Alcaligenes denitrificans Achromobacter xvlosoxidans subesp. xylosoxidan Alcaligenes xylosoxidans Acidovorax avenae subesp. avenae Pseudomonas avenae, Pseudotnonas avenae subesp. avenae, Pseudomonas rubrilineans Acidovorax avenue subesp. cattleyae Pseudomonas cattleyae Acidovorax avenae subesp. citrulli Pseudotnonas avenae subesp. citrulli, Pseudomonas pseudoalcaligenes subesp. citrulli Acidovorax delafieldii Acidovorax facilis Acidovorax konjac

Pseudomonas delafieldii Pseudomonas facilis Pseudomonas avenae subesp. konjaci, Pseudomonas pseudoalcaligenes subesp. konjaci

Actinobacillus delphinicola, sp. n o v .1 Actinobacillus indolicus, sp. nov.2 Actinobacillus minor, sp. nov.2 Actinobacillus porinus, sp. nov.2 Actinobacillus scotiae, sp. nov.3 Actinobacillus succinogeries, sp. nov.4 Actinobacillus ureae Aeromonas encheieia, sp. nov., corregid a5 Aeromonas eucrenophila, sp. nov., corregida5 Aeromonas popojfii, sp. nov.5 Aeromonas tructi Agrobacterium tumefaciens Alcaligenes defragrans, sp. nov.6 Alcaligenes denitrificans A Icalige, íes xylosoxidans Aminobacter aminovorans Anaerobiospirillum thomasii, Anaerorhabdus furcosus Arcobacter butzleri

Pasteurella ureae

Aeromonas trota, no m bre in co rre cto Agrobacterium radiobacter Alcaligenes denitrificans subesp. denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans subesp. denitrificans Alcaligenes denitrificans subesp. xylosoxidans,Alcali genes xylosoxidans subesp. xylosoxidans, Achromo bacter xylosoxidans Pseudomonas aminovorans

sp. nov.7

Bacteroides furcosus Campylobacter butzleri

Bacterias gramnegativas 585 Arcobacter cryaerophilus Arcobacter nitrofigilis Aureobacterium esteraromaticum Bartonella alsaticia, sp. nov.8 Bartonella clarridgeiae, sp. nov.9 Bartonella doshiae, sp. nov.10 Bartonella elizabethae Bartonella grahamii, sp. nov.10 Bartonella henselae Bartonella peromysci, comb, nov.10 Bartonella quintana Bartonella talpae, comb, nov.10 Bartonella taylorii, sp. nov.10 Bartonella tribocorum, sp. nov.11 Bartonella vinsonii subesp. berkhoffii, subesp. nov.12 Bartonella vinsonii subesp. vinsonii Brevundimonas alba, sp. nov., comb, nov.13 Brevundimonas aurantiaca, sp. nov.13 Brevundimonas bacteroides, comb, nov.13 Brevundimonas diminuta Brevundimonas intermedia, comb, nov.13 Brevundimonas subvibrioides, comb, nov.13 Brevundimonas vescularis Brucella melitensis Burkholderia, gen. nov., corregido14 Burkholderia andropogonis, sp. nov.14 Burkholderia caryophylli Burkholderia cepacia Burkholderia cocovenenans, sp. nov.14 Burkholderia gladioli Burkholderia. glathei, comb, nov.15 Burkholderia glumae Burkholderia graminis, sp. nov.15 Burkolderia mallei Burkholderia multivorans, sp. nov.16 Burkholderia norinbergensis, sp. nov.17 Burkholderia phenazinum, comb, nov.15 Burkholderia plantarii Burkholderia pseudomallei Burkholderia pyrrocinia, sp. nov.15 Burkholderia thailandensis, sp. nov.18 Burkholderia vietnamiensis, sp. nov,14 Campylobacter coli Campylobacter cryaerophilus Campylobacter curvus Campylobacter gracilis, comb. nov.19 Campylobacter lari Campylobacter mucosalis Campylobacter rectus Capnocytophaga canimorsus Capnocytophaga cynodegmi Capnocytophaga gingivalis Capnocytophaga ochracea Capnocytophaga sputigena Carbophilus carboxydus Chryseobacterium balustinum Chryseobacterium gleum Chryseobacterium indologenes Chryseobacterium indoltheticum Chryseobacterium luteola Chryseobacterium meningosepticum Chryseobacterium sacchaiophilum Chryseobacterium scophthalmum Comámonos acidovorans Comámonos terrigena

Campylobacter cryaerophilus Campylobacter nitrofigilis Flavobocterium esteraromaticum

Aochalimaea elizabethae Rochalimaea henselae Rochalimaea quintana

Rochalimaea vinsonii Caulobacter bacteroides Pseudomonas diminuta Caulobacter intermedius Caulobacter subvibrioides Pseudomonas vescularis Brucella abortus, Brucella canis, Brucella neotomae, Brucella ovis, Brucella suis Pseudomonas andropogonis Pseudomonas caryophylli Pseudomonas cepacia Pseudomonas cocovenenans Pseudomonas gladioli, Burkholderia cocovenenans Pseudomonas glathei Pseudomonas glumae Pseudomonas mallei Pseudomonas phenazinum Pseudomonas plantarii, Burkholderia vandii Pseudomonas pseudomallei Pseudomonas pyrrocinia Campylobacter hyoilei Campylobacter cryaerophila, nombre incorrecto Wolinella curva Bacteroides gracilis Campylobacter laridis, nombre incorrecto Campylobacter sputorum subesp. mucosalis Wolinella recta CDC grupo DF-2 CDC grupo DF-2-símil CDC grupo DF-1 Bacteroides ochraceus, CDC grupo DF-1 CDC grupo DF-1 Alcaligenes carboxydus Flavobacterium balustinum Flavobocterium gleum Flavobacterium inodologenes Flavobacterium indoltheticum Chryseobacterium polytricha, Pseudomonas luteola, CDC grupo Ve-1 Flavobacterium meningosepticum Cytophaga saccharophila Flavobacterium scophthalmum Pseudomonas acidovorans Aquaspirillum aquaticum

586

Esquemas de identificación Comámonos testosteroni Cytophaga uliginosa Dalftia acidovorans Dietzia maris Empedobacter brevis Flavimonas oryzihabitans Flavobacterium branchiophilum Flavobacterium capsulata Flavobacterium columnare, sp. nov.20 Flavobacterium flevense, sp. nov.20 Flavobacterium halmephiluma Flavobacterium hibemum, sp. nov.21 Flavobacterium hydatis, sp. nov.20 Flavobacterium johnsoniae, sp. nov.20 Flavobacterium mizutaii Flavobacterium pectinovorum, sp. nov.20 Flavobacterium psychrophilum, sp. nov.20 Flavobacterium saccharophilum, sp. nov.20 Flavobacterium succinicans, sp. nov.20 Fluoribacter bozemanae Fluoribacter dumoffii Fluoribacter gormanii Francisella philomiragia Fusobacterium varium Gemella bergeriae, sp. nov.22 T Gemella sanguinis, sp. nov.22 Flaemophilus actinomycetemcomitans Haemophilus fe lis, sp. nov.23 Halomonas aquamarina Halomonas cupido Halomonas halmophila Halomonas halodurans Halomonas marina Halomonas pacifica Halomonas paradoxus Halomonas venusta Helicobacter acinonychis Helicobacter bilis, sp. nov.24 Helicobacter bizzozeronii, sp. nov.25 Helicobacter cholecystus, sp. nov.26 Helicobacter cinaedi Helicobacter fennelliae Helicobacter mustelae Helicobacter pullorum, sp. nov.27 Helicobacter pylori Helicobacter rodentium, sp. nov.28 Helicobacter salomonis, sp. nov.29 Helicobacter trogontum, sp. nov.30 Herbaspirillum rubrisubalbicans Hydrogenophaga flava Hydrogenophaga pallaronii Hydrogenophaga pseudoflava Kingella kingae Legionella lytica, comb, nov.31 Legionella taurinensis, sp. nov.32 Legionella waltersii, sp. nov.33 Mannheimia granulomatis Mannheimia haemolytica Marinobacter hydrocarbonoclasticus Megamonas hypermegas Mesoplasma lactucae Methylobacterium mesophilicum Methylobacterium radiotolerans Methylobacterium rhodinum Methylobacterium thiocynatum, sp. nov.34

Pseudomonas testosteroni Flavobacterium uliginosum Comámonos acidovorans Flavobacterium maris Flavobacterium brevis CDC Ve-2 Flavobacterium branchiophila, nombre incorrecto Flavobacterium capsulatum Cytophaga columnaris, Flexibacter columnar Cytophaga fevensis Flavobacterium halmephilium, nombre incorrecto Cytophaga aquatilis Cytophaga johnsoniae Sphingobacterium mizutae Cytophaga pectinovora Cytophaga psychrophila, Flexibacter psychrophila Cytophaga saccharophila Cytophaga succinicans Legionella bozemanii Legionella dumojfii Legionella gormanii Yersinia philomoragia Fusobacterium pseudonecrophorum Actinobacillus actinomycetemcomitans Alcaligenes aestus, Alcaligenes aquamarinus, Alcalige nesfaecalis, subesp. homari Alcaligenes cupidus Flavobacterium halmephilum Pseudomonas halodurans Pseudomonas marina Alcaligenes pacifica Alcaligenes paradoxus Alcaligenes venustus Helicobacter acinix, nombre incorrecto

Campylobacter cinaedi Campylobacter fennelliae Campylobacter mystelae, Campylobacter pylori subesp, mustelae Campylobacter pylori, Campylobacter pyloridis

Pseudomonas rubrisubalbicans Pseudomonas flava Pseudomonas palleroni Pseudomonas pseudoflava Moraxella kingae Sarcobium lyticum Pasteurella gn inulomatis Pasteurella haemolytica Pseudomonas nautica Bacteroides hypermegas Mycoplasma lactucae Pseudomonas mesophilica Pseudomonas radiora Pseudomonas rhodos

Bacterias gramnegativas 587 Microbacterium arborescens Microbacterium maritypicum Mitsuokella multiacidus Moraxella atlantae Moraxella boevrei, sp. nov.35 Moraxella caprae, sp. nov.36 Moraxella catarrhalis Moraxella caviae Moraxella cuniculi Moraxella lac*nta Moraxella ovis Moritella marina Mycoplasma adleri, sp. nov.37 Mycoplasma crocodyli, sp. nov.38 Mycoplasma elephantis, sp. nov.38 Mycoplasma lagogenitalium, sp. nov.39 Mycoplasma stumi, sp. nov.40 Myroides odoratus Ochrobactrum anthropi Ochrobactrum intermedium, sp. nov.41 Oligella ureolytica Oligella urethralis Oligotrophia carboxidovorans Pasteurella avium Pasteurella bettyae Pasteurella dagmatis Pasteurella gallicida Pasteurella langaaensis, sp. nov. Pasteurella lymphangitidis Pasteurella trehalosi Photobacterium iliopiscarium Planococcus okeanokoites Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas assemblage Porphyromonas catonia Porphyromonas endodontalis Porphyromonas gingivalis Porphyromonas levii, com b, nov.42 Porphyromonas macacae Prevotella biva Prevotella brevis Prevotella buccae Prevotella buccalis Prevotella corporis Prevotella dentalis, com b, nov.43 Prevotella denticola Prevotella disiens Prevotella heparinolytica Prevotella intermedia Prevotella loescheii Prevotella melaninogenica Prevotella omlis Prevotella oris Prevotella oulora Prevotella pattern, sp. nov.44 Prevotella ruminicola subesp. ruminicola Prevotella veroralis Prevotella zoogleoformans Propionigenium maris, sp. nov.45 Pseudoalteromonas nigrifaciens Pseudoalteronionas piscicda Pseudomonas abietaniphila, sp. nov.46 Pseudomonas amygdali Pseudomonas avellanae, sp. nov.47 Pseudomonas baleárica, sp. nov.48

Flavobacterium arborescens Flavobacterium maritypicum Bacteroides multiacidus C D C G rupo M -3

Branhamella catarrhalis Neisseria caviae Neisseria cuniculi Moraxella liquefaciens Branhamella ovis, Neisseria ovis Vibrio marinus

Flavobacterium odoratum C D C g rupo V d, C D C g rupo V d (biotipos 1 y 2) C D C grupo IVe

Moraxella urethralis Pseudomonas carboxidovorans Haemophilus avium Pasteurella bettii, H B -5 C D C P asteurella sp “n. sp. 1” (P asteurella “g as” ) N o m b re rechazado Pasteurella langaa, nom bre incorrecto G ru p o B L G Pasteurella haemolytica, b io v ar T

Vibrio iliopiscarius Flavobacterium okeanokoites Bacteroides asaccharolyticus Bacteroides asaccharolyticus Oribaculum catoniae Bacteroides endodontalis Bacteroides gingivalis Bacteroides melaninogenicus subesp. macacae, Bacte roides salivosas, Porphyromonas salivosas Bacteroides bivius Bacteroides ruminicola, Prevotella ruminicola Bacteroides buccae, Bacteroides capillus Bacteroides buccalis Bacteroides corporis Mitsuokella dentalis Bacteroides denticola Bacteroides disiens Bacteroides heparinolyticus Bacteroides intermedium, Bactefbides melaninogenicus Prevotella c ep a D IC -20, Bacteroides loescheii Bacteroides melaninogenicus Bacteroides oralis Bacteroides oris Bacteroides oulora Prevotella brevist Bacteroides ruminicola subesp. rumi nicola Bacteroides veroralis Bacteroides zoogleoformans, Capsularis zoogleoformans Pseudomonas nigrifaciens Pseudomonas piscicida Pseudomonas ficuserectae Pseudomonas syringae pv. avellanae

588

Esquemas de identificación Pseudomonas beteli Pseudomonas cannabina, sp. nov.49 Pseudomonas chlororaphis Pseudomonas corrugata, sp. nov.50 Pseudomonas graminis, sp. nov.51 Pseudomonas hibiscicola Pseudomonas jessenii, sp. nov.52 Pseudomonas libanensis, sp. nov.53 Pseudomonas tuteóla Pseudomonas mandelii, sp. nov.52 Pseudomonas monteilii, sp. nov.54 Pseudomonas multiresimivorans, sp. nov.46 Pseiuiomonas rhodesiae, sp. nov.55 Pseudomonas savastanoi Pseudomonas stutzeri Pseudomonas syringae Pseudomonas tremae, sp. nov.49 Pseudomonas vancouverens, sp. nov.46 Pseudomonas veronii, sp. nov.56 Psychrobacter phenylpyruvicus Psychroflexus gondwanensis Ralstonia eutropha Ralstonia gilanii, sp. nov.57 Ralstonia pickettii Ralstonia solanacearum Ríeme relia anatipestifer Rochalimaea Ruegeria atlántica Ruegeria gelatinovorum Selenomonas acidminovorans, sp. nov.58 Selenomonas lipolytica, sp. nov. Shewanella amazonensis, sp. nov.61 Shewanella báltica, sp. nov.62 Shewanella frigidimarina, sp. nov.60 Shewanella gelidimarina, sp. nov.60 Shewanella oneidensis, sp. nov.63 Shewanella putrefaciens Shewanella violácea, sp. nov.64 Shewanella woodyi, sp. nov.65 Slackia heliotrinireducens Sphingobacterium heparinum Sphingobacterium multivorum Sphingobacterium pophilum Sphingobacterium spiritivorum Sphingobacterium thalpophilum Sphingomonas aromaticivorans, sp. nov.66 Sphingomonas asaccharolytica, sp. nov.67 Sphingomonas capsulata Sphingomonas echinoides, sp. nov.68 Sphingomonas malí, sp. nov.67 Sphingomonas natatoria, comb, nov.69 Sphingomonas paucimobilis Sphingomonas pruni, sp. nov.67 Sphingomonas rosa, sp. nov.67 Sphingomonas stygia, sp. nov.66 Sphingomonas subarctica, sp. nov.70 Sphingomonas suberifaciens, sp. nov.69 Sphingomonas subterránea, sp. nov.70 Sphingomonas trueperi, sp. nov.71 Sphingomonas ursincola, comb, nov.69 Stenotrophom*onas maltophilia Suttonella indologenes Tatlockia maceachemii Tatlockia micdadei Taylorella equigenitalis Telluria mixta

Pseudómonas betle, nombre incorrecto; Xanthom*onas maltophila Pseudomonas aureofaciens Xanthom*onas maltophila Chryseomonas polytrichia

Pseudomonas syringae subesp. savastanoi Pseudomonas perfectomarina Pseudomonas compransoris

Moraxella phenylpyruvicus Flavobacterium gondwanense Alcaligenes eutrophu.s Pseudomonas pichettii Pseudomonas solanacearum Moraxella anatipestifer Género eliminado Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium meteori Agrobacterium gelatinovorum

Pseudomonas putrefaciens, Alteromonas putrefaciens Peptostreptococcus heliotrinireducens Flavobacterium heparinum Flavobacterium multivorum Flavobacterium pophilum Flavobacterium spiritivorum Flavobacterium thalpophilum Flavobacterium capsulatum Pseudomonas echinoides Blastobacter natatorius, Blastomonas natatoria Flavobacterium devomns, Pseudomonas paucimobilis

Erythromonas ursincola Pseudomonas maltophilia, Xanthom*onas maltophilia Kingella indologenes Legionella maceachemii Legionella micdadei, Legionella pittsburghensis Especie de clasificación incierta en el género Ilaemo philus Pseudomonas mixta

Bacterias gramnegativas 589 Tissierella creantinophila, sp. nov.73 Tissierella creatinini, sp. nov.72 Tissierella praeacuta Variovorax paradoxus Veillonella aíypica Veillonella criceti Veillonella dispar Veillonella parvua Veillonella ratti 'ifeillonella rodentium Vibrio alginolyticus Vibrio campbellii Vibrio cholerae Vibrio gazogenes Vibrio halioticoli, sp. nov.74 Vibrio ichthyoenteri, sp. nov.75 Vibrio iliopiscarius, sp. nov.76 Vibrio logei Vibrio natriegens Vibrio nereis Vibrio nigripulchritudo Vibrio parahaemolyticus Vibrio pectenicida, sp. nov.77 Vibrio penaeicida, sp. nov.78 Vibrio proteolyticus Vibrio rumoiensis, sp. nov.79 Vibrio scophthalmi, sp. nov.80 Vibrio splendidus Vibrio tapetis, sp. nov.81 Vibrio trachuri, sp. nov.82 Vibrio vulnificus Vógesella indigcfera Weeksella virosa Weeksella zoohelcum Wolinella succinogenes Xanthom*onas arboricola, sp. nov.83 Xanthom*onas bromi, sp. nov.83 Xanthom*onas campestris, sp. nov.83 Xanthom*onas cassavae, sp. nov.83 Xanthom*onas codiaei, sp. nov.83 Xanthom*onas cucurbitae, sp. nov.83 Xanthom*onas hortorum, sp. nov.83 Xanthom*onas hyacinthi, sp. nov.83 Xanthom*onas melonis, sp. nov.83 Xanthom*onas pisi, sp. nov.83 Xanthom*onas saccari, sp. nov.83 Xanthom*onas theicola, sp. nov.83 Xanthom*onas thranslucens, sp. nov.83 Xanthom*onas vasicol, sp. nov.83 Xanthom*onas vesicatoria, sp. nov.83 Zavarzinia compransoris

Bacteroides praeacutus Alcaligenes paradoxus Veillonella párvula subesp. atypica Veillonella alcalascens subesp. criceti Veillonella alcalescens subesp. dispar Veillonella alcalescens subesp. párvula Veillonella alcalescens subesp. ratti Veillonella alcalescens subesp. rodentium Beneckea alginolytica Beneckea campbellii Beneckea harveyi, Lucibacterium har\i£yi Beneckea gazogenes

Photobacterium logei Beneckea natriegens Beneckea nereida Beneckea nigrapulchrituda Beneckea parahaemolytica Aeromonas hydrophila subesp. proteolytica Beneckea splendida Beneckea gulnifica Pseudomonas indigofera C D C grupo I lf C D C grupo Ilj

Vibrio succinogenes

Pseudomonas compransoris

„ (Nota: En el afio 2000, el International Journal o f Systematic Bacteriology (USB) se transformó en el International Journal o f Systematic and Evolutionary M icrobiology (IJSEM).)

590

E s q u e m as d e identificación

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52 53

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592

Esquemas de identificación

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DESCRIPCIONES Y CUADROS DE LOS GÉNEROS

Glucosa O/F

Movilidad. 37°C

R e d u c ció n de n itra to s

A g a r M a cC o n k e y (M A C )

Oxidasa

C a tdlasa

B a c te ria s

R e q u e rim ie n to s de oxígeno

Cuadro 44-1. Características diferenciales de las bacterias gramnegativas aerobias y anaerobias facultativas de importancia médica

Bacilo (cocobacilos) Acholeplasm a Acidovorax Acinetobacter Actinobacillus3 A erom onas Afipia Agrobacterium Alcaligenes Bartonella Bordetella Brevundimonas BrucellaP Burkholderia Capnocytophaga Cardiobacterium Chrom obacterium

Fac Aer

Fac Fac Fac Fac Aer OAer Aer OAer Aer Aer Aer

Fac Fac Fac

NR +

V+

F O

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F/O F/O

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v-° V+ V

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V VV-

V+

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V V

—

v+ V V-

0 0 0

+ -

01-

F F

Bacterias gramnegativas 593

Enterobacteriaceae^ Fiavim onas Ftavobacteriurrf' Francisellaf1 Gardnerella Haemophilus! Janthinobacterium Kingeüa Legionella M ethylobacterium M oraxella Mycoplasm a O ch ■ ibactm m Oligella PasteurellaF Pseudom onas Ralstonia fíoseom onas Shewanella Sphingom onas Stenotrophom onas Streptobacillus Suttonella VibrícP Weei- siella Xandobacer Xanthom onas

Aer OAer Fac Fac Aer Aer OAer Fac Fac OAer Fac Aer Aer Aer Fac OAer Aer Fac Aer Aer Aer Aer Aer Aer Fac Fac Fac Aer OAer OAer

_|_W -

V + + +c + + +

v+ + NR + + + NR — + + + +

+ VV v+ + V-w +c + NR + + +n V +

v+c +

v+ + v+ + + V~w

G Ge NG G G G1 NG NR vNR NG NG V V NR G V+ V G NR G G NG G NG NG G NG NR G

G lu co sa O /F

M ovilidad, 3 7 °C

+ +

R e d u c c ió n de n itra to s

+ + V+ + +

A g a r M acC onke y (M A C )

O xid a sa

Chryseom onas Com am onas Eikenellaf

C a talasa

B a c te ria s

R e q u e rim ie n to s de o xíg en o

Cuadro 44-1. Características diferenciales de las bacterias gramnegativas aerobias y anaerobias facultativas de importancia médica (Continuación)_____________________________________

V+ + + NR + V NR V V NR NR V V+ V V+ V + V v+ +

+ V V -

O F

F F F/0 F F — /NG NR

+ V + V + V V + V + + + —

0 01

0 0 0

O I0

o o F F F /0 -

V +

V NR

—

F -/N G -/N G F OP

Cocos (diplococos) Alcaligenes Gemella Moraxella catarrhalis Moraxella ovis M orococcus Neisseria Psychrobacter

OAer Fac Aer Aer Aer Aer Fac

—

+ + + V+ +

+ + + + +

G NR NG V NR NR G^

v+ + + VV

O I-

G, crecimiento (growth); NG, sin crecimiento; NR, no se dispone resultados; V, reacciones variables; V+, variable, por lo general positivo; V", variable, por lo general negativo; O, oxidativo; F, fermentativo; O/F glucosa inerte; w, reacción débil (weak); Aer, aerobio; Fac, anaerobio facultativo; OAer, aerobio obligado (estricto). a Requiere el agregado de suero al medio basal para estimular el crecimiento (8 ). b Puede haber un leve crecimiento. c La reacción positiva puede ser tardía o positiva débil. d No considerar los cultivos primarios negativos hasta después de 21 días de incubación. e El pigmento puede interferir con la reacción de oxidasa; el pigmento sólo se produce en presencia de oxígeno (0 2); uti lizar un desarrollo no pigmentado proveniente de un cultivo en anaerobiosis para comprobar la oxidasa. ' “Depresión” en la superficie del agar. a Véase capítulo 45, Enterobacteriaceae, para las características bioquímicas. hTemperatura de incubación global preferible por debajo de 30°C. ' El crecimiento puede ser malo. i A menudo inerte (-) en las primeras 24-48 h de incubación; mejor tratado como un oxidante (O). k No crece en los medios de cultivo habituales; utilizar un medio con cisteína. 1No crece en los medios de cultivo habituales; requiere factor de crecimiento X, V o ambos. mEl crecimiento inicial se estimula por el agregado de sangre o suero al agar con aumento de dióxido de carbono (C02). n Raramente oxidasa negativa con el reactivo de Kovacs. ° Desarrolla mejor en medios alcalinos. p Fermentadores cuestionables; reacción más temprana que la de un oxidante (O). d Desarrollo deficiente; desarrolla mejor a 20-25°C.

594

Esquemas de identificación

G lu co sa O /F

M ovilidad, 3 7 °C

R e d u c c ió n de n itra to s

A g a r M acC onk e y (M A C )

O xid a sa

C a ta la sa

B a c te ria s

R e q u e rim ie n to s de o x íg e n o

Cuadro 44-2. Características diferenciales de las bacterias gramnegativas no formadoras de esporas, microaerófilas a anaerobias obligadas de importancia médica _______________________

Bacilos (cocobacilos) Anaerobiospirilum Anaerorhabdus Bacteroides Butyrivibrio Cam pylobacter Centipeda Fusobacterium Helicobacter LeptotiichisP M egam onas M itsuokella M obiluncus Porphyrom onas Propionigenium Prevotelia Selenom onas Succinim onas Succinivibrio Taylorella Tissierella Ureaplasm a Wolinella

Anaer Anaer OAnaer OAnaer OMicro Anaer OAnaer Micro Anaer Anaer Anaer Anaer Anaer Anaer Anaer OAnaer OAnaer OAnaer Micro Anaer Micro Micro

Cocos (diplococos) Acidam inococcus M egasphaera Peptostreptococcus Veillonella

Anaer Anaer Anaer Anaer

— v-

NR NR v-

v+ NR

+ NR

—

NR NR

NR NR NR

+ — —

— -

NR NR

NR NR NR NR V+ NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR G

—

V-

V NR

NR NR v-

— V

NR NR

— V+ + + +

— +

+b +b + +

F F F /F

F pw F F F F pw F F F F F F O Fw/0

NR NR NG

—

NR NR NR NG

v -+

— --

F (-)c F F F

—

NR, no se dispone de resultados; G, crecimiento (growth); NG, sin crecimiento; O, oxidativo; - , inerte; Anaer, anaerobio; OAnaer, anaerobio obligado (estricto); Micro, microaerófilo; w, reacción débil (weak): V, reacciones variables; V+, variable, por lo general positivo; V~, variable, por lo general negativo. a Puede ser aerotolerante; C 0 2 (5%) es esencial para el aislamiento; el líquido ascítico, el suero o el almidón incremen tan el desarrollo; el tioglicolato puede inhibir algunas cepas. b Lenta y progresiva; puede perderse con la exposición al aire. c Fermentativo débil (F); puede ser inerte (-).

GÉNERO: A C H O LEPLASM A (14) Células gramnegativas filamentosas y esféricas unidas sólo por una m embrana plasmática; mollicutes No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa, no producen No encapsulados Inmóviles Oxidasa, no producen O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 20-40°C 13 especies: A. axanthum, A . brassicae, A. cavigenitalium, A. equifetale, A. granularum, A. hippikon, A. laidlawii, A. modicum, A. morum, A. multilocale, A. oculi, A. palmae, A. parvum Especie tipo: A. laidlawii ATCC 23206 Requieren suero o colesterol para el desarrollo Las colonias en medios sólidos tienen aspecto de “huevo frito”

Bacterias gramnegativas 595

Movilidad A Glucosa A Mañosa Hidrólisis de la esculina Arginina deshidrolasa Licuefacción de la gelatina, 22°C NR NR Hidrólisis de la caseína U reasa -

A. parvum

A. oculi

A morum

A laidlawii

A. hippikon

A granularum

A. equifetale

P ru e b a

A axanthum

Cuadro 44-3. Diferenciación de las especies de A c h o le p la s m a aisladas con más frecuencia

A V V

A +

A V V V

NR -

A, producción de ácido (+); V, reacciones variable; V, variable, por lo general positivo; NR, no se dispone de resultados. Datos de la referencia 14.

GÉNERO: ACIDAMINOCOCCUS (14) Cocos gramnegativos, a menudo diplococos con forma oval o arriñonada No formadores de esporas

Anaerobios Catalasa negativos No encapsulados Movilidad, sin resultados Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 30-37°C Reducción de nitratos: negativo Especie única: A. ferm entans ATCC 25085

GÉNERO: ACIDOVORAX (\A) Bacilos gramnegativos, rectos o ligeramente curvos dispuestos en forma aislada o en cadenas cortas No formadores de esporas Aerobios Catalasa variables, por lo general positivo: No encapsulados Móviles; flagelo polar único

Oxidasa positivos O/F de la glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25-37°C 7 especies: A. avenue subesp. avenue, A. avenue subesp. cattleryae, A. avenue subesp. citrulli, A. delafieldii, A .facilis, A. konjaci, A. temperans Especie tipo: A. facilis ATCC 11228 (no figura en el Manual de Bergey; descrito por Willems A. y col. (30)) (Véase cuadro 44-4)

GÉNERO: ACINETOBACTER (5, 14) Gramnegativos, a menudo difíciles de decolorar; los bacilos se transforman en esféricos en la fase de cre cimiento estacionaria. Dispuestos en pares y en cadenas de longitud variable No formadores de esporas Aerobios

Catalasa positivos No encapsulados Móviles: “movilidad contorneante” ; fimbrias polares

Oxidasa negativos O/F glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 33-35°C; sin embargo, desarrolla a 20-30°C 7 especies: A. baumarmi, A. calcoaceticus, A. haemolyticus, A. johnsonii, A. junii, A. lwoffii, A. radioresistens Especie tipo: A. calcoaceticus, ATCC 23055, CIP 81.08 (Véase cuadro 44-5)

596

Esquemas de identificación

Cuadro 44-4. Diferenciación de las especies de Acidovorax aisladas con más frecuencia A. delafieldii Prueba A. facilis A. tem perans V + Catalasa + Oxidasa + + + + + + no3 no2 MacConkey (MAC) Pigmentación H2S TSI PbAc Movilidad Hidrólisis de la esculina Citrato Lisina descarboxilasa Licuefacción de la gelatina, 22°C U reasa

Ga +b

+ +

PbAc, acetato de plomo; G, crecimiento (growth); NG, sin crecimiento; NR, no se dispone resultados; V, reacciones va riables; TSI (agar con azúcar triple y hierro). Datos de la referencia 29. a Reacción débil y tardía. b Pigmentación amarilla.

Cuadro 44-5. Diferenciación de las especies de Acinetobacter Prueba

A. baumanni

A. calcoaceticus

A. haemolyticus

A. johnsonii

A. junii

Catalasa Oxidasa MacConkey (MAC) N 0 3 -> n o 2 Crecimiento a 37°C 41 °C Hemolisis, 5% SBA Citrato (Simmons) Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C Malonato Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Fenílalanina desaminasa Glucosa

G —

—

G G

G NG

NG NG

G V

G NG

+a -

+ —

G NG + V+ —

+ —

V -

V+ V+

+ +

—

v+ V v+

+ + A

A. Iwoffii

V V

— v+

V-

v+ —

v+ —*

_ -

V-

V, reacciones variables;V+, variable, por lo general positivo; V- , variable, por lo general negativo; SBA, agar con sangre de oveja; G, crecimiento; NG, sin crecimiento. Datos de la referencia 5. aTodas las cepas excepto dos cepas auxotróficas.

GÉNERO: ACTINOBACILLUS (14, 26) Bacilos gramnegativos, con coloración irregular, esféricos u ovales; la mayoría de las formas bacila res esparcidas con formas cocoides que pueden yacer en el polo de un bacilo dan el aspecto carac terístico de “alfabeto Morse”. Dispuestos en forma aislada y en pares; raras veces en cadenas No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa variables, por lo general positivos No encapsulados Inmóviles Oxidasa variables, por lo general positivos O/F de la glucosa: F (fermentativos) y O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C 16 especies: A. capsulatus, A. delphinicola, A. equuli,A . hom inis,A. indolicus, A. iignieresii, A. m i nor, A. m uris,A .pleuropneum oniae,A .porcinus,A . rossii,A. scotiae,A. sem inis,A. succinogenes, A. suis, A. ureae Especie tipo: A. Iignieresii NCTC 4189 Todas las especies son capnófilas (es decir, requieren dióxido de carbono (C 0 2) para el crecimiento)

Bacterias gramnegativas 597 Microorganismos con requerimientos especiales de cultivo; requieren el agregado de suero al medio basal para incrementar el crecimiento (26)

Catalasa Oxidasa N 0 3 -» n o 2 Hemólisis, 5% SBA MacConkey (MAC) HpS Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Adonitol Arabinosa Celobiosa Dextrina Dulcitol Eritritol Fructosa Galactosa Glicerol Inositol Inulina Maltosa Manitol Mañosa Melibiosa Rafinosa Ramnosa Ribosa Salicina Sorbitol Sorbosa Sacarosa Trehalosa Xilosa Otras pruebas Indol Hidrólisis de la esculina Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Licuefacción de la gelatina, 22°C ONPG Fosfatasa Rojo de metilo (MR) foges-Proskauer (VP) U reasa

+ + + y G -

V v+ + y G V

+ + y NG NR

V v+ + y G +

+ + + y NG —

+ + + V V+ NR

A A A NR A A NR A A A NR A NR A A A A A

A A vA NR A V V A A A NR A A V A A A

A A NR NR NR A NR NR A A NR Aa

A Va

A Aa -

A V NR A NR NR NR A NR A NR V A V vNR NR A NR A

— + + +

V V + +

NR V A A A

A NR A A V A A A NR A V A A

V + + NR +

— V + V +

A V V

A A A NR Aa A A A A +a -

_ +

— -

NR NR NR V+ + NR NR +

A ureae

A suis

A. sem im s

A. rossii

A. m uris

A. lignierosii

A. hom inis

A. equuli

P ru e b a

A. cap sulatus

Cuadro 44-6. Diferenciación de las especies de Actinobacillus aisladas con más frecuencia

+ V + NG NR

+ V+ + + G -

V V* + + V NR

/\wa

A _

A A V+ A A NR A V+ A A A A A NR A A A A

V V NR NR

+ — V+ + -

—

_ _ Va NR Va V Va Va -

NR NR NR

A A V+ A V -

A vA _ -

— + +

G, crecimiento (growth); NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; V, reacciones variables; V+, variable, por lo general positivo; V~, variable, por lo general negativo; SBA, agar con sangre de oveja; A, producción de ácido (+); y, gamma hemolisis (ausencia de hemólisis). Datos de la referencia 14. a Reacción positiva tardía.

598

Esquemas de identificación

GÉNERO: AEROMONAS (14) Bacilos gramnegativos con extremos redondeados que se aproximan a la forma esférica; dispuestos en pa res o en cadenas cortas No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa positivos No encapsulados Movilidad variable; por lo general positiva; flagelo polar único; en medios sólidos pueden formarse fla gelos peritricos. Excepción: A. media (—) y A. salmonicida (—)

Oxidasa positivos

O/F de la glucosa: F (fermentativos) y O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 22-28°C; sin embargo, la mayoría de las cepas crecen bien a 37°C 22 especies: A. allosaccharophila, A. bestiarum, A. caviae, A. encheleia, A. enteropelogen.es, A. eucrenophila, A. hydrophila subesp. anaerogenes, A. hydrophila subesp. hydrophila, A. ichthiosmia, A. jandaei, A. media, A. popoffii, A. punctata subesp. caviae, A. punctata subesp. punctata, A. salmonicida subesp. achromogenes, A. salmonicida subesp. masoucida, A. salmonicida subesp. salmonicida, A. sal monicida subesp. smithia, A. schubertii A. sobria, A. trota, A. veronii Especie tipo: A. hydrophila subesp. hydrophila ATCC 7966, NCTC 8049

P ru e b a

Catalasa Oxidasa n o 3 -> n o 2 h 2s Movilidad Pigmento soluble castaño Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Adonitol Arabinosa Celobiosa Dulcitol Eritritol Galactosa Glicerol Inositol Maltosa Manitol Mañosa Melibiosa Rafinosa Ramnosa Salicina Sorbitol Sacarosa Trehalosa Xilosa Otras pruebas Indol DNasa Citrato (Christensen) Citrato (Simmons) Hidrólisis de la esculina Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Licuefacción de la gelatina, 22°C

a. o

03 ■O n o 2 G G MacConkey (MAC) Movilidad NG NG 42°C + + Digestión de la caseína — — Hidrólisis de la esculina Indol (Ehrlich) + Licuefacción de la gelatina, 22°C + + Fosfatasa + NG Hidrólisis del almidón ONPG NR U reasa Hidratos de carbono3 A Ab Glucosa Ab Lactosa — Adonltol — Arabinosa — A Celobiosa — NR Glicerol A A Maltosa — — Manitol A Rafinosa — Ramnosa — — Salicina A Ab Sacarosa — A Trehalosa Xilosa A, producción de ácido (+); NR, no se dispone de resultados; G, crecimiento; NG, sin crecimiento. Datos de la referencia 14. 3 Medio con sales de amonio para hidratos de carbono. b Reacción tardía.

GÉNERO: FRANCISELLA (5,14,26,29) Pequeños bacilos o formas cocoides gramnegativos, que se colorean de modo débil; a menudo pleomórScos; la coloración de Gram es poco útil; patógenos intracelulares No formadores de esporas

Aerobios estrictos (obligados) Catalasa positivos; débiles Cápsula variable; asociada con la virulencia Inmóviles

Oxidasa variables, por lo general negativos; positivo con el método de Kovacs O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35°C 5 especies: F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis subesp. holarctica, F. tularensis subesp. mediasiatica (tipo B), F. tularensis subesp. tularensis (tipo A) Especie tipo: F. tularensis subesp. tularensis ATCC 6223 Para el desarrollo requieren cisterna o citosina; no crecen en los agares con sangre, con chocolate ni MacConkey (6) F. tularensis es el agente etiológico de la tularemia en los seres humanos y en los animales Halofílicos F. tularensis es extremadamente infeccioso; un patógeno nivel 2 de bioseguridad, nivel 3 para cultivos. Con frecuencia es una infección adquirida en el laboratorio; si se sospecha, remitir la muestra al labo ratorio de referencia estatal o de salud pública

614

Esquemas de identificación

Identificación y confirmación por la prueba de aglutinación en portaobjeto (26); las reacciones bio químicas no son de particular valor y no justifican los riesgos para el personal técnico (26) GÉNERO: FUSOBACTERIUM (14) Bacilos gramnegativos que pueden presentar una forma aguzada; pueden ser cocobacilos; a menudo pleo-

mórficos; si no son fusiformes, a menudo resulta difícil diferenciarlos de otros anaerobios inmó viles (especies de Bacteroides, Clostridium y Eubacterium) No formadores de esporas

Anaerobios estrictos (obligados) Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles

Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos); reacción débil Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C 20 especies: F. alocis, F. gonidaformans, F mortiferum, F naviforme, F necrogenes, F. necrophorum subesp. funduliforme, F necrophorum subesp. necrophorum, F. nucleatum subesp. animalis, F. nucleatum subesp. fusiforme, F nucleatum subesp. nucleatum, F nucleatum subesp. polymorphum, F. nucleatum subesp. vincentii, F perfoetens, F. periodonticum, F. prausnitzii, F russii, F. simiae, F suici, F. ulcerans, F varium Especie tipo: F nucleatum subesp. nucleatum ATCC 25586 Todas las cepas susceptibles (sensibles) a 300 pg de fosfomicina (Véase cuadro 44-29 en página siguiente))

GÉNERO: GARDNERELLA (14, 19) Bacilos pleomórficos grampositivos y gramnegativos No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles

Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C Producen hemolisis en sangre humana (HBT) pero no en sangre de oveja; P-hemólisis No son ácido-alcohol resistentes Especie única: G. vagin*lis ATCC 14018; NCTC 10287 Exigente en los requerimientos para el crecimiento Principal causa bacteriana de vaginitis “inespecífica” (Véase cuadro 44-30)

Bacterias gramnegativas 615

Catalasa Oxidasa Bilis 20%d H2S Hemolisis, 5% SBA Movilidad Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Celobiosa Fructosa Galactosa Maltosa Mañosa Melibiosa Rafinosa Salicina Sacarosa Trehalosa Otras pruebas Indol Hidrólisis de la esculina Hidrólisis del hipurato Lipasa Aislado de Seres humanos Animales

F. varium

F ulcerans

F. suici

F. simiae

F russii

F. prausmtzii0

O) o o CD c LL

F. periodonticum

F. perfoetens

c LL

-Q « CD

F. nucleatum

CD £ o

F. necrophorum

F mortiferum

F gonldaformans

P ru e b a a

F. alocls

Cuadro 44-29. Diferenciación de las especies de Fusobacterium aisladas con más frecuencia

V+ + y

NG vP.y

G + y

NG y

G + y

V -

Aw Aw NR -

A A -

V-w V-w V-w V-w V-w V-w V-w

A A -

NR -

A NR NR V-

Aw ~ Aw V Aw

A -

V-w V-w V-w -

NR NR

— NR

— +

+ + -

— -

+ V-

+ V -

+ +

+ -

+ +

+ -

NG + y

V V NG NG + V + + P.y a, p P. y y

NR -

Aw Aw A V"w Aw A-w Aw V“w Aw v-

V-w -

Aw V-w A NR Aw V~w V-w V-w V-w V-w

— -

+ V

— + -

+ v-

+ -

+ +

+ -

NG + y

NG NG G + + a, y y y

y-w V -

V-w _

V, reacciones variables; V- , variable, por lo general negativo; w, reacción débil; NG, sin crecimiento; G, crecimiento; NR, no se dispone de resultados; a, alfa hemolisis; (5, beta hemolisis; y, gamma (ausencia) hemolisis; SBA, agar con sangre de oveja. Datos de las referencias 14 y 26. a Un problema con la identificación es la falta general de reactividad en las pruebas convencionales; mejor para la iden tificación son los perfiles de los ácidos grasos por medio de cromatografía gaseosa, patrones electroforéticos de la glutamato deshidrogenasa y espectrometría de masa-pirólisis (5). b Especie de Fusobacterium aislada con más frecuencia de las infecciones clínicas. c Rara vez aislado de muestras clínicas; sin embargo, se encuentra con frecuencia en las heces humanas. d Concentración de bilis al 20% o Bacto oxgall al 2% (concentración de bilis 10x).

Cuadro 44-30. Características bioquímicas de Gardnerella vagin*lis Reducción de nitratos Hidrólisis del hipurato Hidrólisis del almidón ONPG Rojo de metilo (MR) Arginina dihidrolasa Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina H2S Indol Usina Fenilalanina Ornitina Tween 80 Ureasa Voges-Proskauer (VP)

+ + V + — —

— — — — _

Hidratos de carbono L-Arabinosa Celobiosa Dextrina Fructosa Galactosa Inositol Inulina Lactosa Maltosa Manitol Mañosa Melibiosa Rafinosa Ribosa Ramnosa Salicina Sacarosa Xilosa

A, producción de ácido (+);V, reacciones variables.

A —

A A A —

A — —

A A A

616

Esquemas de identificación

GÉNERO: GEMELLA (6, 16, 19) Células esféricas o alargadas, grampositivas o gram variables (se decoloran con facilidad); a menudo dis puestas en pares (diplococos) con las caras aplanadas adyacentes o en pares de tamaño desigual. Re cuerda la morfología de Neisseria cuando es gramnegaf ivo No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles

Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C; sin crecimiento a 10° y 45°C 4 especies: G. bergeri, G. haemolysans, G. morbillorum, G. sanguinis Especie tipo: G. haemolysans ATCC 10379, NCTC 5414 A m enudo se confunde con especies de los géneros Neisseria, Veillonella y Streptococcus

Cuadro 44-31. Diferenciación de dos especies de Gemella Prueba

G. haemolysans

G. morbillorum

Catalasa Oxidasa 10°C 45°C NaCI al 6,5% Movilidad Hidrólisis de la esculina PYR LAP Vancomicina 30 gg

—

NG NG G

+ wa

NG, sin crecimiento; G, crecimiento; V, resultados variables; +w, positivo débil, S, sensible (susceptible); LAR leucina aminopeptidasa; PYR, pirrolidonilarilamidasa. a Según Facklam y Washington (4), debe utilizarse un gran inoculo para evitar los resultados PYR falsos negativos.

GÉNERO: HAEM OPHILUS (5, 14) Células con forma de bacilos, esféricos u ovales gramnegativos, de tamaño diminuto a mediano; en oca siones forman tétradas o filamentos; marcado pleomorfismo No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa variables Encapsulados; asociados con virulencia; por ejemplo, H. influenzae Inmóviles

Oxidasa variables O/F de la glucosa: F (fermentativos) y O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C; excepto H. ducreyi, 33-35°C (5) Reducen los nitratos a nitritos y más aún 17 especies: H. actinomycetcmcomitans, H. aegyptius, H. aphrophilus, H. ducreyi, H .felis, H. haemoglobinophilus, H. haemolyticus, H. influenzae, H. paracuniculus, H. paragallinarum, H. parahaemolyticus, H. parainfluenzae, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphmphilus, H. parasuis, H. piscium, H. segnis Especie tipo: H. influenzae ATCC 33391, NCTC 8143 Casi todas las especies requieren factores de crecimiento preformados presentes en la sangre, en especial factor X (protoporfirina IX o protohem) y/o factor V (nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) o NAD fosfato (NADP)). Los factores X y V son requerimientos no definitivos para las especies de H ae mophilus', las especies de Actinobacillus y de Pasteurella requieren factor V El crecimiento se estimula por el dióxido de carbono al 5-10% (C 0 2) Olor característico de los cultivos a “nidal de ratones” La coloración con AO (naranja de acridina) incrementa el aspecto de las especies de Haemophilus; incre m enta el contraste entre las bacterias y el fondo (26) H. aphrophilus es el agente etiológico de la conjuntivitis H. ducreyi es el agente etiológico de una enfermedad venérea, chancro blando o chancroide H. influenzae es una causa importante de meningitis en los niños

Bacterias gramnegativas 617 Cuadro 44-32. Diferenciación de especies de Haemophilus 3 O w _3 3 O c =3 O 2

cti

Prueba

Catalasa Oxidasa NO 3 —> NO 2 p-hemólisis, 5% SBA MacConkey (MAC) HpS Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Adonitol Arabinosa Celobiosa Dextrina Dulcitol Eritritol Fructosa Galactosa Glicerol Inositol Inulina Maltosa Manitol Mañosa Melibiosa Rafinosa Ramnosa Ribosa Salicina Sorbitol Sorbosa Sacarosa Trehalosa Xilosa Otras pruebas Indol Hidrólisis de la escuhna Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Licuefacción de la gelatina, 22°C ONPG Fosfatasa Rojo de metilo (MR) Voges-Proskauer (VP) U reasa Requerimiento de factor X Requerimiento de factor V

X + + +

V -

V-

A -

CD Cti

.£= Cti có

CD cti N C Cü _3 C

NG +

NG V

A A

A V

Aw -

A V

A A

A V

A -

A A

Aw Aw Aw Aw

NR NR

Aw A

A -

A NR

NR NR

A A A

Cti

A A A

en 2

NG +

Cti

X V +

o. X + +

A V+ A

Q. X + +

X + + + + NG +

A A

X V + +

A A V V

_3 -C CL O

X X + V + + + + NG NG NR +

X + + + NG

NR A A -

(f¡

cti

X + + + NG

% O

Cti

X X + + + + + + + + Va + NG NG NG V +

E 3 (ti C "cti O) cti cti

to 3 O >> O E

V A A

A A

-r

A A

A A A

—

V v+

+ NR +

V V

NR + + NR NR

NR + + NR NR +

NR V + NR NR +

NR V + NR NR V

—

NR V + NR NR +

NR + + NR NR

NR V + NR NR

+ -

+ NR NR

+ NR NR + + +

+ NR NR V+ + +

NR NR +

+ + + + + + + + + V, reacción variable; V- , variable, por lo general negativo; V+, variable, por lo general positivo; NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; SBA, agar con sangre de oveja; A, producción de ácido (+); w, reacción débil. Datos de la referencia 14. a Reacción positiva tardía. -

618

Esquemas de identificación

GÉNERO: HELICOBACTER (5, 19) Bacilos gramnegativos, helicoidales, curvos o rectos con extremos redondeados. En los cultivos viejos pa recen cocoides No formadores de esporas Microaerófilos; algunos crecen en anaerobiosis

Catalasa positivos No encapsulados Móviles: rápidos como saetas; flagelos múltiples con vainas, unipolares o bipolares y laterales con bul bos terminales

Oxidasa positivos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C; crecimiento a 30°C pero no a 25°C 18 especies: H. acinonychis, H. bilis, H. bizzozaronii, H. canis, H. cholecytus, H. cinaedi, H .felis, H .fen nelliae, H. hepaticus, H. muridarum, H. mustelae, H. nemestrinae, H. pametensis, H. pullorum, H. p y lori, H. rodentium, H. salomonis, H. trogontum Especie tipo: H. pylori ATCC 43504, NCTC 11637 (no incluido en el Manual de Bergey; descrito por Goodwin y col. (7)) H. mustelae es el agente etiológico de úlceras pépticas en los seres humanos H. pylori es el agente etiológico de la gastritis de tipo B en los seres humanos

Cuadro 44-33. Diferenciación de algunas especies de Helicobacter Prueba

H. cinaedi

H. fennelliae

H. mustelae

H. pylori

Catalasa Oxidasa n o 3 -> n o 2 Movilidad 25°C 42°C H2S (TSI) Hidrólisis del hipurato Indoxihidrolacetato U reasa Cefalotina ácida, discos de 30 pg Ácido nalidíxico, discos de 30 pg DNasa

+ + + +

+ +

+ + + +

NG NG

NR G

NG G

NR NR NR R

S S

V +

S R +

S, sensible (susceptible); R, resistente; NG, sin crecimiento; G, crecimiento; NR, no se dispone de resultados; V, reac ción variable; V+, variable, por lo general positivo; V~, variable, por lo general negativo. Datos de las referencias 5 y 26.

GÉNERO: JANTHINOBACTERIUM (14) Bacilos gramnegativos con extremos redondeados; en ocasiones exhiben coloración en barra o bipolar con inclusiones lipídicas; están dispuestos en forma aislada y en ocasiones en pares o en cadenas cortas No formadores de esporas Aerobios estrictos (obligados)

Catalasa positivos No encapsulados Móviles: un flagelo polar único y por lo común 1-4 flagelos subpolares o laterales Oxidasa variables, por lo general positivos por el método de Kovacs; el pigmento violeta puede interfe rir con la interpretación O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 25°C; mínimo 2°C y máximo 32°C Especie única: J. lividum ATCC 12473, NCTC 9796 Colonias violetas en medios sólidos; anillo violeta en la unión de la superficie líquida y la pared del recipiente

Bacterias gramnegativas 619 Cuadro 44-34. Características bioquímicas de Janthinobacterium lividum NaCI, 6 % N 0 3 -> NOz Indol Citrato Fosfatasa

Voges-Proskauer (VP) Glucosa Bencilpenicilina, 10 pg/mL 0/129

+ +

A R R

NG, sin crecimiento; R, resistente; 0/129, agente vibriostático, 2,4-d¡am¡no-6,7-diisopropilpteridina; A, producción de ácido (+).

GÉNERO: KINGÉLLA (5,14,26) Bacilos gramnegativos, rectos con extremos redondeados o rectos que tienden a resistir la decoloración, o cocobacilos; dispuestos en pares, en ocasiones en cadenas cortas; pueden asemejarse a Neisseria gonorrhoeae (26) No formadores de esporas Anaerobios facultativos; desarrollan mejor en aerobiosis pero pueden crecer en form a débil en anaerobiosis en agar con sangre

Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles; pueden presentar fimbrias (pelos) y exhiben “movilidad contorneante”

Oxidasa positivos 0 /F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 33-37°C 3 especies: K. denitrificans, K. kingae y K. oralis Especie tipo: K. kingae ATCC 23330 Microorganismos de difícil crecimiento; pueden requerir procedimientos especiales para los medios de fermentación básales (p. ej., suero) para estimular el crecimiento Capnófilos; requieren C 0 2 adicional para el crecimiento

Cuadro 44-35. Diferenciación de dos especies de Kingella________________________________ Prueba K. denitrificans K. kingae Catalasa Oxidasa Movilidad p-hemólisis, 5% SBA aCI, 4% MacConkey (MAC) N 03 -> NO, Hidratos de carbono Glucosa Lactosa Maltosa Manitol Sacarosa Xilosa Otras pruebas Indol Digestión de la caseína Hidrólisis de la esculina Fosfatasa U reasa Hidrólisis del Tween 40 Penicilina

+£

NG NG

—

+ +

NG, sin crecimiento; S, sensible (susceptible); A, producción de ácido (+). a Positivo con tetrametil-p-fenilendiamina; positivo débil con reactivo dimetilo. b Tardía.

GÉNERO: LEGIONELLA (5, 26) Bacilos gramnegativos, delgados, que se colorean débilmente Las especies por lo general no se detectan en los materiales clínicos por la coloración de Gram (5); es mejor el examen histológico de cortes de tejidos por medio de coloraciones argénticas o de Giemsa No formadores de esporas

620

Esquemas de identificación

Aerobios

Catalasa positivos No encapsulados Movilidad: variable, por lo general positiva; existen cepas inmóviles ocasionales; uno o más flagelos rec tos o curvos, polares o laterales

Oxidasa negativos o positivos débiles O/F de la glucosa: inertes (—) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C No son ácido-alcohol resistentes Reducción de nitratos negativa Ureasa negativos 39 especies: L. adelaidensis, L. anisa, L. birminghamensis, L. brunensis, L. cherrii, L. cincinnatiensis, L. erythra, L. fairfialdensis, L.feeleii, L. geestiana, L. gratiana, L. hackeliae, L. israelensis, L. jam estowniensis, L jo rd a n is, L. langsingensis, L. londiniensis, L. longbeachae, L. lytica, L. mouivica, L. nautarum, L, oakridgensis, L. parisiensis, L. pneum ophila subesp. fraseri, L. pneum ophila subesp. pascullei, L. pneumophila subesp .pneumoniae, L. quateirensis, L. quinlivanii, L. rubrilucens, L. sainthelensi, L. santicrucis, L. shakespearei, L. spiritensis, L. steigerwaltii, L. taurinensis, L. tuesonensis, L. wadsworthii, L. waltersii, L. worsleiensis Especie tipo: L. pneum ophila subesp. pneum oniae ATCC 33152; agente etiológico de la enfermedad de los legionarios o de la enfermedad febril leve (fiebre de Pontiac) No desarrollan en los medios estándar de agar con sangre o en otros medios utilizados para el aislamien to primario en placas; requieren clorhidrato de L-cisteína y sales de hierro tamponadas a pH 6,9 para el desarrollo óptimo Identificación por pruebas serológicas para las especies y serovariedades aisladas con más frecuencia; radioinmunoensayo, ensayo enzimático, aglutinación del látex o reacción en cadena de la polimerasa (PCR); para muchas especies no se dispone de antisueros comerciales L. pneumoniae es el patógeno humano predominante (5), seguido por L. miedadei y L. dumojfii (31)

Inertes desde el punto de vista bioquímico; las pruebas bioquímicas exhaustivas resultan de poca utilidad Todas las muestras en las que se sospecha la presencia de Legionella deben ser manipuladas en un ga binete de bioseguridad (BSC) de clase II (5); la identificación se realiza en los laboratorios de referen cia estatales o de salud pública

GÉNERQ: LEPTOTRICHIA (5, 14) Bacilos gramnegativos, rectos o ligeramente curvos. En los cultivos muy jóvenes pueden colorearse co mo grampositivos, pero los microorganismos poseen una pared celular con características peculiares de tipo gramnegativo. Pueden aparecer bacilos fusiformes y filamentos largos No formadpres de esporas Anaerobios; pueden ser aerotolerantes

Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles

Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C; sin crecimiento por debajo de 25 ’C Especie única: L. buccaüs ATCC 14201, NCTC 10249

Cuadro 44-36, Características bioquímicas de Leptotrichia buccalis A Hemolisis, 5% SBA Glucosa Mañosa y A Lactosa H2S Melibiosa A Celobiosa Indol Rafinosa A Salicina Hidrólisis de la esculina + Fructosa A Hidrólisis dol liipurato Galactosa Sacarosa A Maltosa Trehalosa n o 3 -> n o 2 A, producción de ácido (+); V, variable, por lo general negativo; y, gamma (ausencia) hemolisis; SBA, oveja.

A -

V A A A agar con sangre de

Bacterias gramnegativas 621

GÉNERO: M EG A M O N A S (14) Bacilos gramnegativos, largos, con extremos redondeados, o cocobacilos; por lo general, aspecto granu lar debido a la volutina No formadores de esporas Anaerobios Catalasa negativos No encapsulados Inmóviles Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Hidrólisis de la esculina: positiva Especie única: M. hypermegas ATCC 25560, NCTC 10570 (no incluido en el M anual de Bergey\ descri to por Shah y Collins (25))

GÉNERO: M EG A SP H A ER A (14) Cocos gramnegativos dispuestos en pares (diplococos; en forma arriñonada) y en ocasiones en cadenas cortas No formadores de esporas

Anaerobios Catalasa negativos No encapsulados M ovilidad negativa Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) Temperatura óptima de crecimiento: 15-40°C 2 especies: M. cerevisiae, M. elsdenii Especie tipo: M. elsdenii ATCC 25940, NCIB 8927

Cuadro 44-37.

D ife re n c ia c ió n d e e s p e c ie s d e

P ru e b a

M. cerevisiae

Catalasa 40°C N03 -> N02 Glucosa Maltosa

Megasphaera M. elsdenii —

-A -A

A, producción de ácido (+); G, crecimiento; NG, sin crecimiento. Datos de las referencias 14 y 26.

GÉNERO: M ETHYLOBACTERIUM (5, 29) Bacilos gramnegativos o gramvariables que se presentan en forma aislada o en ocasiones en rosetas; a ve ces ramificados y bacilos pleomórficos vacuolados No formadores de esporas Aerobios Catalasa positivos; pueden ser débiles No encapsulados Móviles; flagelo polar único o flagelos laterales Oxidasa positivos; pueden ser débiles O/F de la glucosa: inertes (-) Temperatura óptima de crecimiento: 25-30°C 10 especies: M. aminovomns, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, M. zatmanii Especie tipo: M. organophilum, ATCC 27886 (no incluido en el M anual de Bergev, descrito por Green y Bousfield (9)) Colonias pigmentadas de color rosa (Véase cuadro 44-38 en la página siguiente)

622

Esquemas de identificación

+ + -

+ +

+ + NR NR

+ + + NG

+ +

NR NR + A A V A

+ + _

NR NR +

44-

+ +

NR NR +

A A

NR NR

V+

+ + NR NR

+ +

NR NR NR NR

M. zatmann

+ + NR NR

M rhodinum

M rhodesianum

M. radiotolerans

+ +

M. organophilum

Catalasa Oxidasa N 0 3 -> n o 2 MacConkey (MAC) H2S TSI PbAc Movilidad Hidratos de carbono Glucosa Arabinosa Fructosa XI losa Otras pruebas Indol Hidrólisis de la escullna Citrato Licuefacción de la gelatina, 22°C U reasa

M mesophilicum

P ru e b a

M fujisawaense

M . extorquens

Cuadro 44-38. Diferenciación de especies de Methylobacterium

V+

NR NR

NR NR NR

+ +

NR -

V+

G, crecimiento; NG, sin crecimiento; V, reacciones variables; V+, variable, por lo general positivo; w, reacción débil; A, pro ducción de ácido (+). Datos de las referencias 5 y 29.

GÉNERO: MITSUOKELLA (14) Bacilos gramnegativos, regulares u ovoideos No formadores de esporas

Anaerobios Catalasa: no se dispone de resultados

Cápsula variable Inmóviles Oxidasa: no se dispone de resultados O/F de la glucosa: F (fermentativos); a menudo de manera vigorosa Especie única: M. multiacidus ATCC 27723, NCTC 10934 (no incluido en el M anual de Bergey\ descri to por Shah y Collins (25))

Cuadro 44-39. Características bioquímicas de Mitsuokella multiacidus Bills 20% Pigmentación Indol Hidrólisis de la esculina

G —

Glucosa Lactosa Arabinosa Celobiosa Sallcina Sacarosa

A A A A A A

A, producción de ácido (+); G, crecimiento; bilis 20%, concentración de bilis al 20% o Bacto oxgall al 2% (concentración de bilis 10 x).

GÉNERO: MOBILUNCUS (14, 27) Bacilos gramvariables, delgados, curvos, con extremos adelgazados; gramvariables o gramnegativos, pe ro la pared celular es de tipo grampositivo; forma y tamaño variables y dispuestos en forma aislada, pero a veces se dispone en pares con aspecto de ala de gaviota No formadores de esporas

Anaerobios No encapsulados Catalasa negativos M óviles por flagelos multilaterales o subpolares

Bacterias gramnegativas 623 Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos); débiles Temperatura óptima de crecimiento: 37°C Ácido micólico en las células; más grandes y más complejos (C60-Q . ,) 3 especies: M. curtisii subesp. curtisii, M. curtisii subesp. holmesii, M. mulieris Especie tipo: M. curtisii subesp. curtisii ATCC 35241 (no incluido en el M anual de Bergey, establecido por Spiegel y Roberts (27)); el género puede ser un sinónimo de Falcivibrio (27)

Cuadro 44-40. Diferenciación de las especies de Mobiluncus M. curtisii P ru e b a

su b e sp. curtisii

subesp. holmesii

M mulieris

Catalasa Oxidasa N 0 3 -> NO, H2S Movilidad Glucosa Fructosa Lactosa Maltosa Manitol Ribosa Almidón Arginina deshidrolasa Hidrólisis de la esculina Hidrólisis del hipurato Indol Hidrólisis del almidón

—

+ Aw

+ V V

yvw yvw

y-vw yvw

y-vw

yvw

+ — +

A -

yvw

A, producción de ácido (+); w, si es positiva, reacción débil; vw, si es positiva, reacción muy débil; V, resultados variables; V~, variable, por lo general negativo. Datos de la referencia 14.

GÉNERO: M O R A X E L L A (14, 26) Bacilos gramnegativos que resisten la decoloración; bacilos cortos y gruesos; dispuestos de manera predominante en pares y en ocasiones en cadenas cortas. Las células del subgénero Branhamella se apro ximan a la forma de cocos; la forma se exagera por la falta de 0 2 y por la incubación por encima del ni vel óptimo; los cocos son más pequeños y están dispuestos en forma aislada, en pares o en tétradas con los lados aplanados adyacentes. Recuerdan las especies de Neisseria. Pleomórficos No formadores de esporas Aerobios; algunas cepas pueden mostrar un desarrollo débil en anaerobiosis Catalasa positivos excepto M. bovis (variable)

Cápsula variable Inmóviles; tanto los bacilos como los cocos presentan fimbrias. Algunos bacilos pueden mostrar “mo vilidad contorneante ligada a la superficie” Oxidasa positivos; fuertes O/F de la glucosa: inerte (—) o sin crecimiento Temperatura óptima de crecimiento: 33-35°C Gran sensibilidad a la penicilina 13 especies: M. atlantae, M. boevrei, M. bovis, M. canis, M. caprae, M. calarrhalis, M. equi, M. iacú nala, M. lincolnii, M. nonliquefaciens, M. osloensis, M. ovis, M. saccharolytica Especie tipo: M. lacunaia ATCC 17967 Microorganismos con requerimientos especiales de cultivo Según Murray y col. (19), la mayoría de los laboratorios no determinan las especies de Moraxella de bido a la similitud en la importancia patogénica de las especies (Véase cuadro 44-41 en la página siguiente)

624

Esquemas de identificación

M. lacunata

M. lincolnii

V +

+ +

G —

NG V+

+ NG _

NG —

V —

—

+ NG v-

V NG V+

V NG +

NR NR NG —

V NG —

V NG +

V NG V

NR NR NG +

V+

— -

_ -

+ -

— -

M. ovis

M catarrhalis

Catalasa Oxidasa Forma celular Bacilos Cocos MacConkey (MAC) Hemolisis (sangre humana) H2S TSI PbAc NaCI, 6,5% N 0 3 -» n o 2 Licuefacción de la gelatina, 22°C Movilidad Citrato DNasa Indol Hidrólisis de la esculina Fenilalanina Ureasa Penicilina, 1,0 U/mL Aislamiento de Seres humanos Animales

M osloensis

M. bovis

+ +

P ru e b a

M. nonliquefaciens

M atlantae

Cuadro 44-41. Diferenciación de las especies de Moraxella aisladas con más frecuencia

+ +

+ V NR

y+b

+ -

+ +

+ “

+ — -

— _ -

— -

V+c

+ -

NR NR

V, reacciones variables; V variables, por lo general positivo; V-, variable, por lo general negativo; NG, sin crecimiento; NR, no se dispone de resultados; S, sensible (susceptible); PbAc, tiras de acetato de plomo; TSI, agar con azúcar triple y hierro. Datos de las referencias 5, 14, 26 y 29. a Pocas cepas ureasa positivas débiles. b Algunas cepas son resistentes a la penicilina sobre la base de la producción de p-lactamasa; las cepas que no son plactamasa negativas crecen en presencia de 1 U/mL de penicilina (14). 0 Crecimiento raro.

GÉNERO: MOROCOCCUS (14) Cocos gramnegativos que se mantienen juntos de modo firme en agregados similares a las moras No formadores de esporas Aerobios

Catalasa positivos No encapsulados Inmóviles

Oxidasa positivos O/F de la glucosa: F (fermentativos); reacción débil Temperatura óptima de crecimiento: 23-42°C Especie única: M.cerebrosus ATCC 33486, NCTC 11393 (no incluido en el M anual de Bergey, descrito por Long y col. (18)) (Véase cuadro 44-42)

GÉNERO: MYCOPLASMA (14) Microorganismos gramnegativos, con forma esférica, ligeramente ovoide o de pera a filamentos ramifi cados delgados; pleomórficos; carecen de pared celular No formadores de esporas Anaerobios facultativos

Catalasa negativos Movilidad: variable, por lo general positiva; algunas especies exhiben movimiento deslizante Oxidasa: no se dispone de resultados 104 especies: M. adleri, M. agalactiae, M. alkalescens, M. alvi, M. anatis, M. anseris, M. arginini, M. arthritidis, M. auris, M. bovigenitalium, M. bovirhinis, M. bovis, M. bovoculi, M. buccale, M. buteonis,

Bacterias gramnegativas 625

Cuadro 44-42. Características bioquímicas de Morococcus cerebrosus Catalasa Oxidasa n o 3 -4 n o 2 H2S (cisterna) Leche tornasolada Citrato Indol DNasa Hidrólisis de la escullna Licuefacción de la gelatina, 22°C Malonato Fosfatasa Fenilalanina Ornitina descarboxilasa Hidrólisis del almidón Lecitinasa Rojo de metilo (MR) U reasa Tween 80

+ + + + Rojo _

+ — — _

+ _ _

Glucosa Lactosa Arabinosa Dextrina Fructosa Galactosa Inulina Maltosa Mañosa Melibiosa Rafinosa Ramnosa Ribosa Salicina Sorbosa Sacarosa Trehalosa Xilosa

A _

A A — — A ~

A, producción de ácido (+); rojo, reducción. Datos de la referencia 14.

M. califomicum, M. canadense, M. canis, M. capricolum subesp. capricolum, M. capricolum subesp. capripneumoniae, M. caviae, M. cavipharyngis, M. citelli, M. cloacale, M. collis, M. columbinasale, M. columbinum, M. columborale, M. conjunctivae, M. corvgypsi, M. cottewii, M. cricetuli, M. cmcodyli, M. cynos, M. dispar, M. edwardii, M. elephantis, M. equigenitalium, M. equirhinis, M .falconis, M. fastidiosum, M. faucium, M. felifavcium, M.feliminutum, M.felis, M.fermentans, M. flocculare, M. gallinaceum, M. gallinarum, M. gallisepticum, M. gallopavonis, M. gateae, M. genitalium, M. glycophilum, M. gypis, M. hominis, M. hyopharyngis, M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, M. hyosynoviae, M. imitans, M. imliense, M. iners, M. iowae, M. lagogenitalium, M. leopharyngis, M. lipofaciens, M. lipophilum, M. maculosum, M. meleagridis, M. moatsii, M. mobile, M. motare, M. muris, M. mustelae, M. mycoides subesp. capri, M. mycoides subesp. mycoides, M. neurolyticwn, M. opalescens, M. órale, M. ovipneumoniae, M. oxoniensis, M. p e netrans, M. phocacerebrale, M. phocarhinis, M. phocidae, M. pirum, M. pneumoniae, M. primatum, M. pullorum, M. pulmonis, M. putrefaciens, M. salivarium, M. simbae, M. spermatophilum, M. spumans, M. stumi, M. sualvi, M. subdolum, M. suipneumoniae, M. synoviae, M. testudinis, M. verecundum, M. yeatsii Especie tipo: M. mycoides subesp. mycoides', NCTC 10114 Colonia típica con aspecto de “huevo frito” Requiere colesterol o esteróles relacionados para el crecimiento

Diferenciación de muchas especies por determinaciones serológicas GÉNERO: NEISSERIA (14, 26) Diplococos gramnegativos que tienden a resistir la decoloración; dispuestos en fomia aislada, a menudo en pares con los lados adyacentes aplanados para dar un característico aspecto en forma arriñonada o de granos de café; excepto N. elongata, bacilos cortos a menudo dispuestos como diplobacilos o en cadenas coitas No formadores de esporas Aerobios Catalasa positivos excepto N. elongata y N. mucosa

Cápsula variable Inmóviles

Oxidasa positivos ONPG positivo: N. lactamica; utilizada para ayudar en la diferenciación de N. gonorrhoeae y N. meningitidis O/F de la glucosa: O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 35-37°C 21 especies: N. animalis, N. canis, N. cinérea, N. denitrificans, N. dentiae, N. elongata subesp. elongata, N. elongata subesp. glycolytica, N. elongata subesp. nitroreducens, N. flava, N.flavescens, N. gonorr hoeae, N. iguanae, N. lactamica, N. macacae, N. meningitidis, N. mucosa, N. perflava, N. polysaccharea, N. sicca, N. subflava, N. weaveri Especie tipo: N. gonorrhoeae ATCC 19424 Algunas especies producen un pigmento carotenoide amarillo verdoso Algunas especies son m uy exigentes para su desarrollo y hemolíticas

626

Esquemas de identificación

Cuadro 44-43. Diferenciación de las especies de Neisseria aisladas con más frecuencia 0

Prueba

c (0 o

NO2

Movilidad

Pseudomonas viriditiava Roseomonas gilardii* Stenotrophom*onas maltophilia 1

Especies de

B. gladioli* Burkholderia P. syringae** mallei P. viriditiava** S. maltophilia*

Acinetobacter A. tumefaciens B. gladioli* C. luteola F. oryzihabitans* P. syringae** P. viriditiava** R. gilardii S. maltophilia

Véanse cuadros 44-18, 44-50 y 44-57

B. parapertussis F. oryzihabitans*

Ureasa

Bordetella parapertussis

Fiavimonas oryzihabitans

Aglutinación serológica para la confirmación .

A. tumefaciens ** C. luteola S. maltophilia *

Agrobacterium tumefaciens**

Arginina deshidrolasa

Chryseomonas luteola

Hidrólisis de la esculina _ Licuefacción de la gelatina, 22°C +

A. haemolyticus B. gladioli P. sy, ingae* P. vlridiflava S. maltophilia

A. tumefaciens S. maltophilia

Acinetobacter* F. oryzihabitans P. syringae* R. gilardii Aeromozas haemolyticus:

Véanse cuadros 44-5, 44-18, 44-50 y 44-57

I tumefaciens

hemolisis, SBA al 5%

Roseomonas gilardii:

s. maltophilia

Especies de

colonias con pigmento rosa; H2S (PbAc) positivo

Ureasa

Stenoirophom*ona s m ahjphilia*

Véanse cuadros 44-5, 44-27, 4450 y 44-53

Véanse cuadros 44-9 y 44-57 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 La mayoría de las cepas de Stenotrophom*onas maltophilia requieren metionina para el crecimiento (o cistina más glucona).

B a c te r ia s g r a m n e g a tiv a s

657

Diagrama 44-11. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos, que son

MAC-G

Glucosa-F & O

Especies de Actinobacillus Especies de Aeromonas

Haemophilus aphrophiius Especies de Vibrio

Haemophilus actinomycetemcomitans +

Oxidasa

A. equuli A. lignieresii A. su is A. ureae H. aphrophiius V. metschnikovii

A. A. A. A. A. A.

capsulatum equuli* lignieresii* rossii su is* ureae* Especies de Aeromonas H. actinomycetemcomitans Especies de Vibrio

N O 3 —> N O 2

Movilidad

A. equuli* A. lignieresii* A. suis* A. ureae* H. aphrophiius +

Vibrio metschnikovii

- Catalasa A Xilosa + U reasa +

A +

A. equuli*

A. equuli* J Haemophilus A c e r e s / / * A. ^ e s l i * Act¡nobacillus aphrophiius

Véase cuadro 44-6 + +

N 03 —> N 02 M o vilid ad

A. caviae A. eucrenophiia A. hydrophila A. schubertíi A. sobria A. veronii A. alginolyticus A. cholerae V. cincinnatiensis V. fluvialis* V. furnissii* V. mimicus V. parahaemolyticus V vulnificus

Véase diagrama 44-12

A. capsulatum A. salmonicida A. equuli subesp. smithia** A. lignieresii V. harveyi A. rossii A. suis + H2S A. ureae A A. media Maltosa A. salmonicida subesp. + Gelatina achromogenes + ONPG A. salmonicida subesp. I i y masoucida Aeromonas salA. salmonicida subesp. Vibri monicida subsalmonicida harvt esp. smithia A. salmonicida subesp. smithia** H. actinomycetemcomitans V. fluvialis* V furnissii* V. hollisae Véase diagrama 44-13

Resultados variables. ' No se dispone de resultados; tratado como variable.

658

Esquemas de identificación

Diagrama 44-12. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos, que son MAC-G Glucosa-F & 0 Oxidasa-Pos Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas

caviae eucrenophila hydrophila schubertii sobria

+ + +

1 Especies de Vibrio i

1 Aeromonas hydrophila

N 03 N 0 2 -Pos Móviles

Vibrio furnissii* Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus

Aeromonas veronii Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio cincinnatiensis Vibrio fluvialis* h 2s Hidrólisis de la esculina + Arginina deshidrolasa +

A. caviae A. eucrenophiia

A. schubertii A.sobria

A. veronii V. vulnificus '

Véase cuadro 44-64 Véase cuadro 44-7 +

Voges-Proskauer ) -

i Aeromonas veronii Resultados variables.

1 Vibrio vulnificus

Bacterias gramnegativas 659

Diagrama 44-13. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos, que son MAC-G Glucosa-F & O

Oxidasa-Pos NO3 —) NO2 "Pos

Actinobacillus capsulatum Actinobacillus equuli Actinobacillus lignieresii Actinobacillus rossii Actinobacillus suis Actinobacillus ureae Aeromonas media

Inmóviles

Aetomonas salmonicida subesp. smithia Haemophilus actinomyce temcomitans*1 Vibrio fluvialis* Vibrio furnissii* Vibrio hollisae

Aeromonas salmonicida subesp. achromogenes Aeromonas salmonicida subesp. masoucida Aeromonas salmonicida subesp. salmonicida U reasa

I Especies de Aeromonas

Especies de Actinobacillus

I Salicina Trehalosa.A

H. actinomycetemcomitans Especies de Vibrio

A. capsulatum ActinobaciA. suis ¡tus equuli | Dextrina Manitol Sorbitol

A. lignieresii A. rossii A. ureae

i A

A A

i Actinobacillus capsulatum

A A V

Galactosa A A Inositol Sacarosa A Xilosa v+ ONPG

A -

~ r~

Actinobacillus lignieresii

Actinobacillus suis

Actinobacillus Actinobacillus rossii ureae

h 2s

Manitol A + Hidrólisis de la esculina -

1 r TAeromonas Aeromonas A subesp.

subesp.

masoucida

smithia

I Pigmento + soluble castaño Celoblosa Sacarosa ~

n r~

A. salmonicida subesp. media* A. media* A,. salmonicida sub H. actinomycetemcomitans’ achromogenes H. actinomycetemcomitans* esp. salmonicida V. fluvialis V. hollisae _l V. furnissii I Pigmento soluble castaño Arabinosa Rojo de metilo

Aeromonas salmonicida

Trehalosa ONPG -

V fluvialis Aeromonas V. furnissii media

subesp.

Aeromonas salmonicida Véase cuadro 44-64 media 2

[

Haemophilus H. actinomycetemcomitans* actinomycetem V. hollisae comitans Aeromonas salmo nicida subesp. achromogenes A

Arabinosa Maltosa

Haemophilus actinomy- Vibrio hollisae cetemcomitans * Resultados variables. 1 2

Haemophilus actinomycetemcomitans no requiere factor X ni factor V para el crecimiento. Aeromonas media y A. salmonicida subesp. salmonicida son las únicas especies de Aeromonas que producen un pig

mento soluble de color castaño.

660

E s q u e m a s d e id e n tific a c ió n

Diagrama 44-14.

Diferenciación de los bacilos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos, que no desarrollan en el agar de MacConkey (MAC) Especies de Acholeplasma5 Acidovorax facilis Actinobacillus hominis Actinobacillus murís Actinobacillus rossii Actinobacillus seminis Actinobacillus ureae* Especies de Aeromonas * Especies de Afipia Especies de Bartonella Bordetella pertussis F

F +

C. cynodegmL K. denitrif¡cansí5

C. canimorsus C. cynodegmi

Ralstonia pickettii* Especies de Sphingomonas Streptobacillus moniliformis Suttonella indologenes Weeksella virosa Especies de Xanthobacter** F

O/F de la glucosa F Oxidasa NO3 —> NO2 + Movilidad

C. canimorsus7 C. cynodegm* C. hominis K. kingaé5 S. indologenes

Lactosa Indol

Especies de Legionella Especies de Methylobacterium* Especies de Moraxella* Oligella ureolytica* Especies de Pasteurella*

Brevundimonas vesicularis Brucella melitensis Burkholderia mallei* Especies de Capnocytophaga Cardiobacterium hominis5 Eikenella corrodens Especies de Francisella3 Gardnerella vagin*lis Especies de Haemophilus Janthinobactenum lividum*M Especies de Kingella5

C. gingivalis C. ochracea G. vagin*lis S. moniliformis

Capnocytophaga sputigena

C. hom ínié S. indologenes

C. hominisí5 K. denitrifleans K. kingae

Colonias pigmentadas ae amarillo -

G. vagin*lis S. moniliformis

c - gingivalis C- ochracea I Hidrólisis + del almidón -

Véase cuadro 44-21 + H2S (PbAc) Manitol A

i Capnocytophaga ochracea

Cardiobacterium hominis Suttonella a Manitol indologenes

Capnocytopha ga gingivalis -

i Cardiobacterium hominis K. denitrificans K. kingae Véase cuadro 44-35

A Sacarosa A Xilosa -

I Gardnerella vagin*lis Streptobacillus moniliformis (H2S (PbAc)-positivo)

* Resultados variables. ** No se dispone de resultados, tratado como variable. Véase diagrama 44-15 para los microorganismos mencionados antes que son no termentadores (NF) de la gluc~sa, véase diagrama 44-16 para los microorganismos mencionados antes que son positivos para fermentación y oxida ción (F & O). 1 Las especies de Acholeplasma requieren suero o colesterol para el crecimiento; las colonias en los medios de cultivo sólidos dan el aspecto de “huevo frito”; véase cuadro 44-3 para diferenciar las especies. 2 Cardiobacterium hominis: requiere hemina para el crecimiento en aerobiosis. 3 Especies de Francisella: requieren cisteína o citosina para el crecimiento; F. tularensis es extremadamente infeccio sa; identificación y confirmación por aglutinación en portaobjeto; reacciones bioquímicas sin valor particular; enviar a ios laboratorios de referencia o de salud pública estatales para el aislamiento y la identificación. 4 Janthinobactenum lividum exhibe colonias con pigmentación violeta en los medios sólidos y un anillo violeta en los me dios líquidos; véase cuadro 44-34 para las características bioquímicas. 5 Especies de Kingella: microorganismos exigentes; pueden requerir el agregado de suero al medio de fermentación ba sal para incrementar el crecimiento. 6 Especies de Kingella: oxidasa positivas con tetrametil-p-fenilendiamina; positivas débiles con el reactivo dimetilo. 7 Capnocytophaga canimorsus puede ser oxidasa positivo débil. 8 La producción de indol puede ser débil debido a la formación de una pequeña cantidad y puede no detectarse por pro cedimientos que no son concentrados por la extracción con xileno (14).

B a c te r ia s g r a m n e g a tiv a s

661

Diagrama 44-15. D i f e r e n c i a c i ó n d e lo s bacilos g r a m n e g a t i v o s , aerobios a anaerobios facultativos, desarrollan en el agar de MacConkey (MAC) y son no termentadores (O/inerte)

Burkholderia mallei* Eikenella corrodens Especies de Legionella Especies de MethylobacteriurrP Especies de MoraxellaP Oligella ureolytica*

Acidovorax facilis Especies de Afipia Especies de Bartonella 1 Bordetella pertussis3 Brevundimonas vesicularis Brucella melitensis* NF + + +

NF O/F de la glucosa + Oxidasa + NO 3 —>N0 2 Movilidad

NF +

que

Especies de Pasteurella

Ralstonia pickettii** Especies de Sphingomonas Weeksella virosa Especies de Xanthobacter**

NF + +

IVF

A. facilis A. felis O. ureolytica* R. pickettii Especies de Xant hobacter*

A. broomeae B. melitensis * * B. melitensisM A. clevelandensis B. mallei* M. bovis* B. vesicularis E. corrodens M. lincolnii O. ureolytica* M. bovis* M. osloensis* R. pickettii biovar 3 M. lacunata O. ureolytica* Especies M. nonliquefaciens W. virosa de Sphingomonas* M. oloensis* O. ureolytica Sphingomonas B. mallei* H2S P. avium paucimobilis P. lymphan(PbAc) P. caballi gitidis U reasa P. canis P. dagmatis Acidovorax P gallinarum Véanse cuadros facilis P. langaa g melitensis* * Continúa en 44-18 y 44-46 P.mairii q ureolytica la página A. felis P. multocida m osloensis**6 siguiente O. ureolytica7 P. pneumo R. pickettii tropica Xanthobacter P. stomatis B. melitensis** P. testudinis B. mallei* M. bovis P. volantium P. bettyae M. lincolnii Véanse cuadros 44-4, 44-45, 44-52 y 44-67

Especies de Xanthobacter

M. osloensis**6 W. virosa Véanse cuadros 44-18 y 44-46 Continúa en la página siguiente

Véanse cuadros 44-17, 44-18, 44-26, 44-46 y 44-67

Glucosa

I Brucella melitensis*

l O. ureolytica7 M. osloensis

Véanse cuadros 44-41 y 44-45

(continúa)

662

E s q u e m a s d e id e n tific a c ió n

Diagrama 44-15. (continuación)

_|_w

Indol + Licuefacción de la gelatina

Weeksella virosa

Moraxella bovis*

b . melitensis m . bovis*

M. lincolnii M. osloensis

Véanse cua dros 44-17 y 44-41 U reasa

A. broomea e8 A. clevelandensis8' O. ureolytica1 +

Sphingomonas H?S

I Fenilalanina

I Oligella ureolytica

+w Hidrólisis de la esculina +w

i A. brnomeae A. clevelandensis

Sphingomonas parapaucimobilis Sphingomonas paucimobilis

Xilosa

Afipia clevelandensis Y

Afipia brnomeae*1 8 7 6 5 4 3 2 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Especies de Bartonella: altamente exigentes; agregar hemina al medio; identificación por métodos serológicos; la ma yoría de las especies requiere 7 días o más para los resultados bioquímicos; véase cuadro 44-14 para la diferenciación. 2 Especies de Methylobacterium: colonias con pigmentación rosa; véase cuadro 44-38 para la diferenciación. 3 Bordetella pertussis requiere el medio de Bordet-Gengou para el aislamiento primario; no desarrolla en los medios ha bituales. 4 Brucella melitensis: no produce ácido a partir de los hidratos de carbono convencionales. 5 Moraxella catarrhalisy M. ovis muestran formas de cocos y diplococos; recuerdan las especies de Neisseria, véase co cos gramnegativos para la diferenciación bioquímica. 6 Pocas cepas de Moraxella osloensis son ureasa positivas débiles. 7 Oligella ureolytica ureasa y fenilalanina positivos; ureasa positivos fuerte en el término de minutos. 8 Positivo tardío.

Bacterias gramnegativas 663

Diagrama 44-16. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos, que no desarrollan en el agar de MacConkey (MAC) y son term entadores (F) y oxidadores (O) Especies de Aemmonas Especies de Haemophilus

Actinobacillus seminis Actinobacillus ureae

Actinobacillus hominis Actinobacillus muris Actinobacillus rossii

Oxidasa

A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A. A.

+x +v

hominis muris rossii seminis* ureae* caviae eucrenophila hydrop hila media salmonicida schubertii sobria veronii

H. actinomycetemcomitans H. ducreyi H. haemoglobinophilus H. haemolyticus H. influenzae H. paracuniculus H. parahaemolyticus H. parainfluenzae H. paraprohaemolyticus H. paraphrophilus

H. haemolyticus H. ducreyi H. haemoglobinophilus H. influenzae

A. A. A. A.

caviae eucrenophila hydrophíla veronii

A. A. A. A. A.

hominis* muris1 seminis* media* salmonicida subesp. masoucida A. salmonicida subesp. salmonicida

Véanse cuadros 44-6 y 44-7

I Galactosa A Manitol -

H. paragallina rum

+ +

A. sobria A. schubertii

Véase cuadro 44-7

+ -

Haemophilus parasuis

Aeromonas sal A. hominis* monicida sub A. rossii esp. smithia** A. seminis* A. ureae A. media* A. salmonicida subesp. achromogenes A. salmonicida subesp. smithia** H. actinomycetem comitans I Véanse cuadros 44-6, 44-7 y 44-32

H. parasuis H. segnis i Inulina Mañosa Melibiosa Ribosa

H. actinomycetemcomitans

Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Reacción positiva tardía. *

H. paragallinarum H. parasuis H. segnis

Especies de Actinobacillus Especies de Aeromonas

N 0 3 —> N 0 2 Movilidad Hidrólisis de la esculina

Actinobacillus Actinobacillus ureae seminis

-X -V

H. paiacuniculus H. parahaemolyticus H. parainfluenzae H. paraprohaemolyticus H. paraphrophilus

Véase cuadro 44-32

Sacarosa - Trehalosa + Fosfatasa + U reasa -

Haemophilus aphrophilus

Factores de crecimien to requeridos para el -x aislamiento con +x incremento de CO? -+v —v

+ + +

A. seminis* A. ureae H. aphrophilus H. paragallinarum H. parasuis H. segnis

Haemophilus segnis

664

E s q u e m a s d e id e n tific a c ió n

Diagrama 44-17.

Diferenciación de los cocos y diplococos gramnegativos, aerobios a anaerobios facultativos Morococcus

Especies de Alcaligenes*1 Especies de Gemella

Especies de Neisseria2

Psychrobacter immobilis

Moraxella catarrhalis Moraxella ovis Fw

F O/F de la glucosa NF

Especies de Morococcus

Véase cuadro 4 4 -4 2

Oxidasa

Especies de Gemella

Véase cuadro 44-31

Especies de Alcaligenes Especies de Neisseria

Psychrobacter immobilis M. catarrhalis M. o vis

Psychrobacter immobilis-. ureasa y fenilaianina positivos; véase cuadro 44-51

+ + +

+ +

~ r Alcaligenes A. latus M. catarrhalis * faecalis subesp. faecalis M. ovis N. canis N. polysaccharea

Pigmentación amarillenta

I Neiserria polysaccharea3

I A. latus M. catarrhalis M. o vis N. canis

Catalasa N 0 3 -> N 0 2 Movilidad

+ +

+ i

M. catarrhalis N. cinérea N. denitrificans N. flavescens N. gonorrhoeae N. lactamica N. macacae N. meningitidis N. sicca N. subflava I Véanse cuadros 44-41 y 44-43

Neisseria mucosa

Neisseria elongata

M. catarrhalis M. ovis N. canis N. polysacchaiea3

Véanse cuadros 44-41 y 44-43

Véanse cuadros 44-10, 44-41 y 44-43 * Resultados variables.

1Alcaligenes faecalis y A. latus: bacilos, cocobacilos y cocos. 2 Neisseria elongata exhibe bacilos cortos a menudo dispuestos en forma de diplococos o en cadenas cortas. 3 N. polysaccharea dispuesta en pares y tétradas.

Bacterias gramnegativas 665

Diagrama 44-18. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, microaerófilos a anaerobios NF (O/-)

OF de la glucosa Anaerobiospiríllum Anaerorhabdus furcosus Bacteroides* Butyrivibrio Centipeda períodontii Fusobacterium? Helicobacter Leptotríchia buccalis Megamonas hypermegas M itsuokella m ultiacidus + M obiluncus3 + Prevotella + Propionigenium P Porphyrom onas es coli Selenom onas C. fetus subesp. Succinim onas fetus Succinivibrio C. fetus subesp. Tissierella *1 veneralis

Bacteroides Bacteroides Bacteroides Bacteroides

coagulaos forsythus p u t redinis ureolyticus

Taylorella equigenitalis

Especies de Tissierella 1 Wolinella succinogenes

Especies de Cam pylobacter4

+ Catalasa + _ Oxidasa + _ Movilidad

B. ureolyticus Especies B. forsythus** C. concisusB. putredinis* de TissieC. m ucosalis rella** C. sputorum sub esp. sputorum Véase cuadro C. sputorum C. hydm intesti44-13 subesp. bubulus nalis subesp. hydrointestinalis upsaliensis Taylorella C. je ju n i subesp. Especies de equigenitalis tis s ie re lla ** je ju n i Wolinella C. je ju n i subesp. succinogenes doylei C. upsaliensis* I

NO,

Véase cuadro 44-20 I Movilidad

B. coagulaos B. forsythus** B. putredinis*

Véase cuadro 44-13

NO?

C. concisus C.mucosalis C. sputorum sub Especies de Anaerorhabdus furcosus esp. sputorum * Anaerobiospiríllum Especies de Bacteroides* C. sputorum Bacteroides polypragm atus Especies de Fusobacterium subesp. bubulus ' Bacteroides xylanoiyticus Leptotríchia buccalis C. upsaliensis Especies de Butyrivibrio M egam onas hyperm egas Tissierella** Centipeda períoaontiP M itsuokella m ultiacidus W. succinogenes Especies de H elicobacter Especies de Porphyromonas Especies de M obiluncus Especies de Prevotella Especies de Selenom onas Especies de Propionigenium Véanse cuadros Especies de Tissierella 44-20 y 44-66 Succinim onas am lylolytica *5 Succinimonas am lylolytica* Succinivibrio dextrmosolvens

B. ureolyticus C. sputorum subesp. sputorum * C. sputorum subesp. bubulus* Tissierella**

Véanse cuadros 44-13 y 44-20

NO, —f NO2

Bacteroides polypragmatus** Bacteroides xylanoiyticus ** Centipeda períodontii** H elicobacter cinaedi H elicobacter m ustelae H elicobacter pylori* M obiluncus cu rtisii subesp. holm esii Especies de Selenom onas* Tissierella**: Véase la

descripción del género Continúa en la página siguiente

Véase diagrama 44-19 Especies de Anaerobiospiríllum Bacteroides polypragm atus** Bacteroides xylanoiyticus** Especies de Butyrivibrio Centipeda períodontii** H elicobacter fennelliae H elicobacter pylori* M obiluncus cu rtisii subesp. curtisii M obiluncus m ulieris Especies de Selenom onas* Succinim onas am lylolytica Succinivibrio dextrinosolvens Tissierella**: Véase la descripción

del género Véase diagrama 44-21 (continúa)

666

Esquemas de identificación

Diagrama 44-18. (c o n tin u a c ió n ) +

Catalasa Oxidasa

, r

H. cinaedi H. m ustelae H. pylo ri Centipeda p e rio d o n tii”

Centipeda p e rio d o n tii”

B. polypragm atus B. xyíam iyticus Centipeda periodontii’ *6 M obiluncus cu rtisii subesp. holm esii

Especies de

Selenom onas

Anaero Demanda de O2 Micro

H. cinaedi H . mustelae

C e n tip e d a p e rio d o n tii

H. pylo ri

V é a s e cuadro 4 4 -3 3

HZS + Hidrólisis de la esculina + B. polypragm atus B. xylanolyticus ” S. dianae B. xylanolyticus” S. acidam inovorans S. infelix S. lacticifex” S. lacticifex” S. lacticifex” S. rum inantium

A A

Lacto sa A rab in o sa

M obiluncus cu rtisii

subesp. holm esii

s. acidam inovorans S. S. S. S. S.

artom idis flueggei lacticifex” noxia sputigena

“ 1

B. polypragm atus B. xylanolyticus S. rum inantium

Selenom onas acidam inovorans

V é a n s e cuadros 4 4 -4 0 y 4 4 -54

Selenom onas lacticifex

, Licuefacción + de la gelatina

i Bacteroides xylanolyticus B. polypragm atus S. rum inantium

Sacarosa

Selenom onas rum inantium

Bacteroides polypragm atus *1 6 5 4 3 2

Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1Especies de Tissierella: fermentativo débil (F) u oxidativo (O). 2 Fusobacterium : fermentativo débil (F). 3 Mobiluncus: gramvariable; fermentativo débil (F). 4 Especies de Campylobacter, requieren 3-15% de oxígeno (O) y 3-5% de dióxido de carbono (C02) para el desarrollo. 5 Succinimonas : movilidad lenta y progresiva; puede perderse con la exposición al aire. 6 Morfología de la colonia de Centipeda: bacilos serpenteantes; véase descripción del género. *

Bacterias gramnegativas 667

Diagrama 44-19. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, m icroaerófilos a anaerobios, que fe r m entan la glucosa y son inm óviles Anaerorhabdus furcosus Especies de Bacteroides Especies de Fusobacteriurrfl Leptotrichia buccalis

M egam onas hyperm egas 1 M itsuokella m ultiacidu s2 Especies de Porphyromonas r4

Especies de Prevotella Especies de Propionigenium Succinim onas amylolytica

Catalasa B. distasonis B. eggerthii B. fragilis B. ovatus* B. thetaiotaom icron* R oulora *

A A A

B. distasonis B. fragilis B. ovatus

Salicina Trehalosa Xilosa

A A

[

Bacteroides thetaiotaom icron *

Prevotella oulora

Bacteroides eggerthii

Anaerorhabdus furcosus B. caccae B. capillosus B. cellulosolvens B. helcogenes B. ovatus* B. pyogenes B. splanchnicus B. suis B. tectus B. thetaiotaom icron* B. uniform is B. vulgaris Especies de Fusobacterium Leptotrichia buccalis Especies de Porphyrom onas Especies de Prevotella Especies de Propionigenium:

Véase descripción del género

Véase cuadro 44-13

Succinim onas amylolytica:

Véase cuadro 44-59 +

B. ovatus B. splanchnicus B. thetaiotaom icron B. uniform is F. prausnitzii Porphyrom onas **4 P. heparinolytica

G A A

Bilis 20% NG Melibiosa A Rafinosa -

Indol Hidrólisis de la esculina

F. gonidaformans Anaerorhabdus fur- B. cellulosolvens* F. naviforme cosus B. pyogenes * F. necrophorurrP B. caccae B. vulgaris* F. nucleatum B. capillosus F alocis Porphyromonas* B. cellulosolvens * F. perfoetens i B. helcogenes F. periodonticum I B. pyogenes F. russii F. simiae Véase cuadro B. suis B. tectus F. suici 44-29 B. vulgaris F. ulceraos F. m ortiferum P. bivia F. necrogenes P. corporis F. varum P. disiens L. buccalis P. interm edia P loescheii P. m elaninogenica P. m elaninogenica* Succinim onas am y NG P. oralis lolytica** P. oris Succinim onas am y lolytica**

Véanse cuadros 44-13 y 44-29 Véase cuadro 44-13

Véase diagrama 44-20

B. ovatus B. splanchnicus Prevotella F. pra u sn itzii* B. thetaiotao- F. prausnitzii** heparino- P heparinolytica* m icron lytica** B. uniformis

+ I

i Fusobacterium prausnitzii

Continúa en la página siguiente

H,S Prevotella heparinolytica

(continúa)

668

Esquemas de identificación

Diagrama 4 4-19 . (c o n tin u a c ió n )

i A A

Glucosa Lactosa

B. capillosus* A. furcosus** A. furcosus** B. cellulosolvens B. caccae B. capillosus B. tectum * B. helcogenes B. tectum * B. pyogenes F necrogenes^ B. suis F. variurrh B. vulgaris |------------F. m ortiferunfi L. buccalis Véanse cuadros 44-12, P. loescheii 44-13 y 44-29 P m eianinogenica P. oralis P. oris

Bilis 20%

A. furcosus B. caccae L. buccalis**7 F. m ortiferum

B. helcogenes B. pyogenes B. suis B. vulgaris L buccalis**7 P. loescheii P. m eianinogenica P. oralis P. oris

Véanse cuadros 44-12, 44-13 y 44-29

A A

Arabinosa Ribosa

B. suis? P. oris

B. vulgaris P. oris

B. pyogenes P. oralis* R on

A Saiicina +w Gelatina -

A +W

{ Prevotella oris

Licuefacción de la gelatina ' Prevotella oris

B. helcogenes P. loescheii P. m eianinogenica P. oralis * P. oris *

- X ilo sa + G e la tin a -

i Bacteroides vulgaris

Bacteroides suis

Bacteroides Prevotella pyogenes oris Prevotella oralis A A

I Bacteroides helcogenes

A A

4.W

Saiicina Xilosa Gelatina

í Prevotella oris

Prevotella oralis

P. loescheii P. meianinogenica

Véase cuadro 44-49*1 7 6 5 4 3 2 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable.

1 M e g a m o n a s . bacilos grandes, por lo com ún con aspecto granular; véase la descripción del género. 2 MitsuokeHa: la fermentación a menudo es vigorosa, véase cuadro 44-39. 3 Especies de Fusobacterium: identificación por cromatografía gaseosa, patrones electroforéticos y espectrometría de masa; véanse notas al pie en el género. 4 Porphyromonas. colonias de color castaño a negro en agar con sangre (BA). 5 Fermentación débil de la glucosa. 6 Fermentación débil de la glucosa y de la lactosa. 7 Leptotrichia buccalis. véase cuadro 44-36. 3 Fermentación débil de la ribosa.

Bacterias gramnegativas 669

Diagrama 44-20. Diferenciación de los bacilos gramnegativos, microaerófilos a anaerobios, que son: Glucosa-F Inmóviles

Catalasa-Neg Indol-Neg

Hidrólisis de la esculina-Neg

Fusobacterium russii Fusobacterium simiae °usobacte:ium suici Fusobacterium ulceraos Prevotella bivia Prevotella corporis

Bacteroides cellulosolvens* Bacteroides pyogenes* Bacteroides vulgaris* Fusobacterium alocis Fusobacterium perfoetens Fusobacterium periodonticum

| _ +

B acteioides vulgaris

B. cellulosolvens F. alocis F. perfoetens F. periodonticum F. russii F. suici F. ulceraos** P. corporis P. disiens P. interm edia

B. pyogenes B. vulgaris P. bivia

Véase cuadro 44-29

F. sim iae F. ulceraos**

. A

Véase cuadro 44 -59

Bilis, 20% Lactosa

NG A

Prevotella disiens Prevotella interm edia Prevotella m elaninogenica* Succinim onas amylolytica:

P.m elaninogenica

Arabinosa Licuefacción de la gelatina

P. bivia P. m elaninogenica

Véase cuadro 44-49

Bacteroides pyogenes

I Prevotella interm edia

~ T ~ Prevotella disiens

Maltosa Sacarosa

Fusobacterium B. cellulosolvens perfoetens F. alocis F. periodonticum F. russii F. suici F. ulceraos P. corporis

Celobiosa B. cellulosolvens F. ulceraos**

Véanse cuadros 44-13 y 44-29

F. alocis F periodonticum F. russii F. suici F. ulceraos** P. corporis

H2S F. F.

periodonticum russii*

i I Véase cuadro 44-29

F. alocis F russii* F. suici F.ulceraos R corporis

__________________________________________________________________ Véanse cuadros 44-29 y 44-49 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable.

670

Esquemas de identificación

Diagrama 44-21.

Diferenciación de los bacilos gramnegativos, m icroaerófilos a anaerobios, que son Glucosa-F Móviles

N 0 3 -> N 0 2-Neg

Especies de Anaerobiospirillum Bacteroides polypragm atus** Bacteroides x y la n o ly tic u s " Especies de Butyrivibrio Centipeda p e rio d o n tii " *1 Helicobacter fennelliae + +

H elicobacter p y lo ri ' M obiluncus cu rtisii subesp. curtisii M obiluncus m ulieris Especies de Selenom onas * Succinim onas am ylolytica *2 Succinivibrío dextrinosolvens

Catalasa Oxidasa

H. fennelliae H. pylori

Anaerobiospirillum " B. c ro s s o tu s " B. fibrisolvens"

Véase cuadro 44-33

Véanse cuadros 44-11 y 44-19

Anaerobiospirillum ** B. polypragm atus B. xylanolyticus B. crossotus ** B. fibrisolvens** M. cu rtisii subesp. curtisii M. m ulieris Especies de Selenom onas Succinim onas am ylolytica :

Véase cuadro 44-59 Succinivibrio dextrinosolvens

+ +

Anaerobiospirillum " B. fibrisolvens" B. polypragm atus S. rum inantium B. xylanolyticus" S. lactilytica **

H2S Hidrólisis de la esculina

Anaerobiospirillum " B. crossotus" B. fibrisolvens" B. xylanolyticus" S. acidam inovorans" S. la ctilytica "

Anaerobiospirillum ** B. fibrisolvens ** S. dianae S. infelix S. la ctilytica ** S. dextrinosolvens’"'

Anaerobiospirillum ** B. fibrisolvens ** B. c io s s o tu s " M. cu rtisii subesp. curtisii M. m ulieris S. acidam inovorans " S. artem idis S. flueggei S. la ctilytica ”

S. nox/'a S. sputigena* S. dextrinosolvens **

Véanse cuadros 44-11,44-13, 44-19, 44-40, 44-54 y 44-60 * Resultados variables. ** No se dispone de resultados; tratado como variable. 1 Morfología de la colonia de Centipeda-, bacilos serpenteantes; véase descripción del género. 2 Movilidad lenta y progresiva; puede perderse con la exposición al aire.

Bacterias gramnegativas 671

Diagrama 44-22. Diferenciación de los cocos y diplococos gramnegativos, anaerobios, que son Glucosa-F Catalasa-Neg

Inmóviles

Especies de Peptostreptococcus Especies de Veillonella

A cidam inococcus ferm entans Especies de M egasphaera

Especies de Peptostreptococcus* Especies de Veillonella

Véanse cuadros 44-47 y 44-63 * Resultados variables.

no3

-»

no2

Acidam inococcus ferm entans Especies de M egasphaera Especies de Peptostreptococcus*

Véanse cuadros 44-37 y 44-47

672

Esquemas de identificación

REFERENCIAS 1. B re n n e r DJ, H o llis D G , M o ss C W , et al. V a lid a tio n lis t no. 41. In t .1 S yst B a c te rio l 1992;42:127-328. 2. C o llin s M D , Shah H N . R e c la s s ific a tio n o f B a c te r o id e s p r a e a c u tu s T is s ie r (H o ld e m a n and M o o re ) in a new genus, T is s ie r e lla , as T is s ie r e lla p r a e a c u ta com b nov. In t J Syst B a c te rio l 1986; 36:461-463. 3. D e Vos P, Kersters K , Falsen E, et a l C a m a m o im s D a v is and P ark 1962, gen. nov, n o m . rev. em end, and C o m á m o n o s te r r ig e n a H u g h 1962, sp. nov., nom . rev. In t J S yst B a c te rio l 1985;35:443-453. 4. F a c k la m R R , W ashing ton JA. S tr e p to c o c c u s and re late d catalase-negative G ra m -p o s itiv e cocci. In : B a lo w s A , H ausle r W J Jr, H erm aan K L , et al., eds. M a n u a l o f C lin ic a l M ic ro b io lo g y , ed 5. W a sh in g ton , D C : A m e ric a n S ociety fo r M ic ro b io lo g y , 1991: 238-257. 5. Forbes B A G , Sahn DF, W eissfeld A S . B a ile y & S cott’s D iagn ostic M ic ro b io lo g y , ed 10. St. L o u is : M osby, 1998. 6. F o rtie r A H , Green SJ, P olsinelh T, et al. L ife and death o f an in tra c e llu la r pathogenr-F ra n c is e lla tu la r e n s is and the macrophage Im m u n o l Ser 1994;60:349-361. 7. G o o d w in CS, A rm s tro n g JA , C h ilv e rs T, T ransfer o f C a m p y lo b a c te r p y lo r i and C u m p y lo b a c te r m u s te la e to H e lic o b a c te r gen. nov. as H e lic o b a c te r p y l o r i com b, n o v and H e lic o b a c te r m u s te la e com b nov., respectively. In t J Syst B a c te rio l 1989;39:397-405. 8. G rehn M , M ü lle r F. T h e oxidase re a c tio n o f P a ste u re la a m u lto c id a strains cu ltu re d on M ü lle r-H in to n m e dium . J C lin M ic ro b io l 19 89;9(3):333-336. 9. G reen P N , B o u s fie ld IJ. E m e n d a tio n o f M e th y lo b a c te r iu m Patt, C ole, and H anson 1976: M e th y lo b a c te r iu m r h o d in u m (H eu m an n 1962) com b. nov. corrig ., M e th y lo b a c te r iu m r a d io to le r a n s lit o and Iis u k a 1971) com b, nov., c o rrig . and M e th y lo b a c te r iu m m e s o p h ilic u m (A u s tin and G o o d fe llo w 1979 com b, nov. In t J Syst B a c te rio l 1983;33:875-877. 10. H olm e s B , P o p o ffM , K ir e d jia n M , K ersters L . O c h r o b a c tr u m a n th r o p i gen. nov., sp. nov, fro m hum an c lin ic a l specim ens. A n d p re v io u s ly k n o w n as V d . I n t J S yst B a c te rio l 1988;38:406-416. 11. H o lm e s B , S te ig e rw a lt A G , W eave r R E , B re n n e r D J. C h r y s e o m o n a s p o ly tr ic h a gen. nov., sp. nov., a P s e u d o m o n a s - lik e o rg a n is m fro m hum an c lin ic a l specim ens and fo rm e rly k n o w n as g roup V e -1. In t J S yst B a c te rio l 1986;36:161-165. 12. H o lm e s B , S te ig e rw a lt A G , W eaver R E , B re n n e r D J. V a lid a tio n h s tn o . 23. In t J S y s tB a c te rio l 1987 ;3 7 : 179-180. 13. H o lm e s B , S te ig e rw a lt A G , W eaver R E , B re n n e r DJ. C h r y s e o m o n a s lu te o la com b, nov., and F la v im o n a s o r y z ih a b ita n s gen. nov., com b, nov., P s e u d o m o n a s -\ik e species fro m hum an c lin ic a l specimens and fo rm e rly k n o w n , re s p e c tiv e ly as groups V e -1 and V e-2 In t J Syst B a c te rio l 1987;37:245-250. 14. H o lt JG, K re ig N R . B e rg e y ’ s M a n u a l o f D e te rm in a tiv e B a c te rio lo g y v o l 2. B a ltim o re : W illia m s & W il k in s , 1994. 15. J u n i E , H e y m G A . P s y c h r o b a c te r im m o b ilis gen. nov., sp. nov.: Genospecies com posed o f G ra m ne

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Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas Taxonom ía..........................................................................................................................................................673 Cambios en la nomenclatura de las bacterias gramnegativas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae/Referencias .............................................................................................................674 Clasificación/Géneros y especies/Referencias ...........................................................................................676 Características generales de la familia Enterobacteriaceae .................................................................... 681 Medios para el aislamiento y la diferenciación de la familia Enterobacteriaceae ..............................682 Reacciones en KIA/TSI para la mayoría de los miembros de la familia Enterobacteriaceae............684 A dvertencias..................................................................................................................................................... 687 KIA/TSI: ácido/ácido, con/sin gas Reacciones bioquím icas.............................................................................................................................688 Diagramas de flujo diagnóstico .............................................................................................................698 KIA/TSI: ácido/ácido, H2S, con/sin gas Reacciones bioquímicas .......................................................................................................................... 709 Diagramas de flujo diagnóstico .............................................................................................................711 KIA/TSI: alcalino/ácido, con/sin gas Reacciones bioquímicas .......................................................................................................................... 712 Diagramas de flujo diagnóstico .............................................................................................................722 KIA/TSI: alcalino/ácido, H2S, con/sin gas Reacciones bioquím icas.............................................................................................................................736 Diagramas de flujo diagnóstico ................................................................................................ 738 KLA/TSI: alcalino/alcalino o alcalino/sin cambios Reacciones bioquímicas .......................................................................................................................... 740 Diagramas de flujo diagnóstico .............................................................................................................741 Referencias ........................................................................................................................................................742 TAXONOMÍA

Muchos de los cambios en la taxonomía y en la nomenclatura ocurrieron dentro de la familia Entero bacteriaceae desde la última edición de este manual. Se descubrieron muchos nuevos géneros y especies, algunos poco habituales y raros, y muchas especies fueron reclasificadas en nuevos géneros. Estos cambios en la taxonomía y en la nomenclatura resultaron de un enfoque polifásico de la taxo nomía; el uso de una amplia variedad de procedimientos como nuevas pruebas bioquímicas, bacteriófa gos específicos de especies o grupo, pruebas relacionadas con el ácido desoxirribonucleico (DNA), tipi ficación por el ácido ribonucleico (RNA) (ribotipificación) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos procedimientos ayudan en la asignación definitiva a nuevas especies y en ocasiones a nuevos géne ros de cepas de bacterias distintas en el aspecto morfológico y bioquímico. La taxonomía y la nomenclatura de la familia Enterobacteriaceae difiere entre los microbiólogos clí nicos. Este capítulo sobre Enterobacteriaceae utiliza la clasificación que figura en la propuesta 2a edición del Bergey ’s Manual o f Systematic Bacteriology.

674

Esquemas de identificación

CAMBIOS EN LA NOMENCLATURA DE LAS BACTERIAS GRAMNEGATIVAS PERTENECIENTES A LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE ( N o ta : B e r g e y ’s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y , 9 a e d ic ió n , fu e im p r e s o e n 1 9 9 4 ; e n c o n s e c u e n c ia , la s re fe re n c ia s a n u e v o s g é n e ro s y e s p e c ie s se r e fie r e n a la s m e n c io n a d a s d e s d e 1 9 9 5 a 1 9 9 9 .)

Definiciones

Basónimo: Sinónimo:

n o m b re o r ig in a l d e u n a n u e v a c o m b in a c ió n

O b je tiv o : m á s d e u n n o m b re S u b je tiv o : n o m b re d ife r e n te a tip o s d ife re n te s ; p u b lic a d o p r im e r o , “ s e n io r” ; ú lt im o , “ j u n i o r ”

gen. nov.: g é n e ro n u e v o sp. nov.: e s p e c ie n u e v a Nombre actual B r e n n e r ia n i g r i f l u e n s B r e n n e r ia p a r a d i s i a c a B r e n n e r i a q u e r c in a B r e n n e r i a r u b r ifa c ie n s B r e n n e r ia s a lic is B u tt i a u x e l l a a g r e s tii, sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a b r e n n e r a e , sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a f e r r a g u t i a e , sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a g a v i n i a e , sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a iz a r d ii, sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a n o a c k i a e , sp. n o v .1 B u tt i a u x e l l a w a n n b o l d i a e , sp. n o v .1 C e d e c e a d a v is a e C e d e c e a n e te r i E s p e c ie 3 de C e d e c e a E s p e c ie 5 de C e d e c e a C itr o b a c te r a m a l o n a t i c u s C itr o b a c te r k o s e r i C itr o b a c te r r o d e n tiu m , sp. n o v .4 E n te r o b a c t e r a e r o g e n e s E n te r o b a c t e r a m n i g e n u s de lo s b io g m p o s 1 & 2 E n te r o b a c t e r a s b u r i a e E n te r o b a c t e r c a n c e r o g e n u s E n te r o b a c t e r d i s s o l v e n s E n te r o b a c t e r h o r m a e c h e i E n te r o b a c t e r i n t e r m e d iu s E n te r o b a c t e r k o b e i, sp. n o v .5 E n te r o b a c t e r n i m ip r e s s u r a lis E n te r o b a c t e r s a k a z a k i i E r w i n i a a ln i, sp. n o v .6 E r w i n i a c a r n e g ie a n a E r w i n i a c a r o to v o r a subesp. c a r o to v o r a E r w i n i a c h r y s a n th e m i E r w in ia jjy p r ip e d ii E r w i n i a r h a p o n tic i E sc h e r ic h ia fe r g u s o n ii E s c h e r i c h i a h e r m a n n ii E s c h e r ic h ia v u ln e r is E r w in g e lla F r a n c is e lla p h i l o m i r a g i a H a f n i a a lv e i K le b s ie lla o r n ith in o ly tic a K l e b s i e l l a o x y to c a K le b s ie lla p la n tic o la

Nombre antiguo (basónimos y sinónimos) E r w in ia E r w in ia E r w in ia E r w in ia E r w in ia

n ig r iflu e n s p a r a d is ia c a q u e r c in a r u b r ifa c ie n s s a lic is

G ru p o e n té ric o 15, s u b g ru p o U a v is 2 E s p e c ie 4 d e C e d e c e a C e d e c e a cep a 0 0 1 3 C e d e c e a cepa 0 0 2 3 L e v i n e a a m a lo n a tic a C i t r o b a c t e r d iv é r s u s K le b s ie lla m o b ilis G ru p o H 3 G m p o e n té ric o 17 E n te r o b a c t e r ta y lo r a e , E r w i n i a c a n c e r o g e n E r w i n i a d is s o lv e n s G ru p o e n té ric o 75 N o m b re in c o rre c to , E n te r o b a c t e r in te r m e d iu m E r w i n i a n i m i p r e s s u r a lis E n te r o b a c t e r c lo a c a e c o n p ig m e n ta c ió n a m a rilla P e c t o b a c t e r i u m c a r n e g ie a n a P e c t o b a c t e r i u m c a r o to v o r u m E r w in ia p a r a d is ia c a , P e c to b a c te r iu m c h r y s a n th e m i P e c to b a c te r iu m c y p r ip e d ii P e c to b a c te r iu m r h a p o n tic i G m p o e n té ric o 107 G m p o e n té ric o l l 7 G m p o e n té ric o l , 7 A P I g m p o 2 ,7 g m p o A lm a l 7 G m p o e n té ric o 40 Y e r s in ia p h i l o m i r a g i a E n te r o b a c t e r h a fn ia K l e b s i e l l a g m p o 47 K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e cepas in d o l p o s itiv a s K l e b s i e l l a especie 2 , g m p o e n té ric o 4 7 , g m p o K de Iz a rd y c o l.,8 K l e b s i e l l a tr e v is a n ii

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales grapinegativas 675 K le b s ie lla p n e u m o n i a e subesp. o z a e n a e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e subesp. r h in o s c le r o m a tis K l e b s i e l l a t e r r ig e n a K lu y v e r a a sc o r b a ta K l u y v e r a c o c h l e a e , sp. n o v .1 K l u y v e r a g e o r g ia n a , sp. n o v .1 L e c le r c ia a d e c a r b o x y la ta L e m in o r e lla M o e lle r e lla w is c o n s e n s is P a n to e a a g g lo m e r a n s P a n to e a a n a n a tis P a n to e a s t e w a r t i i subesp. s t e w a r t i i P e c to b a c te r iu m c a c tic id a P e c to b a c te r iu m c a r o to v o r u m subesp. a t r o s e p tic u m P e c to b a c te r iu m c a r o to v o r u m subesp. b e ta v a s c u lo r u m P e c to b a c te r iu m c a r o to v o r u m subesp. c a r o to v o r u m P e c to b a c te r iu m c a r o to v o r u m subesp. o d o r ife r u m P e c to b a c te r iu m c a r o to v o r u m subesp. w a s a b i a e P e c to b a c te r iu m c h r y s a n t h e m i P e c to b a c te r iu m c y p r i p e d i i P e c to b a c te r iu m r h a p o n tic i P h o to r h a b d u s l u m in e s c e n s P r o t e u s i n c o n s ta n s P r o te u s m o r g a n ii subesp. m o r g a n ii P r o v i d e n c i a r e ttg e r i P r o v i d e n c i a r u s tig ia n ii S a l m o n e l l a c h o l e r a e s u i s subesp. a r i z o n a e

K le b s ie lla o za e n a e K l e b s i e l l a r h i n o s c le r o m a tis G ru p o L de Iz a rd y c o l.8 G ru p o e n té ric o 8, A P I g ru p o 1

E s c h e r i c h i a a d e c a r b o x y la ta G ru p o e n té ric o 57 G ru p o e n té ric o 46 E n te r o b a c t e r a g g lo m e r a n s , E r w i n i a m ille d a e , E r w i n i a h e r b ic o la N o m b re in c o rre c to , P a n to e a a n a n a s ; E r w in ia a n a n a s , E r w in ia u re o d o v o ra E r w i n i a s te w a r tii E r w i n i a c a c tic id a E r w i n i a c a r o to v o r u m subesp. a tr o s e p tic a E r w i n i a c a r o to v o r a subesp. b e t a v a s c u l o r a E r w i n i a c a r o to v o r a subesp. c a r o to v o r a E r w i n i a c a r o to v o r a subesp. o d o r ífe r a E r w i n i a c a r o to v o r a subesp. w a s a b i a e E r w i n i a c h r y s a n th e m i E r w i n i a c y p r ip e d ii E r w in ia rh a p o n tic i X e n o r h a b d u s l u m in e s c e n s P r o v i d e n c i a a lc a l i f a c i e n s P r o te u s m o r g a n ii P r o te u s r e ttg e r i P ro v id e n c ia fr ie d e r ic ia n a S a lm o n e lla a r iz o n a e ; n o m b re in c o rre c to , S a lm o n e lla c h o le r a e - s u is N o m b re in c o rre c to , S a l m o n e l l a c h o le r a e - s u is

S a l m o n e l l a c h o l e r a e s u i s subesp. d ia r iz o n a e N o m b re in c o rre c to , S a l m o n e l l a c h o le r a e - s u is S a l m o n e l l a c h o l e r a e s u i s subesp. h o u te n a e N o m b re in c o rre c to , S a l m o n e l l a c h o le r a e - s u is S a l m o n e l l a c h o l e r a e s u i s subesp. s a l a m a e S e r r a d a p r o t e a m a c u l a n s subesp. p r o t e a m a c u l a n s S e r r a d a l iq u e fa c ie n s S e r r a d a m a r in o r u b r a S e r r a d a r u b id a e a G ru p o E F -9 (C D C ) T a tu m e lla p t y s e u s G ru p o e n té ric o 90 T r a b u ls ie lla W ig g le s w o r th ia gen. n o v .9 W ig g le s w o r th ia g lo s s in ic lia , sp. n o v .9 X e n o r h a b d u s n e m a t o p h i l u s subesp. b e d d i n g i i X e n o r h a b d u s b e d d in g ii X e n o r h a b d u s n e m a t o p h i l u s subesp. b o v ie n ii X e n o r h a b d u s b o v ie n ii X e n o r h a b d u s j a p o n i c u s , sp. n o v .10 X e n o rh a b d u s p o in a r ii Y e r s in ia a ld o v a e Y e r s in ia b e r c o v ie r i Y e r s in ia m o lla r e tii Y o k e n e lla r e g e n s b u r g e i

X e n o r h a b d u s n e m a t o p h i l u s subesp. p o i n a r i i G ru p o X 2 d e n tro de Y e r s in ia e n te r o c o litic a Y e r s in ia e n te r o c o litic a d e l b io g m p o 3 B Y e r s in ia e n te r o c o litic a d e l b io g m p o 3 A K o s e r e lla tr a b u ls ii, g ru p o e n té ric o 45

{ N o ta : G r u p o e n té ric o es u n a d e s ig n a c ió n d a d a p a ra lo s g é n e ro s y e s p e c ie s q u e a ú n n o tie n e n u n n o m b re d e fin id o .)

676

Esquemas de identificación

REFERENCIAS 1 M ü lle r H E , B ren ner D J, F a n n in g G R , et al. E m ended d e s c rip tio n o f B u ttia u x e lla a g r e s tis w ith re c o g n itio n o f s ix new species o f B u ttia u x e lla and tw o new spe cies o f K lu y v e r a : B u ttia u x e lla fe r r a g u tia e sp. nov., B u ttia u x e lla g a v in ia e sp. nov., B u ttia u x e lla b re n n e ra e sp. nov., B u ttia u x e lla iz a r d ii sp. nov., B u ttia u x e lla n o a c k ia e sp. nov., K lu y v e r a c o c h le a e sp. nov., and K lu y v e r a g e o r g ia n a sp. nov. In t J Syst B a c te rio l 1 9 9 6 ;4 6 (l):5 0 -6 3 . 2 B ae B H , S ureka S B , A ja m y JA . E n te ric g ro u p 15 (E n te r o b a c te r ia c e a e ) associated w ith pneum onia. J C lin M ic ro b io l 19 81;14(5):596-597. 3 F arm er JJ 3rd. D a v is B R , H ic k m a n -B re n n e r F W , et al. B io c h e m ic a l id e n tific a tio n o f n e w species and b iog rou ps o f E n te r o b a c te r ia c e a e isolate d fro m c lin i cal specimens. J C lin M ic ro b io l 1 9 8 5 ;2 1 (l):4 6 -7 6 . 4 Shauer D B , Zabel B A G , Pedraza IF, et al. V a lid a tio n lis t no. 56. In t J Syst B a c te rio l 1 9 9 6 ;4 6 (l):3 6 2 -3 6 3 . 5 K o s a k o Y, Tam ura K , S akazaki R , M i k i K . V a lid a tio n

lis t no. 62. In t J Syst B a c te rio l 1997;4 7(4 ):91 5-91 6. 6 S u rico G , M u g n a i L , P asto re lli R , et al. E r w in a a lm i, a new species causing b a rk cankers o f alde r (A ln u s M ille r ) species. In t J S yst B a c te rio l 19 96;4 6(3 ):72 0726. 7 P ien F D , S hrum S, S w enson J M , et al. C o lo n iz a tio n o f h um an w ounds b y E s c h e r ic h ia v u ln e r is and E s c h e r ic h ia h e r m a n n ii. J C lin M ic r o b io l 19 85;22(2): 283-285. 8 Iz a rd D , F e rra gut C , G a v in i F, et al. K le b s ie lla te r rig e n a , a new species fro m s o il and water. In t J Syst B a c te rio l 1981 ;3 1(1): 116-127. 9 A k s o y S. W ig g le s w o r th ia gen. nov. and W ig g le s w o r th ia g lo s s in id ia sp. nov., taxa c o n sistin g o f the m ycetocyte-associated, p rim a ry e n d o sym b io n ts o f tsetse flie s . In t J Syst B a c te rio l 19 95;4 5(4 ):84 8-85 1. 10 N is h im u ra Y, H a g iw a ra A , S u z u k i T, Y am anaka S. V a lid a tio n lis t no . 54. In t J S yst B a c te rio l 19 95;45(3):619-620.

CLASIFICACIÓN/GÉNEROSY ESPECIES G é n e ro s y e s p e c ie s d e E n te ro b a c te ria c e a e p ro p u e s to s e n e l

logy,

Bergey's Manual o f Systematic Bacterio

2 a e d ic ió n .

Volumen 2: Proteobacterias B a c te r ia R e in o : P ro te o b a c te ria

SECCIÓN XVII: 8-PROTEOBACTERIAS C la s e : Z y m o b a c te r ia O rd e n X I I : . E n te r o b a c te ria le s F a m ilia : E n te ro b a c te ria c e a e

ARSENOPHONUS E s p e c ie ú n ic a , A . nasoniae A T C C 4 9 1 5 1 (n o in c lu id a e n e l Manual ele Bergey; d e s c rita p o r W e rr e n y c o l. ( 1 ) ) ; se o b s e rv a e n a v is p a s ; m ic r o o r g a n is m o e x ig e n te , r e q u ie r e m e d io s n o h a b itu a le s

BUCHNERA E s p e c ie ú n ic a ,

B. aphidicola

B U D V IC IA E s p e c ie ú n ic a , B. aquatica A T C C 2 5 5 6 7 , A T C C 3 5 5 6 7 (n o in c lu id a e n e l A ld o v a y c o l. (2 ))

Manual de Bergey,

d e s c rita p o r

B U T T IA U X E L L A 7 e s p e c ie s (n o in c lu id a s e n e l M a n u a l d e B e rg e y ; d e s c rita s p o r F e r r a g u t y c o l. ( 3 ) ) ; s im ila r a l g é n e ro K l u y v e ra d e s d e e l p u n to d e v is ta fe n o típ ic o ; a is la d o d e a g u a s d u lc e s ; n o se o b s e rv a r o n a is la m ie n to s e n seres h u m a n o s n i e n a n im a le s B . a g re stis, especie tip o A T C C 33320 B. bren n era e B . f e r r a g u tia e B . g a v in ia e B . iza r d ii B . n o a c k ia e B . w a r m b o ld ia e

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 677 C A L Y M M A T O B A C T E R IU M

Especie única, C. granulomatis CEDECEA

3 especies; similar al género Serratia; patógeno oportunista infrecuente; especies 3 y 5 aún sin nombre C. C. C. C. C.

d a v is a e , especie tip o A T C C 33431 la p a g e i n e te n especie 34 especie 54

C IT R O B A C T E R

9 especies5; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas C. a m a lo n a tic u s-, c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas C. b r a a k ii C. f a r m e r i C. f r e u n d ii , especie tip o A T C C 8090 N C T C 9750; co lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con in fecciones hum anas; algunas cepas se asem ejan a S a lm o n e lla desde e l p u n to de v is ta b io q u ím ic o y a g lu tin a n con antisueros p o liva lente s O con tra S a lm o n e lla ; puede ser id e n tific a d a de manera in co rre cta com o especies de S a lm o n e lla C. k o s e r i (C . d iv e r s u s ); c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia co n infe ccio nes humanas C. r o d e n tiu m C. s e d la k ii C. w e r k m a n ii C . youngae

E D W A R D S IE L L A

4 especies; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas E. E. E. E.

a n g u illim o r tife r a h o s h in a e ic ta lu r i ta rd a , especie tip o A T C C 15947; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes h u manas

ENTERO BACTER

13 especies; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E. E.

a e r o g e n e s ; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas a m n ig e n u s ; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas a s b u r ia e c a n c e r o g e n u s (E . ta y lo r a e ); c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con in fe ccio n e s humanas c lo a c a e , especie tip o A T C C 13047; c o lo n iza a los seres hum anos o se asocia con in fe ccio n e s.h u manas d is s o lv e n s gerg o via e-, c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas h o r tn a e c h e i in te r m e d iu s kobei n im ip r e s s u r a lis p y r in u s s a k a z a k ii; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas

E R W IN IA

10 especies; coloniza sobre todo las plantas; raras veces aislado de seres humanos E. E. E. E.

a m y lo v o r a , especie tip o A T C C 15580 a p h id ic o la b illin g ia e c a m e g ie a n a

E. mallotivora E . p e r s ic in u s

678

Esquemas de identificación E. E. E. E.

p sid ii p y rifo lia e rh a p ontici tracheiphila

E S C H E R IC H IA

5 especies E. bla tía e E. cotí, especie tip o A T C C 1175, N C T C 9001; c o lo n iza a los seres hum anos o se asocia con in fe c ciones hum anas; E. co li está s u b d iv id id a p o r los factores de v iru le n c ia com o entotoxinas, invasivid a d , co lo n iz a c ió n : E. coli (E T E C ) entero toxigé nica, E. coli (E IE C ) enteroinvasiva, E. coli (E P E C ) enteropatógena, E. co li (E H E C ) enterohem orrágica, E. co li (E A E C ) enteroagregativa E. fe r g u so n ii E. h erm a n n ii E. vu ln eris

E W IN G E L L A

(No incluido en el M anual de Bergey; descrito por Grimont PAD y col. (4)); similar al género Cedecea\ patógeno oportunista infrecuente Especie única, E. americana; ATCC 33852 H A F N IA

Patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas Especie única, H. alvei; ATCC 13337, NCTC 8105 K L E B S IE L L A

7 especies; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas K. o m ith in o ly tic a K. oxytoca; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas K. p la n tic o la K. p n e u m o n ia e subesp. o za e n a e ; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia co n in fe ccio n e s humanas K. p n e u m o n ia e subesp. p n e u m o n ia e, especie tip o A T C C 13883, N C T C 9633; c o lo n iza a los seres hum anos o se asocia con in fe ccio n e s humanas K. p n e u m o n ia e subesp. rh in o s c le n m a tis

K. terrig ena

KLUYVERA

4 especies; similar a las especies de Buttiauxella; patógeno oportunista infrecuente K. K. K. K.

a sco rh a ta , especie tip o A T C C 33433 co ch leae; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas cryocrescens georgiana

L E C L E R C IA

(No incluido en el M anual de Bergey; descrito por Tamura y col. (5)); patógeno oportunista infrecuente Especie única, L . adecarboxylata (Escherichia adecarboxylata); ATCC 23216 L E M IN O R E L L A

2 especies no incluidas en el Manual de Bergey; descritas por Hickman-Brenner y col. (6) L. L.

g rin ontii, especie tip o A T C C 33999 richardii

M O ELLER ELLA

No incluido en el M anual de Bergey; descrito por Hickman-Brenner y col. (6) Especie única, M. wisconsensis; ATCC 35017

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 679 MORGANELLA 2 especies m organii subesp. m organii, especie tipo ATCC 25830; coloniza a los seres humanos o se asocia con infecciones humanas M . m organii subesp. sib o n ii M.

O B E S U M B A C T E R IU M

Contaminante de la cerveza Especie única, O . p r o l e u s ; ATCC 12841, NCTC 8771 PANTOEA

8 especies no incluidas en el M a n u a l d e B e r g e y ; descritas por Gavini y col. (7); patógeno oportunista P. agg lom erans, especie tipo ATCC 27155, NCTC 9381; coloniza a los seres humanos o se asocia

con infecciones humanas P. a n a n atis P. citrea P. disp ersa P. p u n c ta ta P. stew artii subesp. indologenes P. stew artii subesp. stew artii P. terrea

PHO TO RHABDUS

Especie única, P. luminescens\ ATCC 29999 P L E S IO M O N A S

Especie única, P. shigelloides; ATCC 14029 P R A G IA

No incluido en el M anual de Bergey, descrito por Aldová y col. (8) Especie única, P fontium; CDC 963-84 PRO TEUS

4 especies; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endotoxinas P. P. P. P.

m irabilis; coloniza a los seres humanos o se asocia con infecciones humanas m yxo fa cien s p e n n e d ; coloniza a los seres humanos o se asocia con infecciones humanas vulgaris, especie tipo ATCC 13315, NCTC 4175; coloniza a los seres humanos o se asocia con

infecciones humanas

PROVIDENCIA 5 especies P. P. P. P. P.

a lcalifaciens; especie tipo ATCC 9886 heim bachae rettgeri rustigianii stu a rtii

R AH NELLA

Especie única, R . a q u a tilis ; ATCC 33071 SACCHAROBACTER

Especie única, S. fermentatus; WVB 8512

680

Esquemas de identificación

SALM O N ELLA

10 especies; todos los serotipos colonizan a los seres humanos o están asociados con infecciones humanas S. S. S. S. S. S. S. S. S. S.

bongori choleraesuis subesp. arizonae choleraesuis subesp. choleraesuis, choleraesuis subesp. diarizonae choleraesuis subesp. houtenae choleraesuis subesp. indica choleraesuis subesp. salamae enteritidis typhi typhimurium

especie tip o A T C C 13312, A T C C 13314, N C T C 5735

S E R R A T IA

10 especies; patógeno oportunista; produce factores de virulencia como endo toxinas S. entomophila S. ficaria S. fonticola S. grimesii S. marcescens, especie tip o

A T C C 13880; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes

humanas

S. odorífera S. plymuthica S. proteamaculans

subesp. proteamaculans c ia con in fe ccio n e s humanas proteamaculans subesp. quinovora

(S. liquefaciensf, c o lo n iza

S. S rubidaea S H IG E L L A

4 especies; patógeno, todas las especies producen disentería S. boydii S. dysenieriae, especie 5. flexneri S. sonnei

tip o A T C C 13313

T A T U M E LLA

Especie única, T ptyseos; ATCC 33301 T R A B U L S IE L L A

Especie única, I guamensis; ATCC 49490 W IG G LE S W O R T H IA

Encontrado en moscas tse-tsé Especie única, W. glossinidia XENORHABDUS

5 especies X. beddingii X. bovienii X. japonicus X. nematophilus, X. poinarii

especie tip o A T C C 19061

a los seres hum anos o se aso

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 681 Y E R S IN IA

11 especies Y. a ld o vae Y. bercovieri Y. en tero co litica ; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas 1. fred eriksen ii; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas Y. interm edia', c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con infe ccio nes humanas Y. kristen sen ii Y. m o llaretii Y. p e stis , especie tip o A TC C 19428, N C T C 5923; c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia co n in fecciones hum anas; patógeno, agente e tio ló g ic o de la peste “ negra”

Y. p seudotuberculosis', c o lo n iz a a los seres hum anos o se asocia con in fe ccio n e s humanas Y. rohdei Y. ruckeri YO KENELLA

No incluido en el M anual de Bergey, descrita por Kosako y col. (9); similar a Hafnia desde el punto de vista bioquímico Especie única, Y. regensburgei (Cortesía del Dr. George Garrity, Director, Bergey’s Manual Trust.

REFERENCIAS 1. W erren et al. In t J S yst B a c te rio l 1991 ;41(3): 563564. 2. A ld o v a E K , e t al. Z e n tra lb l B a k te rio l Parasitenkd In fe k tlo n s k rH y g A b t 1. O rig , R eihe 1983; A 2 5 4 ;9 5 108. V a lid a te d b y B o u v e t O M M , et al. In t J S vst B a c te rio l 1985;35(2):60-64. 3. F e rra g u t C D , e t al. In t J S yst B a c te rio l 1982;3 2 (2 ):2 6 6 268. 4. G rim o n t P A D , et al. In t J Syst B a c te rio l 1984; 34 (1); 91-92.

5. T a m ura K et al. In t J S yst B a c te rio l 19 8 7 ;3 7 (2 ): 179-180. 6. H ic k m a n -B re n n e r F W , et al. In t J S yst B a c te rio l 1984;3 4(3 ):35 5-35 7. H ic k m a n -B re n n e r FW , et al. In t J S yst B a c te rio l 19 85;3 5(2 ):37 5-37 6. 7. G avini F, et al. In t J Syst Bacteriol 1989;39(3): 337-345. 8. A ld o v á E K , e t al. In t J S yst B a c te rio l 1 9 88;3 8 (2 ):18 3-18 9. 9. K o sa ko Y, et al. In t J S yst B a c te rio l 1 9 85;3 5(2 ): 223-224.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE________ Bacilos gramnegativos rectos No formadores de esporas Anaerobios facultativos Catalasa variables, por lo común positivos Cápsula variable Movilidad variable; si es positiva, flagelos peritricos; excepto Tatumella, flagelos laterales

Oxidasa negativos O/F de la glucosa: F (fermentativos) o F y O (oxidativos) Temperatura óptima de crecimiento: 37°C Reducción de nitratos: variable, por lo común positiva Crecimiento en MacConkey (MAC); excepto Arsenophonus nasoniae

O) 00

M e d io s de a g a r en p la c a b

A islam iento selectivo Agar sulfito de bismuto (BS, BSA)f

H id ra to s de c a rb o n o p re s e n te s f

Glucosa

Salm onella-S higella (SS)'

Lactosa

Verde brillante (BG, BGA)h

Lactosa, sacarosa0

Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)i

Lactosa0 • sacarosa0 xilosae

Diferencial Agar entérico Hektoen (HE, HEA, HEK) Desoxicolato citrato (DC) (medio de Leifson) Desoxicolato citrato lac tosa (DCL)

Lactosa, sacarosa0, salicma0 Lactosa

Lactosa

C o lo n ia s In d ic a d o r d e H 2&

In d ic a d o r de p H

Ningunos

In cu ba ció n (h)

18-24

Rojo neutro

18-24

Rojo fenol

18-24

Azul de bromotimol (BTB), fucsina ácidaq Rojo neutro

Rojo neutro

18-24

L F (FtLFf*

N LF

Por lo general inhibidas; si crece, color verde par dusco

S. typhi: de color negro azabache, ro

Coliformes incoloras con centros rosas, otros: rosado-rojas Amarillas, amarillo verdosas rodeado de una zona amarillo-verde iOntenso Amarillas, opacas

Coloreadas de amarillo a salmón Rosadas-rojas, opacas A menudo rodeadas por una zona roja con cen tros negros o sin ellos

deadas por amplias zonas de color negro pardusco con brillo metálico o sin él; otras especies de Salm one lla: colonias negras verdosas, sin zonas que las rodeen; especies de Shigella: de color verde pardusco Incoloras con centros negros o sin ellos Rojas-rosadas-blancas, opacas, ro deadas por una zona de color rojo intenso brillante Rojas-rosadas con centros negros o sin ellos

Proteus coloreadas de azul-verde a

azul o salmón; la mayoría con cen tros negros Transparentes - incoloras a rosa claro o tostadas, con centros negros o sin ellos

MEDIOS PARA EL AISLAMIENTO Y LA DIFERENCIACIÓN DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

Cuadro 45-1. M e d io s p a r a e l a is la m ie n to y la d ife re n c ia c ió n d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e r-

C u a d ro 4 5 -1 . M e d io s p a ra e l a is la m ie n to y la d ife re n c ia c ió n d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e g ( c o n t ) M e d io s de a g a r e n placel0

H id ra to s de c a rb o n o p re s e n te d

C o lo n ia s In d ic a d o r d e H 2&

Lactosa, sacarosac

Lactosa, sacarosa0

MacConkey (MC, MAC)

Lactosa

In cu b a ció n (h)

L F (R L F T

NLP

Púrpura de bromocresol (BCP) Rojo neutro

18-24

Colonias transparentes, trans lúcidas 0 azuladas opacas

Amarillas a blancas, opacas, translúcidasP

18-24

Véase DC

EosinaY, azul de metí leño111

18-24

E. c o ir azul oscuro-negras a

Incoloras 0 transparentes con color ámbar (púrpura claro)

Rojo neutro

18-24

parduscas con brillo metáli co 0 sin éln; pueden presen tar centros oscuros con peri ferias incoloras ámbarinas Color rojo ladrillo a rosado-rojo

Incoloras 0 amarillo pálido

a Diferenciación sobre todo por la utilización de hidratos de carbono con variaciones del pH, producción accidental de H2S y no siempre evidente en los medios de cultivo en

placas: utilizar KIA/TSI/LIA para los resultados del H2S b Todos los medios de cultivo en placas contienen diversos colorantes que por lo común inhiben la mayoría de las bacterias grampositivas, 0 Un microorganismo no termentador de lactosa puede dar una indicación positiva falsa de fermentación de lactosa si hay presencia de otro hidrato de carbono que pueda ser utilizado (p. ej-, sacarosa por Proteus vulgaris). d Posibles indicadores de H2S sulfato de hierro (II), citrato de hierro (III), tiosulfato de sodio, citrato de hierro (III) (mezcla 50:50 de cltrato férrico y citrato de amonio) y sulfato de amonio y hierro (III). e LF- termentador de lactosa, RLF: termentador rápido de lactosa; NFL, no termentador de lactosa f Medio de Wilson y Blair, altamente selectivo, los coliformes están en gran medida inhibidos y las especies de Shigella pueden inhibirse; recomendado para el aislamiento Salmonella typhi y otros entéricos. s Verde brillante incorporado junto con un metal pesado, el sulfito de bismuto, como Inhibidores. h Altamente selectivo; recomendado para el aislamiento de especies de Salmonella distintas de S typhi, no para el aislamiento de las especies de Shigella, medio coloreado de castaño roji*zo que se torna rojo brillante durante la incubación y retoma el color normal a temperatura ambiente (22-25°C) ' Por lo general inhibitorio para coliformes 1Recomendado para el aislamiento de patógenos entéricos, sobre todo especies de Shigella y especies de Providencia k La incubación durante 48 h aumenta la visibilidad de los centros negros por el H2S de Salmonella ; sin embargo, el período de incubación que excede las 48 h puede conducir a resultados falsos positivos 1 El medio de Levme utilizado con más frecuencia contiene sólo lactosa, el medio Holt-Harris y Teague contiene lactosa y sacarosa. m Dos colorantes de anilina se combinan para formar un precipitado a pH ácido, los colorantes actúan como indicadores diferenciales e inhibidores n Azul-negro con la luz transmitida, brillo metálico por la luz reflejada. 0 Recomendado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella y del vibrión del cólera, Alcaligenes y algunas especies de Proteus/Providencia, pueden inhibirse p Fermentadores de la sacarosa 4 Véase cuadro 45-2.

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 683

Desoxicolato citrato lac tosa sacarosa (DCLS) (Hajna y Damon) Desoxicolato cltrato lac tosa sacarosa (DCLS) (Leiffson )0 Eosina-azul de metileno (EMB )*1*4

In d ica d o r de p H

684

Esquemas de identificación

Cuadro 45-2.

In d ic a d o r d e A n d ra d e

Colorante

Ácido

Alcalino

Azul de bromotimol Fucsina ácida (indicador de Andrade)

Amarillo (pH 6,0) Rojo rosado (pH 5,0)

Púrpura de bromocresol Rojo fenol Rojo neutro

Amarillo (pH 5,2) Amarillo (pH 6 ,8 ) Rojo (pH 6 ,8 )

Azul de Prusia oscuro (pH 7,6) Rojo (pH 12,0) a incoloro (pH 14,0) Amarillo pálido (pH 8,0) Púrpura (pH 6 ,8 ) Rojo (pH 8,4) Amarillo (pH 8,0)

Cuadro 45-3.

R e a c c io n e s e n K IA /T S I d e la m a y o ría d e lo s m ie m b ro s d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e (to d o s g lu c o s a p o s itiv o s (A, Á c id o ) ) 3

M ic ro o rg a n is m o

Gas, G lu

Lac

Sac

h 2s

KIA

TSI

Arsenophonus nasoniae Budvicia aquatica

ALC/A

V+

AJA AJA, H2S

AJA AJA AJA, H2S

ALC/A ALC/A, H2S

AJA AJA

AJA A/A

Butiiauxella agrestis C. am alonaticus biogrupo 1

+ +

—

C. freundii

ALC/A

C. koseri C. lapagei

+ +

V V

V —

ALC/A A/A, H2S ALC/A, H2S

A/A ALC/A A/A, H2S ALC/A, H2S

—

AJA

ALC/A

—

ALC/A A/A ALC/A

C. neteri

—

Cedecea davisae

Cedecea especie 3

—

Cedecea especie 5 Citrobacter am alonaticus

+ +

A V

—

E. am nigenus biogrupo 1

—

E. am nigenus biogrupo 2

—

E. asburíae

—

E. E. E. E.

+ +

A A

A V

—

AJA

ALC/A A/A ALC/A ALC/A

AJA

ALC/A A/A AJA AJA

ALC/A

cancerogenus cloacae cotí coli inactiva

E. dissolvens

—

E. fergusonii E. gergoviae

+ +

“

ALC/A A/A ALC/A A/A ALC/A A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A A/A

ALC/A A/A A/A

AJA

ALC/A A/A ALC/A ALC/A

ALC/A

AJA

AJA AJA

ALC/A A/A A/A ALC/A AJA

AJA

ALC/A

ALC/A E. herm annii E. E. E. E. E. E.

horm aechae ictaluri interm edius nim ipressuralis sakazakii tarda

V + + + +

A A A -

V A V A -

—

AJA

A/A

ALC/A

ALC/A ALC/A ALC/A AJA A/A AJA

AJA AJA AJA

ALC/A, H2S

AJA

ALC/A

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 685 Cuadro 45-3.

R e a c c io n e s e n K IA /T S I d e la m a y o ría d e lo s m ie m b ro s d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e (to d o s g lu c o s a p o s itiv o s (A, Á c id o ))3 (c o n tin u a c ió n )

M ic ro o rg a n is m o

Gas, G lu

Lac

Sac

V +

Edwardsiella hoshinae Enterobacter aerogenes

V +

Escherichia blattae Especies de Shigella Ewingella americana

+ ~

Grupos entéricos 63 64

+ V

V-

A ~

h 2s

E. tarda biogrupo 1 E. vulneris

A A

—

— -

—

KIA

TSI

ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A

A/A A/A ALC/A A/A A/A ALC/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A A/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A A/A A/A A/A ALC/A A/A A/A ALC/A

A -

H. alvei biogrupo 1 Hafnia alvei K. cryocrescens

+ +

V+

—

K. oxytoca K. planticola K. pneumoniae subesp. ozaenae K. pneum oniae subesp. pneum oniae K. pneum oniae subesp. rhinosclerom atis K. terrigena Klebsiella ornithinolytica Kluyvera ascorbata L. richardii Leclercia (Escherichia) adecarboxylata Lem inorella grim ontii M. m organii subesp. m organii

+ + V

A A V

A A

—

ALC/A A/A ALC/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A A/A A/A A/A ALC/A A/A

V+

—

ALC/A

—

+ + +

A A A A

A A A V

+ -

A/A A/A A/A ALC/A, H2S A/A

+ +

—

+ V

M oellerella wisconsensis M organella m organii subesp. m organii biogrupo 1 O besum bacteñum proteus P. dispersa R mirabilis

A -

ALC/A, H2S ALC/A ALC/A, H2S A/A ALC/A

—

P. m yxoiaciens P. penned

—

P. rettgeri P. rustigianii

—

P. stuartii

—

ALC/A

P. vulgaris

—

ALC/A, H2S

Pantoea agglom erans

—

biogrupo 2

ALC/A ALC/A ALC/A, H2S

A JA A JA A JA

ALC/A, H2S A/A ALC/A, H2S ALC/A ALC/A, H2S A JA

ALC/A A JA

AJA AJA, H2S

ALC/A, H2S A A

V -

ALC/A ALC/A ALC/A, H2S ALC/A ALC/A

AJA AJA AJA, H2S AJA AJA

ALC/A

Plesiom onas shigelloides Pragia fontium Proteus inconstans Providencia heimbachae

—

A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A, H2S ALC/A ALC/A

A JA

ALC/A A/A, H2S ALC/A A/A AJA

ALC/A ALC/A, H2S AJA

ALC/A

686

Esquemas de identificación

Cuadro 45-3.

R e a c c io n e s e n K IA /T S I d e la m a y o ría d e lo s m ie m b ro s d e la fa m ilia E n te ro b a c te ría c e a e (to d o s g lu c o s a p o s itiv o s (A , Á c id o ) ) 3 (c o n tin u a c ió n )

M ic ro o rg a n is m o Rahnella aquatilis S. choleraesuis serovar choleraesuis S. choleraesuis serovar gallinarum S. choleraesuis serovar p a ratyphi A S. choleraesuis serovar pullorum S. choleraesuis serovar typhi S. choleraesuis subesp. arizonae S. choleraesuis subesp. Choleraesuis S. choleraesuis subesp. diarizonae S. choleraesuis subesp. houtenae S. choleraesuis subesp indica S. choleraesuis subesp. salamae S. ficaría S, S. S. S.

íonticola grim esii m arcescens odorífera biogrupo 1 S. odorífera biogrupo 2 S. plym uthica

Lac

Gas, G lu

Sac

h 2s

—

V-

+ +

—

+ + +

—

+ +

V-

—

+ +

—

V-

—

V+ + V VV

A V A V+

A A A A

A -

A A A A

+ —

—

S. proteam aculans subesp. proteamaculans S. rubidaea Salm onella bongori Senada entom ophila Tatumella ptyseos Y. bercovieri

—

Y. enterocolitica Y. frederiksenii

A A

—

Y. interm edia

V-

—

Y. kristensenii Y. m ollaretii

V—

Y. pestis Y. pseudotuberculosis Y. rohdei Y. ruckeri Yersinia aidovae

—

A -

Yokenella (Koserella) regensburgei

a Excepto los géneros Erwinia y Xenorhabdus

KIA

A/A ALC/A ALC/A, H2S ALC/A, H2S

ALC/A ALC/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S A/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S

A/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S A/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A A/A A/A ALC/A ALC/A

A/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S A/A, H2S ALC/A, H2S ALC/A, H2S A/A

—

A/A ALC/A, H2S ALC/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A ALC/A ALC/A ALC/A ALC/A

ALC/A

TSI

A/A ALC/A ALC/A, H2S ALC/A, H2S

A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A ALC/A, H2S A/A A/A A/A A/A A/A A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A A/A ALC/A A/A ALC/A ALC/A

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 687 REACCIONES EN KIA/TSI PARA LA MAYORÍA DE LOS MIEMBROS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE

ADVERTENCIAS Cuando se utilizan los cuadros de identificación sea consciente de que los resultados mencionados fue ron compilados a partir de las referencias citadas. No obstante, los microorganismos vivientes a menudo dan resultados contradictorios debido a la mutación o al tipo de medio utilizado para el aislamiento, el cultivo, la identificación y el mantenimiento de los mismos. Con frecuencia, la identificación apropiada del género o del género y la especie requiere algunas con sideraciones: a) la muestra o fuente clínica, b) la morfología en la coloración de Gram y c) las caracterís ticas del cultivo (p. ej., pigmentación, hemolisis) junto con las pruebas bioquímicas. En algunos casos se requieren comprobaciones serológicas y de toxinas para la confirmación. Es necesario ser flexible cuando se interpretan los resultados bioquímicos. Todos los microorganismos no siempre exhiben todos los resultados de la batería de pruebas bioquímicas que figuran en los cuadros. A veces es necesario “el mejor encaje” para la identificación. Cuantos más resultados puedan obtenerse, mejores posibilidades de una identificación correcta.

KIA/TSI: ÁCIDO/ÁCIDO, CON/SIN GAS

688

Esquemas de identificación

Cuadro 45-4. Reacciones bioquímicas de miembros de la familia Enterobacteríaceae con una reacción KIA/TSI de ÁCIDO ÁCIDO, CON/SIN GAS _________________________________ o C/)

-O 03 O

W 3 c o

o ° P ru e b a

i0 f O C0 W != ® < c

cr 03 03 O > T3 3

O) 03 _03

0 X 03 ■j—! 3

T3 03 (/) > 05 T3 03

0 0 T3 0

0 0 0) 03 CL 03 0 O 0 "0 0 o

0 0 0 C 03 0 O 0 "0 0 o

Catalasa, 24 h Oxidasa n o 3^ n o 2 0 -F de la glucosa H2S (KIA/TSI) KIA

+ F V+ A/A A/A H2S ALC/A H2S

+ F

A/A

A/A ALC/A

AA ALC/A

A/A ALC/A

TSI

A/A

A/A A/A, H2S ALC/A

A/A

A/A ALC/A

A/A

(A;i V+

® A

® V

(A) vA

® V A -

F -

ALC/A

Ferm entaciones de los hidratos de carbono A Glucosa y gas Lactosa A Sacarosa Adonitol L-Arabinosa NR D-Arabitol Celobiosa Dulcitol NR Eritritol Glicerol m/o-lnositol Maltosa D-Manitol NR D-Manosa NR Melibiosa NR a-Metil-D-glucósido NR Mucato Raflnosa L-Ramnosa NR Salicina NR D-Sorbitol Trehalosa D-Xilosa Reacciones IMViC Indol Rojo de metilo (MR) Voges-Proskauer (VP) Citrato (Simmons) NR Reacciones de descarboxilasa/dihidrolasa Arginina dihidrolasa Usina descarboxilasa Ornitlna descarboxilasa Reacciones de urea/fenilalanina Ureasa (Christensen) NG Fenilalanina desaminasa, 24 h NR Otras reacciones NR Utilización del acetato DNasa, 25°C NG Hidrólisis de la esculina Licuefacción de la gelatina, 22°C + NR Gluconato NR Crecimiento en caldo KCN Lipasa (aceite de cereal) NR Utilización del malonato NR ONPG NR Tartrato, Jordon Movilidad, 36°C/flagelos Pigmentación -

+ + F

§ & 0

03 0 O 0 "0 0 o

+ F

ALC/A

A/A ALC/A

A -

V -

V+ V

A -

—

A A A

A A A A

V -

A A A

A A A A V

A A

A A A A

A A

+ -

+ +

+ V +

V v+ +

+ V +

V +

v+ -

+ -

V -

V +

+ v+

V+

NR +

+ + +

NR + +

+ +

NR V + + +

Vp -

+ V

Vpaa -

V +p

I + + I

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I < < < I I I Z I < I I

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I +

I T|+

I +

i t i+ i

Klebsiella planticola

g > g l Tl< I

Klebsiella pneumo niae subesp. ozaenae

Klebsiella pneumoniae subesp. pneumoniae ^ 1

I ~n +

"n +

Klebsiella pneumo niae, subesp. rhinoscleromatis 1

r-> > i Ti +

Klebsiella terrigena

691

8> >

Fam ilia E nte roba cte ria ceae y otras ba cteria s intestinales gram ne gativa s

+ _+1 I I I I I I I I I I > I >

1 1 1

z z z

XXX

X +XXXXX

< 1

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+ < 1 1 1 z 1 < 1 1 + X

I I '

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9 T3 9

+ 1

714

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 45-8.

R e a c c io n e s b io q u ím ic a s d e m ie m b ro s d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e c o n u n a re a c c ió n K iA /T S i d e A L C A L IN O /Á C ID O , C O N /S IN G A S (c o n tin u a c ió n ) ___________________ CD > O g>

O -C

s o as n 0 O -C i- o 0 0 C £ LU E

O) cá o

P ru e b a

c LLi

Catalasa, 24 h Oxidasa N03^ n o 2 0 - F de la glucosa H2S (KIAATSI) KIA

+ + F — A/A ALC/A

TSI

A/A

Ferm entaciones de hidratos de carbono Glucosa y gas ® V Lactosa A Sacarosa V Adonltol A L-Arabinosa A D-Arabitol A Celobiosa — Dulcitol — Eritritol A Glicerol — m/o-lnositol Maltosa A A D-Manitol D-Manosa A A Mellbiosa a-Met¡l-D-glucós¡do Mucato Rafinosa A L-Ramnosa A Salicina A — D-Sorbltol Trehalosa A D-Xilosa A Reacciones IMViC Indol Rojo de metilo (MR) Voges-Proskauer (VP) + Citrato (Simmons) + Reacciones de descarboxilasa/dihidrolasa Arginina dihidrolasa Lisina descarboxilasa +« + Ornitina descarboxilasa Reacciones de urea/fenilalanina + Ureasa (Christensen) Fenilalanina desaminasa, 24 h Otras reacciones Utilización del acetato + DNasa, 25°C Hidrólisis de la esculina + — Licuefacción de la gelatina, 22°C Gluconato + Crecimiento en caldo KCN Llpasa (aceite de cereal) + Utilización del malonato + ONPG Tartrato, Jordon + Movilidad, 36°C/flagelos +P Pigmentación

^C D i— >

£ ce ce 'c LU

^CC o .> o E ce ‘c LU

ó ce .c

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o 0Z3 0) Jd ce -C o

0 0

.c o 0 Ui

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++ I

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I > I I I > ! I i I I I

I

I < Z < 3D

I >

Hafnia alvei

l1 +

Hafnia alvei biogrupo 1

>> o> >

> > l T l >

Klebsiella pneumo niae su b e sp ozaenae'

o> >

> I T]+ I1 + o >

Q> >

> > I ■71+ 11 + o> >

> O >

> I -n+ I1 + l~ o >

Morganella morgami

:- n + i1 +

Morganella morganii

rc |—|—ro | i— «O O M O O >> >> > r~ O >

> I T1 + r~ O >

> > I ■71+ o> >

I > > > II I I I < < > I > < >

Ewingella am ericana *1

> ! T+ r~ O >

> > > > I I I I > I > I

1 1©

> > I ~n+ l + o> >

> O > r~

> > > >

! > I i I i I i i I i I

Escherichia vulneris

> I T l+ l + r~ O >

V V V V W

V A A A A

C > > 3 > )

> > I ~n + l + o> >

> O > r~

Escherichia hermannll

Klebsiella pneum o niae subesp. rhinoscleromatis Kluyvera cryocrescens

b io g ru p o 1

b io g ru p o 2

1 + Obesumbacterium proteus i

1 + Pantoea agglomerans

> I -n < I +

o 5

Pantoea dispersak

715

Fam ilia E nte ro b a cte ria ce a e y otras ba cteria s intestinales gram ne gativa s

I > > > I > I I I

> > i ~n+ l +

716

Pruebas bioquímicas individuales

Cuadro 45-8. R e a c c io n e s b io q u ím ic a s d e m ie m b ro s d e la fa m ilia E n te ro b a c te ria c e a e c o n u n a re a c c ió n K IA /T S I d e A L C A L IN O /Á C ID O , C O N /S IN G A S (c o n tin u a c ió n ) CO c CD O £5

E =3 C

O □_

O Q_

ce o c

-C ce o c

> O ü_

> 0 o ce a. o

0 •0

(Si

0 0

c 0 0

O G_

00 0

ce o

0 ■0

o cl

—

+ F V+

+ F

+ F V

ALC/A

ALC/A ALC/A H2S

A/A ALC/A

A/A

A/A ALC/A

Providencia stuartn

+ Serratia entomophila

+ Serratia ficaria

> 1 _n + O

+ Serratia grimesii

> 1n +

+ Serratia marcescens

r~ O

< ■

>£ 1n + o> >

+ Serratia odorífera bio-

>> 1n + o> >

+ Serratia plymuthica

~n+ > 1— 1 o >

+ Serratia proteamaculans"

> r~ o >

> 1 -n + r* o >

+ Shigella dysenteriae (A)°

> r~ O

> 1 T1+ r~ O

+ Shigella flexneri (B)p

> iQ >

> 1 -n + r o >

+ Shigella boydii (C)n

S> I I < I -l

I I ............................ I

I I I

L I +
JJ

grupo 1m

Familia Enterobacteriaceae y otras bacterias intestinales gramnegativas 717

I I+ I

■5rV

Q> >

I I I I I I I I I I

+ I
I > I > I

I I

+ +
1

I I

-o i

Q —

C *0

"O 0

\ !> .0

0 D "O _Q

0 3 ~o -O 0 JT O

Shigella

-Q

P ru e b a

Catalasa, 24 h Oxidasa

NO3 — >NO2

E D

O C 0

CL O

2 c

s s

0 c

0 D

0 c

X m ^ 0 ■O £ -Q ^

0 _Q -C o 3

Q _

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D "O

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-F 'en -2 -o

O C

0—

& +

—

> +

—

+ F

ALC/A

NR NR NR NR

ALC/A

A/A ALC/A

0 -F de la glucosa H,S (KIA/TSI) KIA

ALC/A

F NR NR

TSI

ALC/A

AJA

NR NR NR NR NR NR NR NR NR V NR A NR A NR NR NR NR NR V+ NR A NR

A NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR -

NR NR NR V NR NR

V -

Fermentaciones de hidratos de carbono A Glucosa y gas Lactosa Sacarosa Adonltol A L-Arabinosa NR D-Arabltol Celobiosa — Dulcltol NR Eritrltol vGllcerol m/o-lnositol A Maltosa A D-Manitol A D-Manosa V Mellbiosa a-Met¡l-D- -glucósido _ Mucato — Rafinosa V+ L-Ramnosa — Salicina — D-Sorbitol A Trehalosa — D-Xllosa Reacciones IMViC Indol + Rojo de metilo (MR) Voges-Proskauer(VP) 22°C 37°C Cltrato (Simmons) Reacciones de descarboxilasa/dihidrolasa Arginina dihldrolasa _ Usina descarboxllasa + Ornitina descarboxilasa Reacciones de urea/fenilalanina Ureasa (Christensen) — Fenllalanina desamlnasa, 24 h Otras reacciones — Utilización del acetato DNasa, 25°C — Hidrólisis de la escullna — Licuefacción de la gelatina, 22°C NR Gluconato Crecimiento en caldo KCN Lipasa (aceite de cereal) — Utilización del malonato + ONPG + Tartrato, Jordon Movilidad, 36°C/flagelos 22°C — 37° C Pigmentación -

A -

A V -

V -

A -

ALC/A

(A)

—

NR NR NR NR NR NR NR NR NR

—

V+

—

NR NR NR NR NR NR NR NR NR

—

NR NR NR

V v+ V

NR NR

—

NR NR NR

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V — — —

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v+ A -

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NR NR NR

V-

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NR + + + NR + -

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NR —

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v+ NR

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V +P

NR NR NR NR NR NR NR +P

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NR — -

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I < I 2

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< ! !>>>>! I I

< I + I I I Z I + I I

++I

l +l

I I I I I +Z I I + I ZD

I I I

n o 2 MacConkey (MAC) 41 °C O/F de la glucosa Citrato Licuefacción de la gelatina, 22°C Glucosa

o 05 -O O

o o

03 _C

^ 8

O 03 -Q O 03

03 c 03 O)

c o

03 JJ

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G G O +

G NG O +

G NG O —

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CO ■2 O) 03 c 03 03 03 O

+ + + G NR O + + A

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CRÉDITOS FOTOGRÁFICOS BD Biosciences

Cortesía de BD Biosciences (antes Becton Dickinson Microbiology Systems) 7 Loveton Circle Sparks MD 21152 REMEL, Inc.

Cortesía de REMEL 12076 Santa Fe Drive Lenexa, KS 66215 Anaerobe Systems

Cortesía de Anaerobe Systems 15906 Concord Circle Morgan Hill, CA 95037 JM James O, Murray, MS, SM (AAM) Microbiólogo Army Medical Department Center & School Academy of Health Sciences Department of Clinical Support Services Fort Sam Houston, TX 78234 FIGURAS EN COLOR

Fig. 1-1. Disco de bacitracina (REMEL).

Fig. 1-2. Disco de bacitracina (REMEL).

746

Apéndices

Positivo

Levemente positivo

Negativo o no inoculado

Fig. 2-1. Prueba de bilis y esculina.

B a c te ro id e s fra g ilis (oscurecimiento del medio) F u s o b a c te riu m n e c ro p h o ru m

Fig. 2-3. A gar para bacteroides con bilis y esculi na (BBE) (JM).

Positivo

Negativo (punta de flecha)

Fig. 4-1. Prueba (reacción) CAMP.

No enlerococos del grupo D

Enterococos del grupo D

Fig. 2 -2 . Agar con bilis y esculina (R E M E L ).

No Inoculado

Insoluble

Soluble

Fig. 3-1. Prueba de solubilidad en bilis.

Fig. 4-2. Disco de ¡3-lisina para la prueba C A M P de la estría de Streptococcus del grupo B y de Staphylococcus (R EM EL).

Apéndice 1 - Resultados fotográficos

No inoculado

Ácido y gas

Ácido

747

Negativo

Fig. 5-1 . Prueba de fermentación de hidratos de

Fig. 5-2. Prueba de fermentación de hidratos de

carbono.

carbono en medio semisólido.

Positivo

Negativo

F ig. 6-1. Prueba de catalasa.

No inoculado

Positivo

Negativo

Fig. 7-1. Prueba de citrato de Simmons.

Negativo

Positivo

No inoculado

Fig. 8-1. Prueba de coagulasa.

Positivo

Negativo

Fig. 9-1. Prueba para lisina de Falkow.

748

Apéndices

S ta p h y lo c o c c u s e p id e rm id is

S e rra tia m a rc e s c e n s

(pigmentación naranja-roja)

K le b s ie lla p n e u m o n ia e

subesp. p n e u m o n ia e (-)

S ta p h y lo c o c c u s a u io u s subesp. a u re u s (+)

Fig. 10-1. Prueba de D N asa en agar antes del agregado de HCI (JM).

Fig. 10-2 . Prueba de D N asa en agar después del agregado de HCI (intermedia) (JM).

S ta p h y lo c o c c u s e p id e rm id is (-)

S e tra tia m a rc e s c e n s . Positivo, rosa K le b s ie lla p n e u m o n ia e subesp. p n e u m o n ia e : Negativo

S e rra tia m a rc e s c e n s (+)

Fig. 10-3. Prueba de D N asa en agar después del agregado de HCI (completa) (JM ).

Fig. 10-4. Prueba de D N asa en agar con azul de toluidina O (JM).

Positivo (licuefacción)

Negativo Positivo

Negativo

Fig. 11-1. Prueba de (3-galactosidasa (ONPG).

Fig. 12-1. Prueba de licuefacción de la gelatina.

Apéndice 1 - Resultados fotográficos

Negativo

Positivo

F ig. 14-1. Disco de hipurato.

Positivo

Negativo

749

Positivo

Fig. 14-2. Prueba rápida con disco de hipurato (R E M E L ).

No inoculado

Positivo

Negativo

F ig . 15-1. Prueba de ácido sulfhídrico con tiras reactivas con acetato de plomo (PbAc).

Fig. 16-1. Prueba de Kovacs para indol.

Fig. 17-1. Disco de acetato de indoxilo(REMEL).

Fig. 17-2. Prueba rápida paratributirina (REMEL).

750

Apéndices

No inoculado

Fig. 18-1. Agar con hierro de Kliger.

Alcalino/ácido, gas (inversión)

Fig. 18-3. Agar con hierro de Kliger.

Alcalino/ácido, gas

Fig. 18-5. Agar con hierro de Kliger.

Acido/ácido, gas

Fig. 18-2. Agar con hierro de Kliger.

Alcalino/ácido

Fig. 18-4. Agar con hierro de Kliger.

Alcalino/ácido, gas, H2S

Fig. 18-6. Agar con hierro de Kliger.

Apéndice 1 - Resultados fotográficos

Fig. 2 0-1. Resultado positivo de lecitinasa (Anaerobe Systems).

751

F ig. 2 0 -2 . Resultado positivo de lecitinasa(Anaerobe Systems).

F u s o c a b te riu m n e c io p h o ru m (positivo)

Fig. 21-1. Disco de leucinaaminopeptidasa(LAP) (REMEL).

Fig. 22-1. Prueba de lipasa (Anaerobe Systems).

752

Apéndices

No inoculado

Ácido y digestión

Acido y coágulo

Reducción

Fermentación tormentosa Reducción del tornasol

Acido y digestión

Fig. 2 3-1. Leche tornasolada

Fig. 2 3-2. Leche tornasolada.

Fig. 24 -1 . Prueba de lisostafina (R E M E L ).

Fig. 25 -1 . Prueba del medio con malonato.

No inoculado

Reducción leve (+)

Reducción y coágulo

Fig. 2 6-1. Prueba de reducción de la leche con azul de metileno para enterococos

No inoculado

Positivo

Negativo

Fig. 27-1. Prueba de rojo de metilo (MR).

Apéndice 1 - Resultados fotográficos 753

No inoculado

Móvil (+)

Inmóvil (-)

Fig. 28-1. Prueba de movilidad.

Tipo III

No inoculado

Positivo

Negativo

Fig. 30-1. Prueba de reducción de nitratos (fase 1 , sin cinc).

Tipo I

Fig. 31 -1 . Prueba de sensibilidad a la optoquina (Streptococcus pneumoniae subesp. pneumoniae).

Fig. 31-2. Prueba de optoquina sensible

(Streptococcus pneumoniae subesp. pneumoniae) y resistente (especies de o -Streptococcus).

Fig. 31-3. Prueba de sensibilidad a la optoquina

(Streptococcus pneumoniae subesp. pneumoniae).

Fig. 32-1. Especies de Neisseria (no patógenas).

754

Apéndices

Fig. 32-2. Prueba de oxidasa para N eisseria (estadio rosa).

Fig. 32-3. Prueba de oxidasa para N eisseria positiva (negro).

No inoculado

Oxidación

Fig. 33-1. Medio O F - Reacción oxidativa.

No inoculado

Positivo

Fermentación

Fig. 33-2. Medio O F - Reacción de fermentación.

Negativo

Fig. 34-1. Prueba de fenilalanina.

Fig. 36-1. Disco de porfirina-ácido 5-am inolevulínico (ALA) (R E M E L ).

Apéndice 1 - Resultados fotográficos 755

Positivo

Negativo

Fig. 37-1. Caldo para pirrolidonil-S-naftilamida

Fig. 37-2. Disco PYR/esculina (R E M E L ).

(P Y R ) (R EM EL).

Hidrólisis positiva

Negativa

Fig. 38-1. Prueba de hidrólisis del almidón.

No inoculado

Positivo

Negativo

Fig. 39-1. Prueba de ureasa de Stuart.

Urease +

Fig. 39-2. Medio para la prueba de ureasa para Mycobacterium (JM).

Fig. 39-3. Discos de urea-fenílalanina (REMEL).

756

Apéndices

Fig. 39-4. Discos de u rea-fenilalanin a (P D A )

Fig. 40-1. Prueba de Voges-Proskauer (VP).

(R EM EL).

Manitol positivo

Coagulasa positivo

Fig. 42-1. Caldo para coagulasa y manitol (caldo

Fig 42-2. Panel R apID -A N A II (R E M E L ).

base con manitol y rojo fenol) (R E M E L ).

Fig. 42-3. Sistema RapID CB-Plus (REMEL).

Fig. 42-4. Panel para la identificación de microor ganism os entéricos y no term en tad ores (BD Biosciences).

Apéndice 1 - Resultados fotográficos

757

■'

Fig. 42 -5 . Sistem a R apID O N E (R E M E L ).

Fig. 4 2-6. Enterotube II (BD Biosclences).

Fig. 4 2-7. Panel R apID N F Plus (R E M E L ).

Fig. 42 -8 . Panel para la identificación de grampositivos BBL4 (BD Biosciences).

Fig. 42-9. Panel RapID STR (REMEL).

APÉNDICE

Unidades de medici )n dei sistema métrico

Centi- (prefijo): significa 100 (1/100). Mili- (prefijo): significa 1.000 (1/1.000).

UNIDADES DE LONGITUD______________________________________________________ M etro (m) 1 m = 1 0 0 cm = 1 . 0 0 0 mm 1 m = 39,37011 pulgadas Centímetro (cm): la centésima parte de un m etro (10 ~ 2 m) 1 cm = 0 , 0 1 m = 1 0 mm 1 cm = 0,3937 pulgada M ilímetro (mm): una milésima parte de un metro (10~ 3 m) 1 mm = 0 , 0 1 cm = 0 , 0 0 1 m 1 mm = 0,03937 pulgada Micron (p): una milésima parte de un milímetro (10~ 3 mm); una millonésima parte de un metro (10 ~ 6 m) 1 p = 0 , 0 0 1 mm = 0 , 0 0 0 0 0 1 m 1 p = 1/25.400 pulgadas M ilimicrón (mp): una milésima parte de un micrón (10 - 3 p); una millonésima parte de un milímetro ( 1 0 - 6 mm); una un mil millonésima parte de un metro ( 1 0 —9) 1 m p = 0 , 0 0 1 p = 0 , 0 0 0 0 0 1 mm = 0 , 0 0 0 0 0 0 0 0 1 m

NIDADES DE PESO___________________________________________________________ Gramo (g) 1 g = 1 . 0 0 0 mg 1 g = 15,43248 granos

M iligramo (mg): una milésima de un gramo (10 ~ 3 g) 1 mg = 0 , 0 0 1 g 1 mg = 0,01543 grano

UNIDADES DE VOLUMEN (CAPACIDAD) Litro (L) 1 L = 1.000 mL (cc)

Mililitro (mL, cc): una m ilésima de un litro (10 1 mL = 0,001 L 1 mL = 0,0033815 onza líquida

CONVERSIONES mx mx

cm x cm x mm x mm x p x p x p x

= cm = mm

g x 1 . 0 0 0 = mg mg x 0 , 0 0 1 = g

=m = mm

L x 1 . 0 0 0 = m L (cc) mL x 0,001 = L

1 0 0

1 .0 0 0

0 ,0 1 1 0

0 ,1

= cm =p

1 .0 0 0

=m = cm = mm

0 ,0 0 0 0 0 1 0 ,0 0 0 1 0 ,0 0 1

pulgadas x 2,54 = cm pulgadas x 25,4 = mm pulgadas x 25.400 = p

APÉNDICE

Indicadores de pH

indicador

pKa

pH ácido

pH alcalino

Compuesto químico

Andrade

7,2; incoloro

5; rosa

8 ; amarillo pálido

Fucsina ácida

Púrpura de bromocresol

6,3; púrpura

5,2; amarillo

6 ,8 ; púrpura

Díbromo-o-cresolsulfonftaleína (C2 iH 160 5SBr2)

Azul de bromotímol

7; verde

6 ; amarillo

7,6; azul de Prusia oscuro

Dibromofenolsulfonftaíeína (^27^28^5^Br2)

Rojo de o-cresol (alcalino)

8,3

7,2; amarillo

8 ,8 ; rojo

o-Cresolsulfonftaleína (C21H 180 5S)

Tornasol (puro)

6 ,8

4,5; rojo

8,3; azul

Indicador comercial: extrac to vegetal

Rojo de metilo

4,4; rojo

6 ; amarillo

4’-Dimetilaminoazobenceno-2 -ácldo carboxíllco (C 15H15N30 2)

Rojo neutro

7,5

6 ,8 ; rojo

8 ; amarillo

2-Metilaminofenazina (C 15H17N4CI)

Rojo fenol

7,9

6 ,8 ; amarillo

8,4; rojo

Fenolsulfonaftaleína (C 19H 140 5S)

a pK, símbolo para el logaritmo de la recíproca de la constante de disociación de un electrólito (pH). pK = log 1/K

APÉNDICE

Correcciones de pH »

“Un trabajador sólo es tan bueno como las herramientas que él emplea.” En este caso, las herramientas del microbiólogo son los medios de cultivo y los reactivos que ellos preparan para sí mismos y para sus co laboradores. La capacidad de un microbiólogo de aislar las bacterias patógenas de las muestras clínicas sólo puede ser tan eficaz como el medio utilizado para el cultivo. El pH correcto es sólo uno de los muchos crite rios requeridos para la adecuada preparación de los medios de cultivo; otros se discuten en todo el texto. Cada lote individual de medio debe estar en su pH óptimo, por lo común en el estadio terminado (es terilizado) y enfriado. Si es demasiado ácido o alcalino, el pH debe corregirse; la mayoría de las bacte rias de importancia médica prefieren un ambiente neutro o ligeramente alcalino para el crecimiento óp timo. El uso de medios comerciales deshidratados por lo común elimina el ajuste del pH; sin embargo, si los medios de cultivo se preparan a partir de sus ingredientes individuales, casi siempre es necesario el ajuste del pH. Las principales razones para los cambios de pH son: el exceso de esterilización, el m ez clado incompleto, el uso de recipientes alcalinos, la hidrólisis de los ingredientes, la presencia de deter gentes en el material de vidrio no bien limpio, las repetidas fundiciones del medio o el empleo de agua destilada o desmineralizada de manera inadecuada para la rehidratación. El pH final requerido varía entre los proveedores comerciales, incluso entre el mismo tipo de medio; es necesario remitirse al rótulo comercial para el pH recomendado. El pH aceptable debe ser + 0,2 uni dades del valor deseado (cuadro 4-1).

Cuadro 4-1. p H re q u e rid o p a ra e l a is la m ie n to y m e d io s p a ra la s p ru e b a s b io q u ím ic a s a__________ M e d io _______________________________________________________ p H d e se a d o (± 0,2) Agar ácido-DNasa (Jeffries, Holtman y Guse) Agar con azúcar triple y hierro (TSI) Agar con bilis y esculina (BE, BEA, BEM) Agar con cistina y tripticasa (CTA) Agar con fenilalanina Agar con hierro de Kligler (KIA) Agar con lisina y hierro (LIA) Agar con peptona y hierro (PIA) Agar con sangre de oveja (SBA) Agar con sulfito de bismuto (BSA) Agar con tripticasa y soja (TSA) Agar con urea de Christensen Agar de MacConkey (MAC) Agar eosina-azul de metileno (Levine) (EMB) Agar metacromático para difusión (DNasa) (MAD) Agar naranja de acridina-desoxirribonucleato (ADA) Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar verde brillante (BGA) Arginina descarboxilasa Base con rojo fenol (semisólido) Base descarboxilasa de Moller Caldo base con rojo fenol Caldo base con rojo fenol e indicador de Andrade Caldo con gluconato y peptona Caldo con hidratos de carbono y rojo fenol Caldo con malonato Caldo con ninhidrina Caldo con nitrato Caldo con nitrito Caldo con triptófano (prueba de indol) Caldo con urea de Rustigian y Stuart

7,3 7,4 7,0 7,3 7,3 7,4 6,7 6,7 7,3 7,6 7,3 6 ,8

7,1 7,1 9,0 9,0 7 6,9 6 ,0

7,5 6

7,4 7,1-7,2 7,0 6 ,8

6,7 7,2 7 6 ,8

7,3 6 ,8

(continúa)

Apéndice 4 - Correcciones de pH 761 Cuadro 4-1. p H re q u e rid o p a ra e l a isla m ie n to y m e d io s p a ra las p ru e b a s b io q uím ica sa M edio

p H deseado (± 0,2)

Caldo de Todd-Hewitt Caldo nutritivo con difosfato de fenolftaleína (PDP) Caldo para ONPG (b-galactosidasa) Caldo para ornitina descarboxilasa (Fay y Barry) Caldo para Streptococcus faecalis (SF) Citrato de Simmons Clark y Lubs (MFI/VP) Gelatina nutritiva (pico de flauta) Indol-nitrato Infusión de cerebro y corazón (BHI) Infusión de corazón (HI) Leche con azul de metileno (MBM) Leche tornasolada Lisina descarboxilasa de Falkow Medio basal con almidón Medio basal para O/F de Hugh y Leifson (OFBM) Medio para estreptococos fecales de Kenner (KF) Medio para la identificación de Gonococcus (GCID) Medio para sulfuro-indol-movilidad (SIM) Movilidad (semisólido) Mueller-Hinton Rojo de metilo/Voges-Proskauer (Clark y Lubs) Staph OF Tioglicolato con gelatina

7,8 7,4 7,3 5,5 6,9 6,9 6,9 6 ,8

7,2 7,4 7,4 6,4 6 ,8 b 6 ,8

7,2 7,1 7,2 7,5 7,3 7,2-7,3 7,4 6,9 7 7

a El pH final deseado puede variar entre los proveedores comerciales; los valores que se muestran en este cuadro cor responden a los productos de BBL o Dlfco. b Corregir con el agregado de tornasol, no con HCI.

A. Reactivos 1. Ácido clorhídrico (HCI); concentrado alrededor de 12 N o al 36% peso en volumen a. Ácido clorhídrico (HCI), 1 N (1) HCI, concentrado, reactivo de calidad (R. G .)............................................. 8,7 mL (2) Agua destilada,. . . llevar a .............................................................................100 mL b. H Q , 0,1 N (1) HCI, 1 N ...............................................................................................................10 mL (2) Agua destilada,. . . llevar a .............................................................................100 mL 2. Hidróxido de sodio (NaOH) a. NaOH, 10 N (40%) (1) NaOH, exento de carbonato, R. G................................................................... 40 g (2) Agua destilada,. . . llevar a.............................................................................100 mL b. NaOH, 1 N (4%) (1) NaOH, 10 N ........................................................................................................10 mL (2) Agua destilada,. . . llevar a .......................................................................... 100 mL c. NaOH, 0,1 N (N/10, 1/10 N) (1) NaOH, 10 N .......................................................................................................... 1 mL (2) Agua destilada,. . . llevar a .............................................................................100 mL 3.

Método de preparación a. Hidróxido de sodio, 10 N (40%) (1) Pesar con rapidez el hidróxido de sodio y disolver en menos de 100 mL de agua destilada en un vaso de precipitación. Este reactivo es altamente higroscópico. (2) Colocar el recipiente en un baño de agua circulante para controlar la temperatura. (3) Enfriar y transferir la solución de NaOH a un frasco graduado de 100 m L y llevar a 100 mL con agua destilada. (4) Conservar en una botella para reactivos de polietileno o de vidrio recubierto con parafina. (5) Rotular de manera correcta. b. Soluciones de NaOH y HCI 1 N y 0,1 N (1) Llenar un frasco graduado de 100 mL con alrededor de 50 mL de agua destilada.

762

Apéndices

(2) Utilizar una pipeta Pro (con bulbo) o un dispositivo similar unido a la pipeta volumétrica para extraer el ácido o el álcali de la botella con solución stock (NaOH, 10 N) o de la bote lla con ácido concentrado (HC1); nunca pipetear con la boca. (3) Con la pipeta Pro, extraer lentamente la cantidad deseada de ácido o álcali del frasco y des cartar la pipeta en un recipiente apropiado. Siempre agregar el ácido o el álcali al agua, nun ca el agua al ácido o al álcali, ya que pueden ocurrir salpicaduras. Ambos reactivos son ex trem adam ente cáusticos; evitar cualquier contacto con la piel o los ojos y si ocurren salpicaduras, enjuagar de inmediato la zona con abundante cantidad de agua de la canilla. (4) Llevar al volumen deseado (100 mL) con agua destilada. No es necesario preparar más de 100 mL ya que por lo común sólo se necesitan unas pocas gotas para ajustar el pH. (5) M ezclar bien y conservar en botellas de vidrio para reactivos tapadas y rotuladas. B. Procedimientos colorimétricos comparativos, dos opciones: 1. Papeles para controlar el pH; tiras de papel impregnadas con diferentes indicadores; el color se compara con la escala control. a. Dos tipos comerciales de tiras indicadoras adecuadas; no utilizar papel de tornasol. (1) Tiras indicadoras de pH (pHydrion test strips). (2) Nitrazina (dinitrofenolazonaftol sódico); indicador universal. b. Procedimiento (1) Cortar alrededor de 2,5 cm de papel; evitar el contacto con los dedos tanto como sea posi ble. (2) Colocar contra un fondo blanco; por ejemplo, papel de filtro. (3) Introducir una varilla de vidrio lim pia en el interior del recipiente bien mezclado (formar remolinos con suavidad para mezclar) y colocar una gota en la tira indicadora; evitar to car el área con los dedos. (4) Permitir que se estabilice el color; unos pocos segundos. (5) Comparar con la escala control provista con el papel indicador. La mayoría de los papeles con nitrazina poseen una escala control cuyos límites de pH varían de 3 a 9; sin embargo, el rango exacto es sólo el de 4,5 (ácido, amarillo) a 7,5 (alcalino, azul). 2. Estándares comerciales en tubos sellados o soluciones con discos coloreados a. Una serie por cada tipo de indicador (1) Una serie: 9 tubos. (2) Rango de pH: intervalos de 0,2 unidad entre los tubos; por ejemplo, rojo fenol: 6 ,8 ; 7; 7,2; ... 8,4. b. Procedimiento (1) M ezclar los frascos de medio con cuidado por agitación suave formando remolinos y con la pipeta (estéril si se comprueba el producto terminado) extraer una alícuota de 10 mL y colocarla en un tubo del mismo diámetro que los estándares. (2) Colocar los tubos junto con la gradilla que contiene los tubos estándar y comparar con el tubo del pH deseado. 3. Ajustar con las tiras de papel o con los estándares comerciales. a. Si es ácido (pH 0-6,9), agregar cantidades medidas de NaOH 0,1 N a alícuotas de 10 mL has ta que el color se asemeje al del pH deseado (tubo estándar o tira reactiva de papel) y registrar la cantidad utilizada. b. Si es alcalino (pH 7,1-14), agregar cantidades medidas de HC10,1 N a alícuotas de 10 mL has ta que el color se asemeje al del pH deseado (tubo estándar o tira reactiva de papel) y registrar la cantidad utilizada. 4. Cálculos a. La cantidad de HC1 o NaOH utilizada para corregir una alícuota de 10 mL x 10 = la cantidad requerida para corregir 1 L de medio preparado. b. Ejemplo: lm L de NaOH 0,1 N se requiere para corregir el caldo base con rojo fenol a 7,4; 1 x 10 = 10 mL de NaOH 0,1 N/L. 5. Con una pipeta, agregar la cantidad calculada de ácido o base 0,1 N a 1 L de medio preparado y m ezclar bien; controlar de nuevo el pH y volver a corregir si es necesario. Las tiras de papel de pH determinan el pH con unos pocos décimos de la unidad de pH determinada. C. pHmetro; método de elección; más preciso 1. Principio: dos electrodos (o combinados) y una célula estándar para determinar la concentración de iones hidrógeno.

Apéndice 4 - Correcciones de pH 763 a. A medida que disminuye la concentración de iones hidrógeno, disminuye el pH (se tom a más ácido). b. Acidez, pH 0-6,9 ; neutralidad, pH 7; alcalinidad, pH 7,1-14. 2. Método de comprobación a. Medios no estériles (1) Colocar el frasco de medio líquido preparado sobre un agitador magnético (p. ej., Vortex) para mezclar bien; si se trata de un medio sólido o semisólido, mantener a 45-50°C para evi tar la solidificación. Utilizar un recipiente con un tamaño de al menos el doble de la canti dad de medio preparado; por ejemplo, un recipiente de 2 L para 1 L de medio. (2) Colocar los electrodos en el recipiente; probar el volumen total del medio preparado; reti rar del agitador magnético cuando se realizan las lecturas de pH. (3) Tomar las lecturas de pH mediante un convertor de temperatura; el dial lee el pH directa mente en unidades de pH. (4) Si es necesario corregir el pH, colocar de nuevo el recipiente sobre el agitador m agnético y agregar gota a gota el reactivo apropiado, ácido o álcali 0,1 N, de acuerdo a la lectura de pH y la acidez o alcalinidad deseada. Controlar de nuevo el pH y volver a corregir tan tas veces como sea necesario para lograr el pH deseado. Es mejor utilizar una concentra ción baja de reactivos (0,1 N) para evitar tener que corregir en repetidas oportunidades el pH; una concentración 1 N es más fuerte y es necesario menos cantidad para la corrección, pero con mucha frecuencia el punto final se alcanza demasiado rápido o se sobrepasa. b. Medios enfriados y esterilizados (terminados); el estado preferido de la comprobación del pH deseado de los medios comerciales deshidratados (como se muestra en el rótulo) es para el pro ducto esterilizado a 25°C (temperatura ambiente). (1) Medios sólidos o semisólidos (a) Alícuotas de 50 mL en vasos de precipitación. (b) Electrodo de combinación estándar o electrodo con forma de lanza: evita la necesidad de fundir los medios y por eso compensa el aumento de la temperatura. (2) Medios líquidos: dos electrodos de superficie o electrodo de combinación. (3) Valor final: promedio de tres lecturas separadas; pH aceptable ± 0,2 unidad del pH deseado. 3. Precauciones a. Los pHmetros deben ser calibrados (estandarizados) de modo frecuente contra buffer estándar de pH conocido y reajustado, si es necesario. (1) El buffer estándar debe estar tan cerca como sea posible del pH del medio a ser probado. (2) La temperatura del buffer estándar debe ser la misma del medio cuando se realizan las lec turas. b. La temperatura influye sobre las lecturas del pH. (1) Cuando corresponda, de acuerdo con el tipo (modelo) del instrumento empleado, el control de la temperatura debe ser establecido a la temperatura del medio a ser probado antes de realizar la lectura. (2) La constante de ionización aumenta con una elevación en la temperatura; por ejemplo, el agua destilada exenta de C 0 2 a 25°C tiene un pH de 7,0, pero a 40°C el pH es 6,7. c. M antener los electrodos inmersos en agua cuando no están en uso; no permitir que se sequen. d. Los instrumentos comerciales varían con los tipos de electrodos, con los circuitos y con las ins trucciones para el manejo; es necesario recurrir al manual de instrucciones que acompaña al instrumento para los procedimientos estándar de funcionamiento. Las determinaciones más pre cisas del pH se realizan con los pHmetros; las lecturas por lo común corresponden a la centé sima de una unidad de pH.

APÉNDICE

Estándares nefelométricos de McFarland

A. Objetivo: determinar la turbidez. 1. Determinar las densidades bacterianas en un cultivo líquido. 2. Producir un cultivo de una densidad deseada. B. Preparación de estándares; sulfato de bario 1. Reactivos a. Cloruro de bario (BaCl2), solución acuosa al 1%. b. Acido sulfúrico (H2S 0 4), químicamente puro, solución acuosa al 1%. c. BaCl2 + H2S 0 4 —¥ B aS 04 + 2 HC1. 2. Tubos de prueba a. 10 tubos nuevos con tapa a rosca (o ampollas) de igual tamaño; limpios y enjuagados de ma nera cuidadosa. b. El mismo diámetro (tamaño) que los tubos a ser comparados. 3. Agregar los reactivos a los tubos rotulados de manera apropiada (1 a 10) en las cantidades que se indican a continuación: E stá n d a re s de su lfa to de b a rio Tubo n ú m e ro

BaCI2 al 1% (mL)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 ,6

0,7

0,8

0,9

1 ,0

H2S 0 4 al 1% (mL)

9,9

9,8

9,7

9,6

9,5

9,4

9,3

9,2

9,1

Densidad aprox. de células 6 12 15 27 3 9 18 21 24 30 (x 108/mL)____________________________________________________________________________________ Densidad aprox. de células (en millones/mL)

300

600

90 0

1.2 00

1.500

1.800

2.100

2.400

2.700

3.000

4. Sellar los tubos o las ampollas y rotular. 5. El precipitado de B a S 0 4 suspendido corresponde aproxim adam ente a la densidad de células hom*ogéneas de Escherichia coli por mililitro. C. Método de uso 1 . Agitar con suavidad los tubos estándar. 2. De manera aséptica, agregar una alícuota medida de un cultivo del caldo a probar en un tubo estéril del mismo diámetro (tamaño) que los tubos estándar. 3. De manera aséptica, agregar una cantidad establecida de solución fisiológica estéril (NaCl), hasta que la turbidez se correlacione con el número deseado de tubo estándar. a. Medir la densidad del tubo con cultivo a probar (1) Cada tubo representa un múltiplo de 300.000.000 (millones) de microorganismos/mL. ( 2)

10» = 100.000 .000 .

(3) Tubo estándar de densidad celular No. x 300.000.000 = No. de microorganismos/mL. (4) Ejemplo: tubo Ns 3 9 x 108 = 900.000.000 microorganismos/mL. b. Producir una densidad deseada; por ejemplo, densidad bacteriana necesaria de 105 (100.000). (1) El cultivo correspondiente al tubo N s 1 (3 x 108) se diluye 1:3 para equipararse a 108. (2) Luego se diluye de nuevo 1:1.000. (3) 108 / 103 = 105

A pé nd ice 5 - E stán dare s ne felo m étricos de M cF arland

765

Precauciones 1. Si un caldo de cultivo a ser probado no es claro: a. Restar el valor del medio no inoculado del valor del cultivo para obtener la densidad bacteria na corregida. b. Ejemplo: tubo NB4 (cultivo en caldo)

tubo Ne 1 (incubado, no inoculado)

tubo Ne 3 (lectura corregida)

2. Si el caldo es altamente coloreado, colocar el tubo no inoculado detrás del tubo estándar para facilitar la lectura.

REFERENCIAS__________________________________________________________________ BransonD.MethodsinClinicalBacteriology. Springfield, IL: Charles C. Thomas. 1972:106.

Finegold SM, Martin WJ, Scott EG. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 5th ed. St. Louis: CV Mosby, 1978:488-489

APÉNDICE

Preparaciones de reactivos

Graduación q u ím ic a ..............................................................................................................................766 Cuadro 6-1. Datos sobre reactivos comunes utilizados en la preparación de m edios............... 766 Soluciones en porcentajes^(%) (p/v, v/v, p / p ) ...................................................................................767 Peso fórmula gramo (Gram Formula Weight, G F W ) ..................................................................... 768 M o l ...........................................................................................................................................................768 Molaridad (M ).........................................................................................................................................768 Cuadro 6-2. Valencias positivas de los elementos utilizados con más frecuencia en la preparación de m e d io s..............................................................................................................769 Peso equivalente gramo (Gram Equivalent Weight, G EW )............................................................ 769 Normalidad (Solución normal) (N ).....................................................................................................770 Diluciones de una solución s to c k ................................................................................................... 771 Titulación......................................................................................................................... 771 Diluciones de ácidos o álcalis concentrados..................................................................................... 772 B uffers...................................................................................................................................................... 773 Colorantes e indicadores .....................................................................................................................774 Enriquecim ientos.................................................................................................................................... 775 Cuadro 6-3. Componentes del factor V c o m e rc ia l..........................................................................776 Otros reactivos......................................................................................................................................... 777 Preparación de se lla d o re s.....................................................................................................................778 Referencias g e n e ra le s........................................................................................................................... 779

GRADUACIÓN QUÍMICA 1. 2. 3. 4.

Reactivo de grado (R. G.)/reactivo analítico (A. R.): alta pureza. Químicamente puro (C. P.): suficientemente puro para su uso en clínica. Farmacopea de los Estados Unidos (U. S. P.): menos puro que C. P. Grado técnico, práctico o comercial: utilizado sobre todo para uso industrial; no utilizado de manera habitual con propósitos clínicos.

Cuadro 6-1.

D a to s s o b re re a c tiv o s c o m u n e s u tiliz a d o s e n la p re p a ra c ió n d e m e d io s

Reactivo concentrado 3

Fórmula

Valencia positiva

Ácido acético, glacial Hidróxido de amonio como Ácido clorhídrico Ácido nítrico Ácido fosfórico Ácido sulfúrico

H C ,H ,0 , NH, HCI HNOg

1 1 1 1

h 3p o 4 h 2s o 4

3 2

GEW 60 17 36,5 63 32,7 49

Peso específico b p/p%c 1,06 0,9 1,19 1,42 1,71 1,84

99,5 28 37 70 85 98

Normali dad 11 17,6 14,8

N°. de mL equiva lentes a 1 g de soluto puro

12,1

0,96 3,97 2,3

15,8 44,4 36,8

0,7 0,57

1,01

a Disponibles en el comercio como soluciones p/p. b A temperatura ambiente, 22-25aC. 0 Pueden variar en un rango pequeño, controlar el rótulo del reactivo comercial y volver a calcular si es necesario. p/p% = número de gramos de soluto por 100 g de solución. d Ver cálculo de la normalidad del ácido o álcali concentrado; ejemplo, HCI.

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 767 Cálculo de la normalidad del ácido o álcali concentrado; ejemplo, HC1. Peso fórmula gramo (GFW) Valencia de los iones positivos

36,5 g = 36,5 g 1

Peso equivalente gramo (GEW) =

Normalidad (N) = (Peso específico)(p/p%) x 1.000 mL _ 1,19 g x 37 g x 1.000 mL Peso equivalente gramo (GEW) 1 mL x 100 g x 36,5 g

SOLUCIONES EN PORCENTAJES (%) 1. Solución en porcentaje (%) peso/volumen (p/v) a. Definición: cantidad de gramos de soluto por 100 mL de solución. b. Objetivo: determinación de la cantidad de gramos de una solución requerida para preparar una solución p/v% de un volumen deseado. c. Fórmula: _ . , , (p/v%) (volumen deseado en mL) Gramos de soluto deseado = — -----—-----—--------------------- — 100 d. Ejemplo: preparar 500 m L de una solución al 10% p/v de NaCl Gramos de soluto deseado = ^ ^ X ^ 100 mL

= 50 g

2. Solución en porcentaje (%) volumen/volumen (v/v) a. Definición: cantidad de mililitros de soluto por 100 mL de solución. b. Objetivo: determ inación de la cantidad de m ililitros de soluto requerida para preparar una solución v/v% de un volumen deseado. c. Fórmula: , , , .. (v/v%) (volumen deseado en mL) Mililitros de soluto requendo = —------ —--- ——-----------------------d. Ejemplo: preparar 250 mL de una solución al 1,5% de HC1 concentrado 1,5 x 250 mL , T Mililitros de soluto requerido = ----- 7777:-------- = 3,75 mL 100 3. Solución en porcentaje (%) peso/peso (p/p) a. Definición: cantidad de gramos de soluto por 100 g de solución; por ejemplo, el H 2 S 0 4 al 49% en agua contiene 49 g de ácido por cada 100 g de solución. b. No utilizado de m anera sistemática; utilizado como una solución v/v % o debe ser convertida a una solución p/v% c. Para preparar una solución p/v%, existen dos métodos de cálculo. d. Ejemplo: preparar una solución al 10% p/v de HC1 (véanse datos del cuadro 6-1). e. Cálculo del método 1. (1) HC1 p/p% = 37 (2) Paso 1: calcular la cantidad de gramos de solución concentrada que contenga 10 g (relación:proporción) 37g de HC1 puro _ 10 g de HC1 puro 1 0 0 g de solución concentrada x (gramos de solución concentrada) 37 x = 10 x 100 .-. x = 1.000/37 = 27 x = 27 g de solución concentrada de HC1 = 10 g de HC1 puro (3) Paso 2: conversión de una solución p/p% a p/v% (a) Objetivo: determinación del volumen de reactivo concentrado que contiene un peso de seado del compuesto puro en solución. (b) Fórmula: Mililitros de solución Gramos de la solución concentrada requerida que contienen el peso requerido ~~ Peso específico de la solución 27 g 1,19 g/mL

= 23 mL

768

Apéndices (c)

HC1 al 10% p/v: diluir 23 mL de solución concentrada a 100 mL con agua. 1. 23 mL pesan 27 g 2. 23 mL contienen 10 g de HC1 puro.

C álculo del m étodo 2; utilizar los datos del cuadro 6-1. (1) Objetivo: determinación de la cantidad de mililitros de un reactivo concentrado p/p% re querida para preparar una solución p/v% de un volumen deseado. (2) Fórmula: .......

(véase cuadro 6-1L,

M ililitr o s de re activo concentrado re querido

(en mL)

_ ( jjjL equivalentes a 1 g ) (p /v % deseado) (V olum en deseado) = n

2,3 mL x 10 g x 100 mL = — !---- =------ — í-------------= 23 mL lg x 100 mL (3) 23 mL de HC1 concentrado diluido a 100 mL con agua.

PESO FÓRMULA GRAMO (GRAM FORMULA WEIGHT (GFW))_______________________ 1. También denominado como peso molecular gramo o peso molar gramo (gram molar weight (GMWj) o masa fórmula relativa. 2. Definición: suma de todos los pesos atómicos de los elementos individuales que constituyen una molécula del compuesto (fórmula química) expresada en gramos. a. Cáda elemento se calcula por el número de veces que aparece en una formula química específica. b. Ejemplo: carbonato de sodio, N ajCOj. E lem ento

N o . de átom os

Na C O

2 1 3

Peso ató m ico

23 12 16

Peso p a rc ia l en la fó rm u la 46 g 12 g ____ 48_g___

Peso m o le cu la r gram o = 106 g

MOL 1. Definición: peso fórmula de un compuesto en gramos. 1 mol = Peso moleclar gramo o GFW (o GMW) 2. Ejemplos: 1 mol NaOH = 40 g NaOH 1 mol Na2C 0 3 = 106 g Na2C 0 3 3. Milimol (mmol) a. Definición: 1/1.000 de un mol b. Ejemplos: 1 mol NaOH = 40 g; 1 mmol = 0,04 g 1 mol Na2C 0 3 = 106 g; 1 mmol = 0,106 g

MOLARIDAD (M)_______________________________________________________________ 1. También denominada solución molar. 2. Definición: cantidad de pesos molecular gramo (GFW) de un compuesto por litro de solución fi nal o cantidad de moles por litro de solución final o cantidad de moles de soluto por decímetro cú bico de solución (1 d n r 3). 3. Dos fórmulas básicas a. Fórmula 1 (1) Objetivo: determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solu ción de una molaridad y un volumen deseados. .. .

(2)

(Peso m o le c u la r) (M o la rid a d deseada) (V o lu m e n fin a l en m L )

Gramos de reactivo = —------------------ —-----------------------—---------------------------— 1.000

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 769 b. Fórmula 2 (1) Objetivo: determinación de la cantidad de mililitros de un reactivo concentrado p/p re querida para preparar una solución de una molaridad y un volumen deseados. (2) Mililitros de reactivo concentrado para usar = (Peso molecular) (Molaridad deseada) (Volumen final en mL) (Ult. col., Cuadro 6-1) " LÓOO c. Ejemplos: (1) NaCl: Peso molecular gramo = 58,5g = GFW 1 M = 58,5 g/L de solución. «O

0,5 M = — j — = 29,25 g/L de solución. 3 M = 3 x 58,5 = 175,5 g/L de solución. (2) Preparar 1 L de HC1 2 M a partir del ácido concentrado. 36,5 g x 2 x 1.000 mL x 2,3 mL Tj - j j ------- ----------------------------------= 167,9 mL de acido concentrado 1.000 mL x 1 g 4. Fórmulas alternativas Moles de soluto a. M=Litros de solución

jyj _

gramos de soluto ^ 1 GFW Litros de solución

Moles de soluto = Molaridad x Litros de solución

Gramos de soluto = Molaridad x GFW x Litros de solución

Modos alternativos para expresar una molaridad particular a. 0,5 M = 1/2 M o M/2 b. 0,2 M = 1/5 M o M/5

Cuadro 6-2. Valencias positivas de los elementos utilizados con más frecuencia en la preparación de medios 1+

Cu (cuproso) H Hg (mercurioso) K Li Na NH4 (amonio) TI (talioso)

Ba Ca Cd Cu (cúprico) Fe (ferroso) Hg (mercúrico) Mg Mn Zn

PESO EQUIVALENTE GRAMO

(GRAM EQUIVALENT WEIGHT GEW j

Bi Fe (férrico) Mn

1. Definición: peso en gramos de un elemento que podría liberar, combinarse o reemplazar, de mane ra directa o indirecta, 1 g de átomos de hidrógeno. 2. Fórmula (véase también cuadro 6-2) ________GFW GEW = ■ Valencias de iones positivos 3. Ejemplos: GFW

GEW 36,5 — = 36,5 g 1

HC1

36,5 g

H2so4

98 g

98 - = 49 g 2

h 3p o 4

98 g

98 - = 32,7 g 3

770

Apéndices

Peso equivalente miligramo = 1/1.000 de un GEW

NORMALIDAD (SOLUCIÓN NORMAL) (N) 1. Definición: cantidad de pesos equivalentes gramo (o GEW) por litro de solución o la cantidad de miliequivalentes por mililitro o fracción de peso equivalente de un soluto disuelto por decímetro cúbico (1 dm *3) de solución. 2. Dos fórmulas básicas a. Fórmula 1 (1) Objetivo: determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solu

ción de una normalidad y un volumen deseados. (2)

Gramos requeridos =

(Peso molecular) (Normalidad deseada) (Volumen final en mL) (Valencia positiva total) (1.000) o (GEW) (N deseada) (Volumen final en mL) L000

(3) Ejemplo: preparar 250 mL de una solución 2 N de sulfato de magnesio (M gS 04) (a) Peso molecular = 120 g; GEW = 120 / 2 = 60 g (b) Gramos requeridos =

60 g x 2 N x 250 mL 1.000 mL

= 30g

b. Fórmula 2 (1) Objetivo: determinación de la cantidad de mililitros de un reactivo concentrado p/p re

querida para preparar una solución de una normalidad y un volumen deseados. (2) Mililitros requeridos del reactivo concentrado = (Peso molecular) (Normalidad deseada) (Volumen final en mL) (Últ. col., Cuadro 6-1) (Valencia positiva total) (1.000) O (GEW) (N deseada) (Volumen final en mL) (mL equiv. por gramo) L00Ó (3) Ejemplo: preparar 1 L de H2S 0 4 2 N a partir del ácido concentrado (a) Peso m olecular = 98 g; GEW = 98 / 2 = 49 g (b) Mililitros requeridos =

98 g x 2 x 1,000 mL x 0,57 mL = 55,9 mL 1.000 mL x 1 g

3. Fórmulas alternativas a.

GEW de soluto Litros de solución

gramos de soluto GFW/valencia

Moles Valencia

e. f. 4.

1 Litros de solución

Litros de solución

1 gramos de soluto xGEW " Litros de solución N = GEW / Litros de solución N = Molaridad x Valencia positiva total

Modos alternativos para expresar una normalidad particular a. 0,1 N = 1 /lO N o N /lO . b. 0,67 N = 2/3 N o 2 N / 3

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 771 DILUCIONES DE UNA SOLUCIÓN STOCK 1. Objetivo: determinación de los mililitros de una solución stock concentrada requeridos para pre parar una solución más diluida. 2. Fórmula; todas las unidades deben ser iguales (p. ej., % a partir de ‘sL normal a partir de üna solu ción normal, etc.). Mililitros de solución stock concentrada a ser diluida = (Mililitros diluidos de la solución deseada) (Concentración deseada de solución) Concentración de solución stock 3.

Ejemplo a. HCI, solución stock 1 N; se desean 100 mL de una solución 0,1 N 100 mL x 0,1 N 1N

10 mL

b. Agregar 10 mL de H C 11 N en un recipiente graduado y llevar a 100 mL con agua destilada.

TITULACIÓN 1. Definición: método para determinar la concentración de una solución por comparación con un vo lumen medido de una solución de concentración conocida (una solución estándar). a. Cantidad de iones hidronio (H+) que reaccionarán con iones hidroxilo (OH-) con la formación resultante de una sal y agua. b. Los iones H+ reaccionan con los iones OH- en una relación molar 1:1. Un volumen de una so lución 1 N de cualquier ácido reaccionará completamente con un volumen de una solución 1 N de cualquier base o viceversa. c. Punto de equivalencia: punto en el cual todos los iones H+ (o iones OH ) disponibles son neu tralizados. (1) Neutralización: punto de equivalencia de la titulación (punto final) evidente por el uso de un indicador de pH específico. (2) Indicador: índice del punto final de la reacción evidente por un cambio de color; el cam bio de color depende del indicador empleado. 2. Objetivo: determinar la normalidad exacta de un ácido o de una base. 3. Indicadores: la elección depende de la solución a ser titulada. Véase Colorantes e indicadores pa ra su preparación.

Ejemplos

Combinación ácido/base

H C I, H 2S 0 4/N a 0 H , K O H /N H 4O H

Á cid o fuerte/b ase fuerte Á cido fuerte/b ase débil

/N a 2C 0 3

Á cido fuerte/sal b á sica Á cido déb il/ b ase fuerte S a l ácid a / b ase fuerte

C H 3C O O H /

Ftalato ácido de K /

Indicadores R ojo fenol N a ran ja de metilo123 Rojo de metilo N a ran ja de metilo3 Rojo de metilo Fen olftaleín ab Fen olftaleín ab

a No utilizar con buffers ftalato. b S e aclara en álcali fuerte.

Cálculos a. Objetivo: determinación de la normalidad exacta de un ácido o de una base después de la titu lación. b. Fórmula: (Volumen del ácido)(Normalidad del ácido) = (Volumen de la base)(Normalidad de la base) (V!) (Nj) = (V2) (N2) c. Ejemplo: determinar la normalidad de NaOH 0,5 N preparado; 18,3 mL de este NaOH 0,5 N neutralizó 10 mL de HCI 1 N. (1) Paso 1:

10 x 1= 18,3 x N

772

Apéndices N=

10 x 1 = 0,55 N 18,3

Paso 2: NaOH demasiado concentrado; diluir utilizando la fórmula de dilución Mililitros de la solución stock concentrada a ser diluida = (Mililitros de la solución diluida deseada) (Concentración de la solución diluida) Concentración de la solución stock 1.000 m L x 0,5 = 909 mL 0,55 = 909 mL de NaOH 0,55 N diluido a 1 L con agua desionizada DILUCIONES DE ÁCIDOS O ÁLCALIS CONCENTRADOS______________________________ {Nota\ los ácidos y álcalis concentrados son extremadamente cáusticos, de modo que es necesario evi tar la exposición de la piel ya que pueden producirse quemaduras dolorosas. Si ocurren salpicaduras, la var la zona de inmediato con abundante agua de la canilla.) 1. Acido clorhídrico (HC1), concentrado: Reactivo de grado (R. G.); equivale a 12,1 N o 37% peso/volumen a. Preparación (1) Preparar en un recipiente graduado de 100 mL o 1 L; agregar lentamente el ácido a un pequeño volumen de agua destilada. No agregar agua al ácido, ya que pueden ocurrir salpi caduras. ( 2 ) Lentamente llevar al volumen total deseado con agua destilada. b. Concentraciones (1)

Normalidad deseada (N) 2 N 1N

Mililitros de ácido concentrado por 100 mL por 1 L 16,8 mL 8,4 mL

167,9 mL 84 mL

(2) 0,1 N: Dos maneras de preparación (a) 8,4 mL de HC1 concentrado/1 L; 0,8 mL/100 mL de agua destilada. (b) lOOmL de H C 11 N llevado a 1 L

lOmL de H C 11 N llevado a 100 mL con agua destilada.

{Nota: conservar todos los ácidos y álcalis en una botella para reactivos de vidrio recubierta de polietileno de parafina. Rotular con el nombre, la normalidad exacta, la fecha de preparación y las iniciales del preparador.) 2. Hidróxido de sodio (NaOH), concentrado: reactivo de grado (R. G.) y exento de carbonato a. Preparación (1) Pesar con rapidez NaOH y disolver en menos de 100 mL de agua destilada en un vaso de precipitación. Este reactivo es altamente higroscópico; evitar la exposición al aire no más de lo necesario. (2) Colocar el recipiente en un baño de agua circulante para controlar la temperatura; se gene ra gran cantidad de calor. (3) Enfriar y transferir la solución de NaOH a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua destilada.

b. Concentraciones

Normalidad deseada (N) 10 N 9N 1 N (o 1 M) 0,1 N N/15 (0,067) N/20 (0,05)

% de concentración 40 36 4 0,4 0,67 0,5

Mililitros de álcali concentrado por 100 mL por 1 L 40 400 36 360 4 40 0,4 4 0,67 6,7 0,5 5

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 773 BUFFERS 1. ACES: ácido /V-(2-acetamido)-2-aminoetano sulfónico, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)-aminoetano sulfónico.

2. Fosfato dipotásico, 1 M K2HP04 Agua destilada

174 g 1.000 m L

3. HC1-KCI, 0,2 M: lavado ácido; pretratamiento de las muestras de agua a. Solución A: KC1, 0,2 M: 14,9 g/L de agua destilada. b. Solución B: HC1, 0,2 M: 16,8 mL de ácido concentrado, llevar a 1.000 mL con agua destilada. c. Buffer; 50 mL de solución A y Cantidad deseada de una solución B de acuerdo con el pH de seado; volumen final 200 mL. Solución B (mL) 97,0 78,0 64,5 51,0 41,5 33,.3 26,3 20,6 16,.6 13,2 10,6 8,4 6,7 4.

pH final 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2

Fosfato m onopotásico, 1 M k h 2p o 4 Agua destilada

136 g 1.000 m L

5. Buffer fosfato, M/45 (0,02 M) Fosfato monopotásico, KH2P 04 Fosfato disódico, Na2HP04 Agua destilada

U7 g 4,85 g 1.000 mL

6. Bicarbonato de sodio, 1,4% NaHC03 Agua destilada

14 g 1.000 mL

7. Carbonato de sodio, 2 N Na2C 03 Agua destilada

106 g 1.000 mL

8. Carbonato de sodio, 0,1 N Na2C 03 Agua destilada 9.

5,3 g 1.000 mL

Buffer fosfato de Sorensen de diferente pH. a. Solución A: fosfato disódico, M/15 (0,067 M); Na2HP04, 9,47 g/L de agua destilada; sal anhi dra previamente desecada a 130°C. b. Solución B: fosfato de potasio, M/15 (0,067 M); KH2P 0 4, 9,07 g/L de agua destilada; sal an hidra previamente desecada a 110°C. c. Combinar las soluciones A y B; las cantidades dependen del pH deseado.

774

Apéndices Solución A (mL) Na2HP04 3 5 7,8 12 18,5 26,5 37,5 50 61,1 71,5 80,4 86,8 91,4 94,5

5,4 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8

Solución B (mL) kh 2p o 4 97 95 92,2 88 81,5 73,5 62,5 50 38,9 28,5 19,6 13,2 8,6 5,5

COLORANTES E INDICADORES 1. Diluyente alcohólico, etanol a. Stock: etanol (alcohol etílico), C2H5OH, 95% b. Cálculo de la dilución: = % Requerido % Stock c.

x Volumen requerido

Ejemplo: preparar 100 mL de una solución al 40% 40% _ 95% ="

x 100 mL

40 x 100 mL = 42,1 mL de etanol al 95% llevado a 100 mL con agua destilada 95

{Note: en todas las preparaciones alcohólicas o acuosas de colorantes e indicadores, disolver el colo rante en etanol, luego agregar agua desionizada.) 2. Púrpura de bromocresol (BCP) o azul de bromotimol (BTB) en solución alcohólica a. BCP: dibromo-o-cresol sulfonftaleína, C2iHig05SBr2 b. BTB: dibromotimol sulfonftaleína, C27H280 5SBr2 c. Ingredientes (1) Concentración: 0,04% Colorante de elección Etanol, 95% o porcentaje deseado Agua desionizada

0,04 g 500 mL 500 mL

(2) Concentración: 0,04%; 0,04 g/100 mL de diluyente etanol/agua. 3. Naranja de metilo, 0,1% a. Objetivo: indicador para titulaciones ácido-base. b. Ingredientes Naranja de metilo, C^H^NjC^Sna Agua desionizada

0,1 g 100 mL

c. Acido, naranja-rojo; alcalino, amarillo. 4. Rojo de metilo, 0,2% a. Objetivo: indicador para titulaciones ácido-base. b. Ingredientes Rojo de metilo, C i5H15N30 2 Etanol, 95% c.

0 .2 g

100 mL

Ácido, rojo; alcalino, amarillo.

Fenolftaleína, 1% a. Objetivo: indicador para titulaciones ácido-base. b. Ingredientes Fenolftaleína, C,nH ,,0 , Etanol, 95%

1g 100 mL

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 775 c. Ácido, incoloro; alcalino, rojo. d. Precaución: siempre titular la solución alcalina proveniente de una bureta en la solución ácida; no a la inversa.

Rojo fenol, 0,01 y 0,2% a. Objetivo: indicador para titulaciones ácido-base. b. Ingredientes Rojo fenol, C19 H140 5S 0 ,0 1 % 0 ,2 % Etanol, 95% Agua desionizada c.

g 0,2 g 500 mL 500 mL 0 ,0 1

Ácido, amarillo; alcalino, rojo.

Indicador de tornasol a. Ingredientes Tornasol, granular Etanol, 40%

250 g 1.000 mL

b. Preparación, solución de tornasol (1) (2) (3) (4) (5) (6)

Moler el tornasol a un polvo fino. E n un recipiente de 2 L, agregar 500 mL de etanol al 40% y el polvo de tornasol. Hervir durante 1 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante (líquido) en otro recipiente de 2 L. Agregar los 500 mL restantes de etanol al 40% al residuo en el recipiente inicial. Hervir de nuevo durante 1 min. (7) Decantar cuidadosamente el sobrenadante en el recipiente que contiene la primera por ción de 500 mL del líquido hervido. (8) Centrifugar el sobrenadante (líquido) y decantar en una probeta graduada de 1 L. (9) Centrifugar el volumen llevado a 1 L con etanol al 40%. (10) Gota a gota, agregar HC1 (ácido clorhídrico) 1 N hasta que la solución se tom e de color

púrpura. c. Comprobación control de la reacción de tornasol (1) Hervir 10 mL de agua desionizada y enfriar. (2) Agregar 1 gota de solución de tornasol y mezclar bien. (3) Si está preparada de manera apropiada, el agua se tom a de color malva. La concentración del indicador de tornasol indicador es de alrededor del 2,5%.

ENRIQUECIMIENTOS 1. Factor V: reemplaza el autolisado de levadura y el dializado de levadura. a. Preparaciones comerciales (1) IsoVitaleX (IVX) (BBL), Supplement VX (Difeo) y Thayer-Martin Supplement II (Suple mento II del medio de Thayer M artin (Merck)) (2) Componentes (véase cuadro 6-3) 2. Suplemento G C (Oxoid) con V CN T o sin ellas Fracciones de levaduras Glucosa (dextrosa) Bicarbonato de sodio, NaHC03

5g 0,75 g 0,075 g

Aditivos opcionales Vancomicina (V) Colistina (C) Nistatina (N) Trimetoprima (T)

1.500 |lg 3.750 pg 6.250 unidades 2.500 |lg

776

Apéndices

Cuadro 6-3. Componentes del factor V comercial Bio-X/CVA'so Vitale X / T-M Supplement II Componente

Sulfato de adenina Ácido p-amlnobenzoicoa Cocarboxilasab L-CIsteína • HCI • H2G L-Cisteína • 2HCI Dlfosfoplrldlna nucleótldo (DPN) (oxidado)0 Glucosa (dextrosa) L-Glutamina G uanina. HCI Nitrato de hierro (lll)d Citrato de hierro (lll)e T iam ina. HCI (B-,)* Vitamina B 12 (cianocobalamina) Agua desionizada

Suplemento VX

(mg)

0,13

0,013

0,26

0,1

259

25,9

259

1,1

1 1 .0

2,5 1 100

0,03

0 ,2

0 ,0 2

0,03

0,003

0,1

100 10

0,3

1.000 mL

3,5

0,25

200

0,3 0,3 0,06 0 ,2

0 ,0 1

1.000 mL

a PABA; NH2C6H4COOH. b Pirofosfato de tiamina, C 12H19CIN40 7P2S • H20. c Coenzima I. « Fe(N03)3 • 9H20. e FeC6H50 7« 5H20. fC i 2H17CIN4OS; 3 (4-amino-2-metil-pirimidil-5-metil)-4-metil-5 o cloruro de p-hidroxietiltiazolio.

Suplemento Kellogg L-Glutamina Solución de cocarboxilasa (pirofosfato de tiamina) 0,2% Nitrato de merro (III), Fe(N03)3 • 9H20 Agua desionizada

1 mL 83,47 mg 100 mL

4. Suplemento definido Lankford (GCB-2DS) Glucosa (dextrosa) L-Glutamina, 0,25% Cocarboxilasa, 0,0001%a 0 , 2% Nitrato de hierro (III), Fe(N03)3 • 9H20 Agua desionizada

Original 20 g 0,5 g 0,001 g

Modificado 40 g 1g

1 mL 83,47 mg

100 mL

a Puede ser mencionada como pirofosfato de tiamina. 5. Enriquecimiento de Fildes; por lo común agregado como 25-50 mL/L de base Pepsina Cloruro de sodio, NaCl Ácido clorhídrico, HC1, concentrado Hidróxido de sodio, NaOH

6,33 g 8,11 g 38 mL 19 g

Después de la esterilización, agregar Sangre de oveja, estéril, desfibrinada

318 mL

Suplemento OADC de Middlebrook Ácido oleico Fracción V de albúmina bovina Glucosa (dextrosa) Catalasa bovina Cloruro de sodio, NaCl Agua desionizada

0,5 g 50 g 20 g 0,04 g 8,5 g

0,05 mg 5mg 2mg 0,004 mg 0,85 mg

1.000 mL

100mL

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 777 OTROS REACTIVOS 1. Ácido acético 5 N (30%); CH3COOH; 28,8 g/100 mL de agua desionizada. 2. Suspensión de yema de huevo a. Remojar huevos frescos, crudos, enteros, durante 1 min en una dilución 1:100 de una solución saturada de cloruro mercúrico (HgCl2). b. De manera aséptica, cascar los huevos y separar las yemas de las claras. c. Colocar las yemas en una batidora y mezclar 5 seg con la cantidad requerida de solución fisio lógica estéril (NaCl, 0,85%).

3. Cloruro férrico, 8 y 10% Cloruro férrico, FeCl3 8% 10% Agua desionizada

8g 10 g 100 mL

Yodo de Gram a. Ingredientes Yodo, I2 Yoduro de potasio, KI Solución de bicarbonato de sodio, 5%, NaHCOj (5 g/100 mL de agua desionizada) Agua desionizada

1g 2g 60 mL 240 mL

b. Preparación (1) M oler el I2 y el KI en un mortero. (2) Disolver en 5 mL de agua desionizada; luego llevar a 240 mL con agua desionizada. (3) Agregar solución de N aH C 03, 60 mL. c. Precaución: conservar en una botella oscura (ámbar). La solución es amarillo castaña; descar tar cuando pierde el color. 5. Solución stock d e hem ina, 5 ja:: 'm L Hemina, Cj^jF^CLj^FeCl Hidróxido de sodio, 1 N, NaOH Agua desionizada, llevar a

0,5 g 10 mL 100 mL

6. Reactivo de Kovacs a. Objetivo: reactivo para la prueba de indol. b. Ingredientes Alcohol amilico o isoamílico puro 150 mL (puede sustituirse por alcohol butílico) p-Dimetilaminobenzaldehído; C. R. 10 g 50 mL Acido clorhídrico, HC1, concentrado c. Preparación (1) Disolver el aldehido en el alcohol. (2) Agregar lentamente el ácido a la mezcla aldehido-alcohol. 7. Reactivos Nadi, 1 %: reactivo de indofenol oxidasa; dicloruro de N ,N ,N ’,AT-tetrametil-p-fenilenodi-amonio. a. Reactivo A: a-naftol (C10H7OH, 1-naftol, 1-hidroxinaftaleno) al 1% en etanol al 95%. b. Reactivo B: clorhidrato u oxalato de p-ami nometil al anina al 1%; (CH3)2NC6H4NH2*HC1; tam bién denominado oxalato de dimetil-p-fenilendiamina. c. Origen de “nadi”: na- del naftol y -di de la diamina.

8. Oxgall versus bilis a. Oxgall, 2% = 10 x concentración de bilis = bilis al 20% b. Oxgall, 1-4% = bilis al 10-40%

9. Hidróxido de potasio, 40% y 0,1 N a. Ingredientes (1) KOH, 40%: 40g/100 mL de agua dcsionizada. (2) KOH, 0,1 N: 0,6 g/100 mL de agua desionizada. b. Preparación

778

Apéndices (1) Pesar con rapidez KOH y disolver en menos de 100 mL de agua desionizada en un vaso de precipitación. Este reactivo es altamente higroscópico; evitar la exposición al aire cuando no sea necesario. (2) Colocar el recipiente en un baño de agua circulante para controlar la temperatura; se gene ra gran cantidad de calor. (3) Enfriar y transferir la solución de KOH a un frasco graduado de 100 mL y llevar a 100 mL con agua desionizada. c. Rotular y conservar en una botella para reactivos de vidrio recubierta de polietileno de parafina. d. Este reactivo es muy cáustico; evitar la exposición de la piel ya que pueden ocurrir quemadu ras dolorosas.

10.

Yoduro de potasio, 0,2% a. Ingredientes Yoduro de potasio, exento de yodo, KI Agua desionizada

2g 100 mL

b. Probar la presencia de yodo con una solución de almidón; el yodo se demuestra por la presen cia de un color azul. Descartar si existe yodo o si aparece un color castaño con el reposo. 1 l.Telurito de potasio, 1%: 1 g de K2TeO3/100 mL de agua desionizada. 12.Solución de Ringer Cloruro de sodio, NaCl Cloruro de potasio, KC1 Cloruro de calcio, CaCl2 • 2H20 Carbonato de sodio, Na2C 03 Agua desionizada

8.5 g 0,2 g 0.2 g 0.01 g 1.000 mL

13. Reactivo de Schiff a. b. c. d.

También denominado reactivo de fucsina-ácido sulfuroso. Indicador de la presencia de un aldehido; incoloro. Los colorantes comerciales pueden se clomro o acetato o /;ara-rosaniIina o una mezcla de los dos. Ingredientes (1) Colorante fucsina básica en solución alcohólica; concentraciones al 1% y al 3%, prepara das de manera separada. (2) Sulfito de sodio, anhidro, Na2S 0 3 • 7H20 : 0,125 g/5 mL de agua desionizada caliente. (3) De manera separada, mezclar 5 mL de sulfito de sodio con 1 mL de cada una de las con centraciones porcentuales alcohólicas del colorante. (4) La solución es de un color rosa débil o color paja sin precipitado visible. 14. Revelador piedra: solución acuosa saturada de sulfato de amonio, (NH4)2S 0 4. 15. Solución de vitamina K,-hemina Hemina NaOH Vitamina K¡ Etanol, 95% Agua desionizada

0,5 g 0,4 g 0,05 g 10mL 1.000 mL

16. Solución stock de vitamina Kj, 10 ug/mL a. Ingredientes Vitamina K¡ (fitonadiona, 2-metil-3-fitil-l, 4-naftoquinona), fitilmenadiona, CH3C10H4O20H39 1,09 g Etanol, absoluto 99mL b. Preparación (1) Pesar la vitamina K3 en un pequeño trozo de papel de aluminio estéril. (2) De manera aséptica, agregar a 99mL de etanol absoluto en un tubo o botella estéril. (3) Proteger de la luz y refrigerar, 2-8°C.

PREPARACIÓN DE SELLADORES (1)_____________________________________________ 1. Vaselina líquida o parafina a. En una botella de 200 mL, agregar 1 mL de agua desionizada a 100 mL de vaselina líquida o parafina.

Apéndice 6-Preparaciones de reactivos 779 b. Esterilización; dos opciones (1) Autoclave: 121°C, 15 Ib, 15 min. (2) Estufa de esterilización: 160-170°C, 1 h. 2. Vaspar; más eficaz ya que no se retrae del vidrio, como lo hace la parafina, y es sólido, de modo que existen menos posibilidades de la difusión de aire. a. Mezcla: 1:1 de vaselina sólida y parafma. b. También a una botella de 100 mL, agregar 50 mL de la mezcla. c. Esterilización: por cada alícuota de 50 mL, esterilizar en la autoclave, 121°C, 15 lb, 1 h. d. Después de la esterilización, colocar en una estufa a 100°C para eliminar el agua atrapada.

REFERENCIAS GENERALES_____________ 1. Branson D. Methods in Clinical Bacteriology. Springfield, IL: Charles C. Thomas. 1972:135. 2. Holum JR. Elements of General and Biological Chemistry, 4th ed. New York: John Wiley & Sons, 1975. 3. Sewart JA. Methods of Media Preparation for the

Biological Sciences. Sprinfield, IL: Charles C. Thomas, 1974. 4. U.S. Army Technical Manual, TM 8-227-6. Laboratory Procedures in Clinical Chemistry and Urinalysis. Washington DC: Department of the Army, January, 1964.

APENDICE

Sinónimos comunes en la terminología de los medios de cultivo

A. Proteína —►proteosa —►peptona —» aminoácidos B. Peptona 1. Derivado proteico (hidrolizado) obtenido por acción enzimática o por hidrólisis ácida (o alcalina). 2. Se dispone de diversas peptonas comerciales. a. Mencionadas en una de las siguientes formas: (1) Nomenclatura de la USP (Farmacopea de los Estados Unidos); por ejemplo, digerido con papaína de la caseína. (2) Nombre comercial; por ejemplo, Soytone (Difeo). (3) Nombre comercial de los ingredientes; por ejemplo, Peptona Soybean. b. Nombres comerciales BBL

Acidicase Peptone Biosate Peptone Gelysate Peptone Myosate Peptone Phytone Peptone Polypeptone Peptone Thiotone Peptone Trypticase Peptone

M étodo de H idrólisis 'Pt oteína

1. Digerido pancreático de caseína, USP 2. Digerido con papaína de harina de soja, USP 3. Digerido péptico de tejidos animales, USP 4. Digerido pancreático de proteosa de gelatina, USP 5. Digerido pancreático de músculo cardíaco, USP 6 . Digerido pancreático de caseína y levadura, autolisado, USP 7. Digerido pancreático de caseína y digerido péptico de tejidos animales, USP

8 . Hidrolizado ácido de caseína, USP

D ifeo

Bacto-Casamino Acids Bacto-Casitone Neopeptone Proteose peptone Proteose peptone No. 3 Bacto-Peptone Bacto-Protone Bacto-Tryptone Bacto-Tryptose Bacto-Soytone

Sinónim os

Casitone (Difeo) Trypticase Peptone (BBL) Tryptone (Difeo) Phytone Peptone (BBL) Soytone (Difeo) Proteose Peptone (Difeo) Thiotone Peptone (BBL) Tryptose (Difeo) Gelysate Peptone (BBL) Peptone (Difeo) Myosate Peptone (BBL) Biosate Peptone (BBL) Tryptose (Difeo) y tiamina Neopeptone (Difeo) Polypeptone (BBL) Proteose peptone No. 3 (Difeo) Acidicase Peptone (BBL)

APÉNDICE

Tamaño estándar de los tubos de prueba para bacteriología

16 m m . - ' 125 m m

Tubo de Kahn, 12 x 75 mm

13m m x100m m

12m m x75m m

APÉNDICE

Conversiones de la temperatura

Temperatura de incubación Temperatura ambiente Punto de ebullición, agua Punto de congelamiento, agua

°C 37° 25° 100° 0o

°F 98,6° 77° 212° 32°

210

200

°F = Fahrenheit °F = (9/5 x °C) + 32 o (1,8 x °C) + 32

190

180

°C = Centígrados o Celsius °C = 5/9 (°F - 32) o 0,555 (°F - 32)

170

160

150

140

:É

130

120

:í

110

lu u

-10

-1 0

-2 0

APÉNDICE • I

ACM

• •f

Colecciones de cultivos: cultivos de referencia

AUSTRALIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS D epa rtm e nt o f M ic ro b io lo g y U n iv e rs ity o f Q ueensland Nahan, B risbane, Queensland, A u s tra lia

AHU

LABORATORY OF CULTURE COLLECTION OF MICROORGANISMS F a cu lty o f A g ric u ltu re H o k k a id o U n iv e rs ity Sapporo, Japón

ATCC

AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION 10801 U n iv e rs ity B ouleva rd Manassas, V A 20110-2209, E U A S o lic itu d de productos y servicios ATCC P.O. B o x 1549 Manassas, V A 20 108-1549, E U A

AUCM AUCNM BKM UCM VKM

ALL-UNION COLLECTION OF MICROORGANISMS D epa rtm e nt o f Type C ultures o f M ic ro o rg a n ism s In s titu te o f B io c h e m is try & P h y s io lo g y o f M icro o rg a n ism s U R SS A cade m y o f Sciences P uschino M o s c o w R egio n 142292, R usia

AUCNM

ALL-UNION COLLECTION OF NON-PATHOGENIC MICROORGANISMS Véase A U C M

CBS

CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES O osterstraat 1 3740 A G B aam , Países B ajos

CCBAU

CULTURE COLLECTION OF BEIJING AGRICULTURAL UNIVERSITY B e ijin g , R e pú blica P o p u la r C hina

CCCCM

CHINA COMMITTEE FOR CULTURE COLLECTION OF MICROORGANISMS In s titu te o f M ic ro b io lo g y A cade m ia S ínica B e ijin g , R epú blica P opu la r C hina

CCM

CZECHOSLOVAK COLLECTIONS OF MICROORGANISMS F. E. P urkyn e U n iv e rs ity o f B rn o Tr. O brancu M ir u 10 66243 B rn o , C hecoslovaquia

784

Apéndices

CCUG

CULTURE COLLECTION, UNIVERSITY OF GOTEBORG D epa rtm e nt o f C lin ic a l B a c te rio lo g y In s titu te o f C lin ic a l B a c te rio lo g y , Im m u n o lo g y , and V iro lo g y G uldhedsgatn 10As-413 46 G oteborg, Suecia

CDC

CENTERS FOR DISEASE CONTROL 1600 C lifto n R oad A tla n ta , G A 30333, E U A

CECT

COLECCIÓN ESPAÑOLA DE CULTIVOS TIPO U n iv e rs ita t de V alencia E d ific io de Inve stigación C am pus de B u rja s o t 46100 B u rja s o t (V alencia), España

CFML

COLLECTION DE LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE LILLE 1 Place de V erdun 59045 L ille Cedex, Frania

CIP

COLLECTION DE L’INSTITUT PASTEUR In s titu t Pasteur 28 R ue du D o c te u r R o u x 75 724 París, Cedex 15, Francia

CNC

CZECHOSLOVAK NATIONAL COLLECTION OF TYPE CULTURES In s titu te o f E p id e m io lo g y and M ic ro b io lo g y Srobarova 48 Prague 10, C hecoslovaquia

CNCMI CNCM

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES In s titu t Pasteur R ue du D o cte u r 75015 París, Francia

CUTEM

COLLECTION DE L’UNITÉD ÉCOTOXICOLOGIE MICROBIENNE In s titu t N a tio n a l de la Santé et de la R echerche M e dícale 59651 V ille n e u v e d ’ A scq, N o rd , Francia

DSM DSMZ

DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN LIND ZELLKULTUREN G m b H , M a schero der W eg IB D -3 8 1 2 4 B rau nschw eig , A le m a n ia

GIEM

GAMALEYA INSTITUTE OF EPIDEMIOLOGY AND MICROBIOLOGY A c a d e m y o f M e d ic a l Sciences M o scow , R usia

HMGB

HUNGARIAN MICROBIOLOGY GENE BANK M ic ro b io lo g ic a l D epa rtm e nt G ro up o f the D epa rtm e nt o f F o od T e chno lo gy and M ic ro b io lo g y o f the U n iv e rs ity o f H o rtic u ltu re 1064 Budapest, Izab ella, H u n g ría

HSCC

CULTURE COLLECTION OF THE RESEARCH LABORATORY OF HIGETA SHOYU CO. 2-8 C huo -cho C hoshi, C h ib a 288, Japón

Apéndice 10 - Colecciones de cultivos: cultivos de referencia 785 IAM

INSTITUTE OF MOLECULAR AND CELLULAR BIOSCIENCES The U n iv e rs ity o f T o k y o Y a y o i, B u n k y o -K u T o k y o ,Japón

IBPHM

DEPARTMENT OF TYPE CULTURES OF MICROORGANISMS In s titu te o f B io c h e m is try and P h y s io lo g y o f M icro o rg a n ism s U R SS A cade m y o f Sciences P ushchino M o s c o w R egio n 142292, R usia

ICPB

PROFESSOR OF BACTERIOLOGY, CURATOR ICPB In te rn a tio n a l C o lle c tio n o f P hytopathogenic B acteria D epa rtm e nt o f B a c te rio lo g y U n iv e rs ity o f C a lifo rn ia D avis, C A 95616, E U A

IFAM

INSTITUT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE U n iv e rs ita t K ie l K ie l, A le m a n ia

IFO

INSTITUTE FOR FERMENTATION 4-54 Jusonischinocho Osaka, Japón

IMET ZIMET

INSTITUTE FOR MICROBIOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPY (ZENTRALINSTITUT FÜR MIKROBIOLOGIE UND EXPERIMENTELLE THERAPIE) Beutenbergrasse 11 Jena 69, A le m a n ia

IMMIB

CULTURE COLLECTION OF THE INSTITUTE OF MEDICAL MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY U n iv e rs ity o f B o n n S ig m u n d -F re u d Str. 25 D -53 105 B onn , A le m a n ia

IMRU

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY R utgers-T he State U n iv e rs ity N e w B ru n s w ic k . N J 08903, E U A

IMSNU

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY Seoul N a tio n a l U n iv e rs ity Seoul 151-742 R e p ú b lic a de Corea

IMV

INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND VIROLOGY A c a d e m y o f Sciences o f the U k ra n ia n 154 Z a b o lo tn y Str. K ie v 143 252143, U cran ia

INMI

INSTITUTE FOR MICROBIOLOGY U S S R A cade m y o f Sciences 7 B ld g 2 P rospekt 6 0 -le tiy a O k tiy a b riy a , M o s c o w G SP-7, 117811, R usia

JCM

JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS R iken, W ako-shi Saitam a 351, Japón

786

Apéndices

KCC

CULTURE COLLECTION OF ACTINOMYCETES K a k e n C h em ical C o., L td . 6-42 J u jo d a i-l-C h o m e T o k y o 114, Japón C o lle c tio n tra nsferred to J C M

KCTC

KOREAN COLLECTION FOR TYPE CULTURES K ore a Research In s titu te o f B iosciences & B io te c h n o lo g y Yusong, Taejon 305-600, Corea

LIA

MUSEUM OF CULTURES L e n in g ra d Research In s titu te o f A n tib io tic s 23 O g o ro d n ik o v Prospect L e n in g ra d L -2 0 , R usia

LMD

LABORATORIUM VOOR MICROBIOLOGIE DER TECHNISCHE HOGESCHOOL D e lft U n iv e rs ity o f Te chno lo gy Julianalaan 6 7 A 2628 B C D e lft, Países B ajos

LMG

COLLECTION OF THE LABORATORIUM VOOR MICROBIOLOGIE EN MICRO BIELE GENETICA R ijk s u n iv e rs ite it Le deganckstraat 35 B -9 0 0 0 , G ent, B é lg ic a

MIM

COLLECTION OF THE CATTEDRA DI MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE U n iv e rs it d e g li S tu d i d i M ila n , Ita lia

MSDJ

CULTURE COLLECTION OF THE LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE DES SOLS In s titu í N a tio n a l de la R echerche A g ro n o m iq u e F -2 1 3 0 4 D ijo n Cedex, Francia

NCFB

NATIONAL COLLECTION OF FOOD BACTERIA A F R C In s titu te o f F o od Research S h in fie ld , R eading B e rk s h ire R G 2 9AT, E nglan d, R e in o U n id o A ntes denom inada N C D O

NCIB NCIMB

NATIONAL COLLECTION OF INDUSTRIAL BACTERIA T o rry Research S tation PO. B o x 31 135 A b b e y R d. A berdeen A B 9 8D G , S cotland, R e in o U n id o

NDDO NCPPB

VÉASE NCFB NATIONAL COLLECTION OF PLANT PATHOGENIC BACTERIA C entral Science L a b o ra to ry M in is tr y o f A g ric u ltu re , Fisheries, and Food Sand H u tto n , Y o rk Y 0 4 1 L N , R e in o U n id o

NCTC

NATIONAL COLLECTION OF TYPE CULTURES C entral P u b lic H e a lth L a b o ra to ry C o llin d a le A venue L o n d o n N W 9 5H T , R e in o U n id o

Apéndice 10 - Colecciones de cultivos: cultivos de referencia NIH

787

NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH Bethesda, M D 20014, E U A

NRC NRCC

NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA CULTURE COLLECTION 100 Sussex D riv e O ttaw a, O n ta rio K I A O R 6, Canadá

NRL

NEISSERIA REFERENCE LABORATORY U S P u b lic H e a lth S ervice H o s p ita l Seattle, W A 98114, E U A

NRRL

NORTHERN REGIONAL RESEARCH CENTER A g ric u ltu re Research C u ltu re C o lle ctio n s N a tio n a l C enter fo r A g ric u ltu re U tiliz a tio n Research U S D epa rtm e nt o f A g ric u ltu re 1815 N o rth U n iv e rs ity Street Peoria, I L 61604, E U A

NTCH

NORTH TECHNICAL HOGSKOLLES COLLECTION D epa rtm e nt o f B io c h e m is try Technical U n iv e rs ity o f N o rw a y T ro n d h e im M T H , N oruega

OGC

OREGON GRADUATE CENTER COLLECTION B eaverton, O R 97006-1992, E U A

PDDCC ICMP

CULTURE COLLECTION OF PLANT DISEASES DIVISION N ew Z ealand D epa rtm e nt o f S c ie n tific and In d u s tria l Research Landcare Research P rivate B ag 92170. A u c k la n d , N ueva Zelanda

RML

NATIONAL INSTITUTE OF ALLERGY AND INFECTIOUS DISEASES R o c k y M o u n ta in Laboratories C o lle c tio n H a m ilto n . M T 59840, E U A

SABAM MRCCC

SOUTH AMERICAN BIOTECHNOLOGY AND APPLIED MICROBIOLOGY, C entro de C ole c c ió n de C u ltiv o s para Recursos M ic ro b io ló g ic o s , B io te cn o lo g ía y M ic ro b io lo g ía A p lic a d a de S udam érica (U n ite d N ation s E duca tiona l, S c ie n tific , and C u ltu ra l O rg anizatio n) Tucum án, A rg e n tin a

TPH

MICROBIOLOGICAL CULTURE COLLECTION P u b lic H e a lth L a b o ra to ry O n ta rio D epa rtm e nt o f H e a lth T o ron to 116, Canadá

UCM UQM

VÉASE AUCM CULTURE COLLECTION D epa rtm e nt o f M ic ro b io lo g y U n iv e rs ity o f Queensland St. L u c ia , Queensland 4067, A u s tra lia

UWO

UNIVERSITY OF WESTERN ONTARIO CULTURE COLLECTION U n iv e rs ity o f W estern O ntario L o n d o n , O n ta rio N 6 A 587, Canadá

VKM

VÉASE AUCM

788 VPB

Apéndices VETERINARY PATHOLOGY AND BACTERIOLOGY COLLECTION U n iv e rs ity o f Sydney N e w S outh W ales 2006, A u s tra lia

VIP

ANAEROBE LABORATORY P o lyte ch n ic In s titu te and State U n iv e rs ity B lacksburg, V A 24061, E U A

QUEENSLAND WHEAT RESEARCH INSTITUTE 13 H o lb e rto n Street, Toow ocm ba Queensland, A u s tra lia

WVB

WUHAN INSTITUTE OF VIROLOGY A cade m ia S iniea W uhan, H ubei R e pú blica P opu la r C hina

WVU

WEST VIRGINIA UNIVERSITY D epa rtm e nt o f M ic ro b io lo g y M e d ic a l C enter M o rg a n to w n , W V 26506, E U A

APÉNDICE

Direcciones de proveedores comerciales

F ab ricante

Productos

ABBOTT LABORATORIES 100 Abbott Park Road Chicago, IL 60064-3500, USA Tel. 847-937-6100 Fax: 837-938-6255 Web: www.abbottdiagnostics.com/

ACCUMED INTERNATIONAL, INC. 920 North Franklin Suite 402 Chicago, IL 60610, USA Tel: 312-642-9200 WEB: accumed.com

Cx Neisseria gonorrhoeae assay (Ensayo Cx para Neisseria gonorrhoeae) TestPack Plus Strep A TestPack Plus Strep A C O B C II

Sensititre Gram-Negative audio identification sys tem (Sistem a de audioidentificación para gram negativos con títulos sensibles)

Imberhome Lane East Grinstead West Sussex, England RH19 1QX Tel. +44 (0)1342 318777 Fax: +44 (0) 1342 318666 E-mail: Accumed UK

ALDRICH CHEMICAL CO., INC.: VÉASE SIGMA-ALDRICH

(¿-Dimcthylaminocinnamaldchyde (DMACA) (¿/-di rnetilci namaldehído (DMACA))

ALLIED CHEMICAL CORP. 2217 N icollet Avenue South Minneapolis, M N 55404, USA Tel.: 612-874-2400 Fax: 612-874-2430 E-mail: hamspread@ alliedchemical.com WEB: www.alliedchemical.com/mail/ P.O. Box 333 Brighton BN1 2EH United Kingdom P.O. Box 326 Spit Junction NSW 2088 Australia

Toluidine blue O (TBO) dye (Colorante azul de toluidina O: TBO) Rhodamine B dye (Colorante rodamina B)

790

Apéndices

AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION (ATCC) 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110-2209, USA

Colecciones de cultivos: cultivos de referencia

Indoxyl acetate disks (Discos de acetato de indoxilo)

Products and Service Orders P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108-1549, USA AMES COMPANY 430 S. Beiger Street Mishawaka, IN 46544, USA Tel: 219-255-3327 ANALYTAB PRODUCTS, INC. P.O. Box 845 Belmont, CA 94002, USA Tel: 415-592-1400 BALLARD MEDICAL PRODUCTS 12050 Lone Peak Parkway Draper, Utah 84020-9414, USA Tel: 801-572-6800 Tel.: 800-528-5591 Orders Fax: 801-572-6999 E-mail: [emailprotected] Web: www.bmed.com/contact.html

Clinitest tablets (Comprimidos de prueba clínica)

Rapid NFT (NFT rápida)

Pytest urea breath test (Prueba de urea en la rés:-: piración)

BAXTER MICROSCAN: Véase DADE/MICROSCAN, INC. One Baxter Parkway Deerfield, IL 60015-4633, USA Tel: 708-948-2000 Web: www.baxter.com/ BAYER CORPORATION Bayer Diagnostics 511 Benedict Avenue Tarrytown, NY 10591-5097, USA Tel: 914-631-8000 Web: www.bayerus.com/products/medical.html

Trasylol (aprotinina)

BD BIOSCIENCES (Antes BECTON DICKINSON MICROBIOLOGY SYSTEMS) BBL Crystal Anaerobe (ANR) ID Panel (Panel 7 Loveton Circle para la identificación de anaerobios) Sparks, MID 21152, USA BBL Crystal Enteric/Nonfermenter (E/NF) ID Tel: 410-316-4000 panel (Panel para la identificación de microor Web: www.bd.com/microbiology ganismos entéricos/no termentadores) BBL Crystal MRSA ID panel (Panel para la identificación de MRSA) BBL Crystal Neisseria/Haemophilus ID panel (Panel para la identificación de Neisseria/ Haemophilus) BBL Crystal Rapid Gram-Positive ID panel (Panel para la identificación rápida de grampositivos)

Apéndice 11 - Direcciones de proveedores comerciales

791

BBL Crystal Rapid Stool/Enteric ID panel (Panel para la identificación rápida de bacterias entéricas en las heces) Bacitracin disks (Discos de bacitracina) Campyslide Culturette Directigen Meningitis test Enterotube II tube Furazolidone disks (Discos de furazolidona) Leucine (Leucina) Minitek Anaerobe II Minitek Gram-Positive test Minitek Neisseria Test Pneumoslide test Q test strep kit Sceptor Gram Positive MIC/ID panel Staphyloslide test BEHRINGWERKE AG Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring Str 76 35041 Marburg, Germany Tel: 0 64 21/39-0 Fax: 0 64 21/39-3986 Web: uni-marburg.de/stadt/wifoe/behringb.html BIOLOG INC. 3938 Trust Way Hayward, CA 94545, USA Tel.: 510-785-2564 Fax: 510-782-4639 E-mail: [emailprotected] Web: www.biolog.com BIOMERIEUX, INC. 595 Anglum Road Hazelwood, MI 63042-2320, USA Tel.: 314-731-8500 Fax: 314-731-8700 69280 Marcy l’etoile France Tel.: (33) (0) 4 78 87 20 00 Fax: (33) (0) 4 78 87 20 90 Web: www.biomerieux.com/english El cambio de nombre de bioMerieux Inc. refleja VITEK, VIDAS, BACTOMETER y API

Dipstick PADAC (P-lactamasa)

GN MicroPlate identification system-phasing out GN2 and GP2-newer Rainbow UTI system Rainbow Salmonella Rainbow E. coli 01:57

API 20 A (anaerobios) API 20 E (entéricos) API 20 NE (gramnegativos no entéricos) API Rapid 20 E (entéricos) ATB 32 A API Rapid ID ANA API An-Indent (anaerobios) API Campy API Coryne system API NH system API Staph API 20 Strep API Staph-IDENT API Rapid Strep system API QUAD-FERM (Neisseria, M:Catarrlialis) API-ZYM (acción enzimática) CPS ID 2 Staph ASE Slidex Staph Staphslide Kit Rapid DEC Staph Slidex Strepto Kits (A&B)

792

Apéndices

API 50 CH (hidratos de carbono) Vidas C. difficile toxin A test (Prueba para la toxina A de C. difficile) Vitek Anaerobe Identification (ANI) card (Tarjeta para la identificación de anaerobios) Vitek Enteric pathogen (EPS) card (Tarjeta para la identificación de microorganismos entéricos patógenos) Vitek HNI (Neiss-Ham-Identification) card Vitek Gram-Positive Identification (GPI) (Identificación de grampositivos) Vitek Gram-negative identification (GNI) (Identificación de gramnegativos) BIO-RAD LABORATORIES, INC. Diagnostic Group 4000 Alfred Nobel Drive Hercules, CA 94547, USA Tel.: 510-724-7000 Tel: 800-224-6723 Fax: 510-741-6373 Web: www.bio-rad.com BIOSTAR, INC. 6655 Lookout Road Boulder, CO 80301, USA Tel: 303-530-3888 Tel: 800-637-3717 Fax: 303-530-6601 Web: www.biostar.com BIO WHITTAKER A Cambrex Company 8830 Biggs Ford Road Walkersville, MD 21793, USA Tel.: 301-898-7025 Tel.: 800-654-4452 Fax: 301-845-8338 Web: www.biowhittaker.com/aboutbio.html BRISTOL-MYERS SQUIBB CO. (BMS) 225 High Ridge Road Stamford, CT 06905, USA Web: www.bms.com BUTYLASE LAB M CO. England

CALBIOCHEM-NOVIABIOCHEM CORP. P.O. Box 12087 La Jolla, CA 92039-2087, USA Tel.: 800-854-3417 Fax: 800-776-0999 Web: www.calbiochem.com

G.A.P. kit (Equipo G.A.P.)

Strep A OIA (inmunoensayo óptico) Strep B CIA

PYLORI SLAT EIA

K a n a m y c in ( K a n a m ic in a )

Indoxyl butyrate strips (Tiras reactivas de butirato de indoxilo)

o-Nitrophenyl-(3-D-galactoside ( o - n i tr o p h e n y l- p - D - g a la c to p y r a n o s id e ) (oNitrofenil-(3- D-galactósido; o-nitrofenil-(3-

g a la c t o p i r a n ó s id o )

PADAC (pyridine-1-azo-dimethylaniline) (piridina-1-azo-dimetilanilina)

Apéndice 11 - Direcciones de proveedores comerciales

793

Cephalosporin powder (P-lactamasa) (Cefalosporina en polvo) CAMBRIDGE BIOTECH England CARLO ERBA REAGENTI Strada Rivoltana Km. 6/7 20090 Rodano (Milan), Italy Tel: 02.9523.1 Fax: 02.9523.5940 Web: www.carloerbareagenti.com/worldwide.html CENTERS FOR DISEASE CONTROL (CDC) 1600 Clifton Road Atlanta, GA 30333, USA Tel.: 404-639-3311 E-mail: [emailprotected] Web: www.cdc.gov CIBA-GEIGY AG CIBA SPECIALTY CHEMICALS INC. Klybeckstrasse 141 CH-4002 Basel, Switzerland Tel: +41 61 636 1111 E-mail: [emailprotected] Web: www.cibase.com

Cytoclone A&B (EIA) para C. difficile

Methyl green (MG) dye (Colorante verde de metilo)

Indoxyl acetate disks (Discos de acetato de indoxilo)

Desferrioxamine (Desferal) disks (Discos de desferrioxamina (Desferal))

556 Morris Avenue Summit, NJ 07901, USA Tel.: 201-277-5000 DADE/MICROSCAN INS. (DADE INTERNATIONAL) DADE BEHRING 1584 Enterprise Boulevard West Sacramento, CA 95691, USA Tel: 800-677-7226 ext. 2110 Fax: 916-372-9762 E-mail: [emailprotected] Web: www.dademicroscan.com

DELTA WEST. LTD.: Véase PHARMACIA & UPJOHN West Australia DIAGNOSTICS PRODUCTS CORP. (DPC) Attn: Customer Service Department 5700 West 96th Street Los Angeles, CA 90045-5597, USA Tel.: 310-645-8200 Fax: 310-645-9999 Fax: 800-234-4372 Orders E-mail: [emailprotected] Web: www.dpcweb.com

Haem-Neiss Identification (HNID) panel (Panel para identificación Haem-Neiss (HNID)) MicroScan Pos ID panel MicroScan Rapid Pos Combo panel MicroScan Walkaway Auto SCAN-W/A Rapid Anaerobic Identification system (Sistema para la identificación rápida de anaerobios) Rapid Gram-Neg ID type 2 Rapid Gram-Neg ID type 3 Staphlatex CLO Strip test

Patho DX Tests (Strep A, Strep D. and Strep PYR)

794

Apéndices

DIFCO LABORATORIES Division of BID Biosciences 7 Loveton Circle Sparks, MID 21152-0999, USA Web: www.difco.com/ EASTMAN CHEMICAL COMPANY 100 North Eastman Road RO. Box 431 Kingsport, TN 37662-5075, USA Tel: 800-327-8626 Tel: 423-229-2000 Fax: 423-229-1195 E-mail: [emailprotected] Web: www.eastman.com

ENTERIC PRODUCTS INC. (EPI) 25 East Loop Drive Stony Brook, NY 11790-3355, USA Tel: 800-645-6887 Tel: 516-334-1980 Fax: 516-334-0509 Web: www.enteric.com E-Y LABORATORIES 127 N. Amphlett Blvd. San Mateo, CA 94401, USA Tel.: 650-342-3296 FISHER SCIENTIFIC LTD. 50 Fadem Road Springfield, NJ 07081-3193, USA Tel: 973-467-6511 Fax: 973-376-1546 112 Colonnade Road Nepean, Ontario K2E 7L6 Canada Tel: 800-234-7437 Tel.: 613-226-3273 Fax: 800-463-2996 Web: www.fishersci.ca GEN-PROBE, INC. 10210 Genetic Center Drive San Diego, CA 92121-1598, USA Tel.: 619-410-8000 Fax: 619-410-8625 E-mail: [emailprotected] Web: www.gen-probe.com/tech.html GLAXO WELLCOME UK LTD. Stockley Park West Uxbridge Middlesex UB11 1BT

Methyl green (MG) dye (Colorante verde de metilo) MUG plus Soluble starch (Almidón soluble)

Acridine orange (AO) dye (Colorante naranja de acridina) p-Dimethylaminobenzaldehyde (DMABA) (pDimetilaminobenzaldehido) /V, ,V-d irnethy 1-a-naphthy 1am inc (/V,/V-dimetil-anaftilamina) Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TPD) (clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) Placas radiográficas

HM-CAPELIA (HM CAP)

Gonochek II

Tubos de vidrio borosilicato Linter starch (Almidón de residuos de algodón) Methyl green (MG) dye (Colorante verde de metilo) Toluidine blue O (TBO) dye (Colorante azul de toluidina O (TBO))

AccuProbe Group A Streptococcus direct test (GASD) (Prueba directa para Streptococcus grupo A) PACE systems (PACE 2 and PACE 2C systems) (Sistemas PACE (PACE 2 y PACE 2Q )

Nitrocefin (Nitrocefina (p-lactamasa)) Chromogenic cephalosporin 87/312 (Cefalosporina cromogénica 87/312)

Apéndice 11 - Direcciones de proveedores comerciales

795

England Tel: (0181)990 9000 Fax: (0181)990 4321 Web: www.glaxowelcome.co.uk/about/world_locations/mn_usa.html GLAXO WELLCOME, INC. Five Moore Drive P.O. Box 13398 Research Triangle Park, NC 27709, USA Tel.: 800-437-0992 Tel.: 919-248-2100 Fax: 919-248-2381 Web: www.glaxowellcome.com/index/htm I.A.F. PRODUCTION, INC. 531 Boulevard des Prairies Ville de Laval Québec H7N 423 Canada Tel.: 450-687-5010 INSTITUI VIRON-SERIO GMBH Kondradstrasse 1 D-97072 Würzburg Germany Tel.: ++49-931-309860 Fax: ++49-931-52650 Web: www.viron-seron.de/index.html KARO-BIO AB Novum S-141 57 Huddinge Sweden Tel: +46 8 608 6000 Fax: +46 8 774 8261 E-mail: [emailprotected] Web: [emailprotected] KEY SCIENTIFIC PRODUCTS 1402-D Chisolm Trail Round Rock, TX 78681, USA Tel.: 800-843-1539 Fax: 512-218-8580 E-mail: [emailprotected]

LIOFILCHEM S.R.L. 20060 Vignate (Mi) Via Sardegna 1 Italy Tel.: 011/39/02/95360323 E-mail: [emailprotected]

Gonobio test (Prueba Gonobio)

Motility kit SSM medium with cefoperazone and trimethoprim (Equipo para movilidad en medio SSM con cefoperazona y trimetoprima)

Phadebact GC OMNI test (Prueba Phadebact GC OMNI) Phadebact H. influenzae type b (Phadebact para H. influenzae del tipo b) Phadebact Pneumococcus (Phadebact para neu mococos)

Fluo-Card Milled Gelatin strips (Tiras reactivas de gelatina; placas radiográficas expuestas a la gelatinasa) Principales sustratos: ONPG, discos de nitrato, comprimidos de gluconato LAP/LAPNA, en discos NGP-Wee, comprimidos Oxidasa, discos y tiras reactivas Staf-Sistem 18-R

796

Apéndices

MALLINCKRODT (JT) BAKER INC. Corporate office 16305 Swingley Ridge Dr. Chesterfield, MO 63017, USA Tel: 314-654-2000

Uranium acetate (Acetato de uranio)

Dirección de correo' P.O. Box 5840 675 McDonnell Boulevard St. Louis, MO 63134, USA Tel: 516-93-78S8 Web: www.mallinckrodt.com Mallinckrodt Laboratory Chemicals Division of Mallinckrodt and Baker, Inc. 222 Red School Lane Phillipsburg, NJ 08865, USA Tel: 800-354-2050 Fax: 908-859-6974 MERCK & COMPANY, INC. PO. Box 100 One Merck Drive Whitehouse Station, NJ 08889-0100, USA Tel: 908-423-6000 Fax: 908-735-1131 Web: www.merck.com

Soluble starch (Almidón soluble)

Merck GAA Frankfurter Str.250 D-64293 Darmstadt Germany Tel.: ++49 61 51-72-0 Fax: ++49 61 51-72-2000 E-mail: [emailprotected] Web: www.merck.com MERETEK 618 Grassmere Park Drive Suite 20 Nashville, TN 37211, USA Tel: 800-945-8252 Tel.: 888-637-3835 Customer Service Tel: 615-333-6336 Fax: 615-333-6202 E-mail: [emailprotected] Web: www.meretek.com/info.htm MERIDIAN DIAGNOSTICS, INC. 3471 River Hills Drive Cincinnati, OH 45244, USA Tel.: 513-271-3700 Tel: 800-343-3858 Tech Support Fax: 513-272-5432 E-mail: [emailprotected] Web: www.meridiandiagnostics.com

MERETEK UBT breath test for H. pylori (Prueba de la respiración MERETEK UBT para H. pylori)

ImmunoCard ImmunoCard Stat Meritec-Campy (jcl) Meritec-GC test Premier Cytoclone A&B Premier EHEC Premier Toxin A

Apéndice 11 - Direcciones de proveedores comerciales

797

MICROBIOLOGICS 217 Osseo Avenue North St. Cloud, MN 56303, USA Tel.: 320-253-1640 Tel.: 800-599-2847 Fax: 320-253-6250 E-mail: [emailprotected] Web: www.microbiologics.com MIDI LABS, INC. 125 Sandy Drive Newark, DE 19713, USA Tel.: 302-737-4297 Tel.: 800-276-8068 Fax: 302-737-7781 Web: www.midilabs.com MILLIPORE CORP Attn: Order Services 80 Ashby Road Bedford, MA 01730, USA Tel.: 781-533-6000 Tel: 800-645-5476 Fax: 781-533-3110 Web: www.millipore.com/local/US.htm MUREX DIAGNOSTICS DIVISION: Véase ABBOTT DIAGNOSTICS DIVISION 3075 Northwood Circle Norcross, GA 30071, USA Tel: 770-662-0666 Tel.: 800-323-9100 Tech Support Fax: 800-382-1574 Web: www.int-murex.com NEW HORIZONS DIAGNOSTICS CORP. 9110 Red Branch Road Columbia, MD 21045, USA Tel: 410-992-9357 ext. 235 o 232 Tel: 800-888-5015 Fax: 410-992-0328 E-mail: [emailprotected] Web: www.nhdiag.com OMEGA DIAGNOSTICS Omega House-Carsebridge Court GB-FK 10 3LQ Alloa-Scotland, Great Britain Tel: ++44 1259-217315 Fax: ++44 1259-72351 OXOID LTD. Wade Road Basingstoke Hampshire, RG24 8PW England T el:+ 4 4 1256 841144 Fax: +44 1256 814626

Lyfo-Kiwi OMI Neisseria-Kiwi test kit (Equipo para la prueba Neisseria-Kiwi)

Francisella tularensis microbial identification (Identificación microbiana de Francisella tularensis) MIS identification system (Sistemas de identifi cación MIS; análisis de ácidos grasos de células enteras por cromatografía gaseosa)

Millipore filters and membranes (Filtros y mem branas Millipore)

Signify Strep A StaphAurex Plus Streptex Wellcogen bacterial antigen kits (Equipos para antígenos bacterianos: Streptococcus del grupo A, H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis y E. coli)

Gono Gen (cromogénico) Gono Gen II

Avistaph

p-Lactamase detection kits (Equipos para la detección de P-lactamasa) MUG supplement (Suplemento MUG) Staphytect Plus Staphylase StrepPlus ONPG disk (Discos para ONPG)

798

Apéndices

E-mail: [emailprotected] Web: oxoid.co.uk/ 800 Proctor Avenue Ogdensburg, NY 13669, USA Tel.: 800-567-8378 Fax: 613-226-3728 PACIFIC BIOTECH COMPANY (PB) Division of Bangkok RIA Bangkok RIA Group 6 Ladprao 110 Ladprao Road Bankapi, Bangkok 10310, Thailand Tel: 662/530-2754060 530-3513-3. 530-4608-9 Fax: 530-2761, 530-4619 E-mail: [emailprotected] o [emailprotected] PHARMACIA & UPJOHN HUVUDKONTOR, SVERIGE PHARMACIA & UPJOHN AB Lindhagenstan 133 112 87 Stockholm Sweden Tel: 08 695 80 00 Web: www.pharmaciaupjohn.se (sueco) Web: www.pnu.com (inglés) POLYSCIENCES INC. 400 Valley Road Warrington, PA 18976, USA Tel: 800-523-2575 Fax: 800-343-3291 Web: www.polysciences.com/ REMEL, INC. P.O. Box 14428 76 Santa Fe Drive Lenexa, KS 66215, USA Tel: 800-255-6730 Tel: 800-447-3635 Orders Tel. internacional: 913-888-0939 Fax: 800-447-5750 Fax internacional: 913-888-5884 E-mail: [emailprotected] Web: www.remelinc.com

Card O.S.

CLO strip test (Prueba CLO con tiras reactivas)

/j-Phenylenediamine dihydrochloride (Diclorhidrato de p-fenilendiamina)

Acridine orange dye (Colorante naranja de acridina) ALA disks (Discos para ALA) Alpha napthol 5% (Alfa naftol al 5%) Anaerobic nitrate A&B reagent (Reactivos A y B de nitratos para anaerobios) An-Indent disks (Discos An-Indent) Bacitracin disk (Discos de bacitracina) BactiCard Neisseria BactiCard Strep Beta-lysin disk (Discos de beta-lisina) Bile disk (Discos de bilis) Catalase spot test (Prueba de la mancha para catalasa) IDS RapID-ANA II IDS RapID CB Plus IDS RapID ONE system (E.coli) IDS RapID NF Plus panel IDS RapID NH system IDS RapID SS/u system IDS RapID STR LAP disk

Apéndice 11 - Direcciones de proveedores comerciales

799

Microdase oxidase disks (Discos Microdase para oxidasa) Micro-ID R/b Enteric Differential system (Sistema de diferenciación entérica R/b) Thermonuclease agar (Agar para termonucleasa) ROCHE DIAGNOSTICS-LABORATORY SYSTEMS P.O. Box 50457 Indianapolis, IN 46250-0446, USA Tel.: 800-428-2336 Tech Service Tel: 800-428-5030 Customer Service Fax: 800-428-2883 E-mail: [emailprotected] Web: www.roche.com

Oxi/Ferm (O/F) system (Sistema O.vFFerm (O/F)) Staph RapID

F. HOFFMAN-LA-ROCHE LTD. CH-4070 Basel, Switzerland Tel.: ++41/61 688 11 11 Fax: ++41/61 691 93 91 Web: www.roche.com/roche/contacts/contacts.htm ROSCO A/S Taastrpgaardsbej 30 2630 Taastrup Denmark Tel.: 45 43 99 33 777 Fax: 45 42 52 73 74 E-mail: [emailprotected] SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR 3 Boulevard Raymond Pouncaré 92430 Marmese-La-Coquette,France Tel.: (1) 47.95.60.00 Fax: (1)47.41.84.33 SIGMA-ALDRICH INC. Iron Run Corporate Center 6950 Ambassador Drive Allentown, PA 18106, USA Tel: 610-391-9107 Fax: 610-391-9108 P.O. Box 355 1001 West St. Paul Avenue Milwaukee, WI 53201, USA Tel.: 414-273-4979 Tel.: 800-558-9160 Orders Fax 414-273-4979 Fax: 800-962-9591 Orders E-mail: [emailprotected] Web: www.sigma-aldrich.com

Staph-ZYM

Pastorex Staph-Plus

Aminolevulinic acid hydrochloride (Clorhidrato del ácido aminolevulinico) p-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) (p-Dimetilaminocinamaldehido (DMACA)) DNA (timo de temero)-máxima pureza Indoxyl acetate (Acetato de indoxilo) Lysostaphin (Lisostafina) o-Nitrophenyl-3-D-galactopyranoside (o-nitrophenyl-p-D-galactoside) (o-Nitrofenil-p-D-galactopiranósido (o-nitrofenil-P-D-galactósido)) y p-(PNPG) Phenolphthalein diphosphate (PDP) (Difosfato de fenolftaleína (PDP)) L-Pyrrolindoxyl-P-naphthylamine (L-pirrolindoxil- P-naftilamina) Sodium deoxynucleate (Desoxinucleato de sodio) Sulfanilic acid dry, crystaline (Ácido sulfanílico; desecado, cristalino) TRIS buffer (Buffer TRIS, trizma-9/0)

800

Apéndices

SYVA INC. 405 Alberto Way Los Gatos, CA 95032, USA Tel.: 408-356-8415 Web: www.dadebehring.com/syva.com TECHLAB 1861 Pratt Drive Suite 1030 Blacksburg, VA 24060-6364, USA Tel: 540-953-1664, ext. 3012 Tel: 800-832-4522 Fax: 540-953-1665

Fluorescent monoclonal antibody (FA) test (Prueba con anticuerpos monoclonales fluorescentes [FA])

Cambridge Bio Tech Cytoclone A&B Tech Lab toxin A

APÉNDICE

Glosario

PREFIJOS Definición: u n a sílab a o afijo ag re

Ent-, ento-, interno, d en tro de.

No-, no.

g ad o al co m ien zo de u n a p alab ra para p ro d u cir u n a p alab ra derivada.

Ex-, exo-, fu era de; exterior, externo.

Oligo-, pocos.

A -, sin.

An-, sin. Anti-, confia.

Filo-, afinidad por. Fisi-, fisio-, físico , fisio ló g ic o ; n a tural.

Orto-, norm al; recto, en el o rden ap ro piado.

Oxa-, p re sen c iao a g reg a d o de átom os

Hetero-, otro, diferente; de d iferen

de oxígeno.

Apo-, le jo s, a la d ista n c ia , fu e ra o

tes especies.

Oxi-, o x íg en o e n una m olécula.

desde.

hom*o-, sim ilitud, m ism o ; de la m is

Oxo-, agregado de oxígeno.

Aut-, auto-, a sí m ism o.

m a especie.

Pato-, q ue sufre enferm edad.

Aux-, auxo-, auxano-, aum ento de ta

Inter-, entre.

m año, d e intensidad, de velocidad, etc.

Intra-, den tro de.

Pir-, piro-, calor; fiebre.

Iso-, igual.

Pleo-, m ás.

Lis-, liso-, referid o a la lisis o diso lu

Poli-, m uchos, m ultiplicidad.

Bi-, dos, dos veces; doble; acciones duales.

Bio-, vida, viviente.

ción.

Bis-, dos veces.

Macro-, grande; visible a sim ple vista.

Cim, cinto-, relacio n ado c o n la fe r m en tació n o con enzim as.

Meso-, m edio; prom edio; interm edio.

Crom-, cromo-, cromoto-, cromato-

Meta-, después de, p róxim o, p o ste

P ió -, supuración, pus.

Pro-, antes de, delantero; precursor. Proto-, prim ero e n u n a serie. Radio-, perten ecien te a la radiación.

rior.

Ribo-, raíz de la ribosa y sus deri vados.

Micro-, p eq ueño; v isib le sólo co n el

Seudo-, falso, sim ilar a; d esv iació n

m icroscopio; u n a m illo n ésim a parte d e u n a unidad.

de u n a su stan cia h ip o té tic a parental.

D esoxi-, le falta u n átom o de oxígeno.

Mono-, u n o , único.

D is-, separar, d ejar aparte.

Term-, term o -, calor.

Morfo-, form a, estructura.

Ec-, fu e ra de, afu era de.

Toxi, tóxico-, veneno, toxina.

Multi-, m uchos.

En-, en.

Tri-, tres.

Necro , relativo a la m uerte o necrosis.

Endo-, d en tro de, que absorbe, que contiene.

Ultra-, m ás a llá de; fuera d e ciertos

Neo-, nuevo, reciente.

lím ites.

Definición: una(s) sílaba(s) agrega-

-filo, -filia, -filos, atra cc ió n o afin i

d a(s) al fin al de u n a p alab ra p a ra a l tera r su significado.

d a d para.

-osis, p ro c eso , en ferm ed a d , estad o ; p o r lo c o m ú n a n o rm a l o e n ferm o ; cu alq u ier pro d u cció n o au m ento (fi siológico o patológico).

, p ro d u cto r de color.

Des-, dehidro-, elim in ació n de á to m os, rad icales, agua.

Sub-, p or debajo; m enos de lo norm al.

SUFIJOS

-asa, d en o ta u n a en zim a; e l nom bre d el su strato sobre el cu al actú a la en z im a m ás la te rm in a c ió n - a s a ; p o r ejem p lo : en zim a galactosidasa, sus trato galactosa.

-cromo, color. -esis, condición, acció n o proceso.

-iasis, enferm ed ad o estado. -ico, d e n o ta u n á c id o ; a g re g a d o al n o m b re del ele m en to o com p u esto ; p o r ejem plo, fosfórico. -itis, aso ciado con un a en ferm ed ad o pro ceso inflam atorio.

-osa, d en o ta un h id rato d e carbono.

-ploide, m últiple. -poyesis, fabricar o producir. -scopio, instru m en to para visu alizar algo.

802

A pé nd ices

TÉRMINOS Absorción, ingreso de u n a sustancia o sustancias. D iferénciese de Adsorción.

Acción buffer, cap acid ad de n eu tra lizar, den tro de ciertos lím ites, y a sea ácid o s o b ases, sin m o d ificar la aci d ez o la alcalin id ad o riginales.

Acción fa*gocítica, fa*gocitosis; p ro ceso en el cu al las p artículas, en es p ecial las bacterias, son en g lobadas e in tro d u cid as e n el in terio r de ciertas células, p o r lo co m ú n d e los leu co ci to s (GB).

Aceite mineral, aceite d erivado de la m ate ria inorgánica, sobre todo del p e tró leo y sus derivados.

Aceptor artificial de electrones, cie rto s co lo ran tes sin tético s y otras sustan cias red u cib les que pueden a c tu a r c o m o a ce p to re s a rtific ia le s de electro n es cu an d o se agregan a su s p en sio n es de células vivas. L os e le c tro n es derivados de u n sustrato o xi d able son desviados de su vía m etabólican o rm al parared u cir el colorante.

Aceptor de electrones, su stancia que acep ta electrones (iones de h id ró g e no) y p o r co n sig u ien te se reduce; in v o lu crad o e n las reaccio n es de o x i dació n . L a afin id ad p o r los e le ctro n es se den o m in a “p o tencial re d o x ” ; los electro n es son tran sferidos desde los sistem as de p o ten cial redox m ás b ajo a los sistem as de p o tencial alto y o cu rre una reacció n red o x aco p la d a en tre los dos sistem as. E l oxígeno tie n e el p o ten c ial re d o x m ás alto y lo s v alores m ás b ajo s son p a ra el h i d ró g en o u n id o a vario s sustratos.

Aceptor de hidrógeno, u n a su stan c ia q u e está red u cid a e n el p ro c eso an aero b io d e la oxid ació n-reducción.

Acetal, d ietilacetal, 1- 1-dietoxietano, e tilid en o d ietiléter,C H 3C H (O C 2H 5)2.

Acetato, sal d el ácido acético. Acetllmetilcarbinol (AMC), véase A cetoína.

Acetoína (acetíbnetilcarbbiol), 3-hid ro x i-2 -b u tan o n a, C H 3C H O H -C O C H 3. O xidada a diacetilo. F orm ada a partir de 2,3-butanodiol, azúcares y áci do pirúvico p o r las bacterias que pro ducen ácido acético y acetona-butanol.

Acidez, estad o ácido; co n ten id o á ci d o d e u n líquido.

Ácido (secuestrador o quelante), v é a s e E tile n o d ia m in o te tra a c e ta to (ED TA ).

Ácido aromático, u n com puesto en el cu al u n o o m ás áto m o s de h id ró g e n o e n u n a n illo d e b e n c e n o fu e ro n

reem plazados p o r gru p o s carb o x ilo o en e l c u al u n g ru p o c a rb o x ilo e stá u nido a u n a cad en a lateral.

Ácido biliar, á c id o o rg án ic o q u ee x iste com o un conjugad o con glicin a o taurina; es decir, ácido g licocólico y á cid o ta u ro c ó lic o . Á c id o c ó lico , 3 ,7 ,1 2 -trih id ro x ico lán ico ; ácido desoxicólico, 3,12-dihidroxicolánico.

Ácido desoxirribonucleico (DNA), sustan cia en un a célu la que controla la herencia, se re p lica de m an era es pecífica y lleva la info rm ació n gen é tica. U n po lin u cleó tid o que co nsta de cuatro g ru p o s: b ases n itro g en ad as heterocíclicas de tipo purin as y pirim id in as (a d en in a. g u an in a, c ito sin a y tim in a), D -2 -d e so x irrib o s a y ácid o fosfórico; p resente en los n úcleos de las células vegetales y anim ales.

Ácido glicocólico, c o lilg lic in a , el con ju g ad o de ácido có lico con glici na. C 26H 43N 0 6. L a sal só dica se e n cu en tra en la bilis do nde se form a p o r la co m b inación de g licin a y ácido c ó lico.

Ácido hipúrico, N -benzoilglicina, áci do benzoilam inoacético; derivado benzoílico de la glicina; un com puesto de anillo arom ático, benzoílo (C6H 5CO -) conjugado con el am in o ácid o glicina (N H 2C H 2C O O H ).

Ácido orgánico, derivado de los h i drocarburos en el cual u n o o m ás áto m os de hid ró g en o so n reem plazados p o r un g rupo carb o x ilo (C = 0 ). F ó r m u ía general: O

R — COOH(C — OH) Á c id o pirúvico, C H 3C O C O O H ; áci do 2-oxopropanoico. O cu p a una p o sición cen tral en el m etabolism o m i crobiano; u n in term ed iario clave en el m etabolism o de los hid rato s de c ar bono. V é an se V ía m etab ó lica de E m bd e n -M e y e rh o f-P a rn a s y C ic lo de K rebs.

Ácido ribonucleico (RNA), p o lin u cleótido que co n siste e n ácido fo sfó rico, d-ribosa, bases nitro g en ad as heterocíclicas del tip o de las purin as y p irim id in as (adenina, g uanina, c ito sina y u racilo). Se en cu e n tra p rin c i palm en te en el citoplasm a, co n c an tid ad es p e q u eñ a s en e l n ú c le o y en los crom osom as. E l R N A co n tro la la v elo cid ad de la síntesis de proteínas en las células vivas.

Ácido teicoico, un a de las dos clases de p o lím ero s qu e co n stituyen la p a

re d c elu lar de las b acterias gram positivas. T am bién se e n cu en tra dentro d e la célula. L o s p o lím ero s lineales de u n p o lio l (fosfato de ribitol o de g licerol) p o seen resid u o s esterificados de D -alan in a en los grupos O H y azúcares unidos de m an era glucosídica.

Ácido, un c o m p u e sto qu e p ro d u c e iones hidrógeno en una solución acuo sa; un d ad o r de protones. Ácidos nucleicos, m o lé c u la s c o m p u e sta s p o r n ú c le o tid o s c o m p le jo s unidos, que p articip an tanto en la sín tesis de p ro teín as com o en los m eca nism o s g en ético s de todas las c élu las. C o m p u esto s org án ico s (p olinucleó tid o s) que cu an d o se h id ro lizan p ro d u cen b ases nitro g en ad as heteroc íc lic as c o m o p u rin as, p irim id in a s, á cid o fo sfó rico y los h idratos de car b o n o d -rib o sa o D -2 -d e so x irrib o sa. L os tipos p rincipales so n el ácido d e soxirribonucleico (D N A ) y el ácido ri b o n u cleico (R N A ).

Acilo, grupo de ácido orgánico en el que el grupo O H del carboxilo es reem plazado p or otro sustituyente (R C O -); p or ejem plo, acetilo, C H 3CO-.

Acoplamiento, co m b inación de una am in a o fenol co n un co m p u esto diaz o n io p a ra d a r un c o m p u e sto azo; reacció n po r la cual se p re p ara n los colorantes azo.

Acrónimo, u n a p a la b ra fo rm ad a po r la prim era o las prim eras letras de va rias p alabras; p o r ejem plo, IM V iC .

Acroodextrina, d ex trin a form ada a partir del alm id ó n dig erid o p o r la e n z im a a m ilasa; no p ro d u c e re ac ció n de c o lo r co n el reactivo d e yodo.

Activador, cofactor, un ion m etálico que activa un a e n zim a se c re tad a en u n a fo rm a inactiva, p o r ejem p lo , el efecto del m agnesio y d e l m an g a n e so sobre varias etapas de la ferm en tació n alco h ó lica y del ácido láctico.

Acuoso, co n agua. Adenina, p arte de u n n ucleótido, el ácido ad en ílico ; un a b a se crista lin a blanca, 6 -am inopurina, C 5H 5N 5, e n co n trad a en diversos tejid o s a n im a les y vegetales.

Adenosina, un m ononucleósido que consiste en adenina y D -ribosa; p ro d u cida p or la hidrólisis del m onofosfato de adenosina; ribósido de adenina

Adenosina difosfato de (ADP), c o n siste en ácido adenílico, rib o sa y dos ra d ic a le s de á cid o fo sfó ric o . E s u n c o n stitu y e n te de la c o e n z im a I, un

Glosario acep to r de fo sfato de alta en erg ía que fo rm a el trifo sfato de adenosina.

Adenosina, monofosfato de (AMP), co n siste en ácido adenílico, rib o sa y u n rad ical de ácido fo sfórico. E l co m p u esto es activo e n m u ch as reaccio n es d e tran sfere n cia d e e n erg ía p o r su cap acid ad de co n serv ar la energía y p o r su c ap acid ad de fo rm ar e l d i fo sfato y e l trifo sfato de adenosina.

Adenosina, trifosfato de (ATP), com p u e sto d e ácid o ad en ílic o , rib o sa y tres radicales de ácido fosfórico. C uan d o ced e el fosfato de alta energía, se transform a en difosfato de adenosina.

Adsorción, p ro c eso p o r el cual las m o lécu las de gas o las p eq u eñ as p a rtícu las en so lu ció n son atraídas p o r la su p e rfic ie d e o tra su s ta n c ia y q u ed an ad h erid as a ella. C o m p árese c o n A b sorción.

Agar en pico de flauta, tu b o de m e dio de cultivo co n ag ar fu n d id o que se d eja so lid ificar en un án g u lo para p ro d u c ir u n a superficie in clin ad a m a y or p a ra el inó cu lo b acteriano.

Agar sangre (Blood Agar (BA)), agar e n riq u e c id o c o n san g re p a ra in c re m en ta r e l cultivo de los m ic ro o rg a nism o s con req u erim ien to s esp ecia les p a ra el crecim ien to y /o p a ra direre n ciar las co lo n ia s hem o líticas. Se prefiere la san g re de o veja (5% ).

Agar sangre de oveja (sheep blood agar (SBA), m e d io b a s a l m ás 5% sangre fresca d e oveja, estéril, y desfibrinada. L a sangre es u n en riq u eci m ien to y u n in d icad o r d e hem olisis. V éase H em ólisis.

Agar sangre-cistina-glucosa, m e

803

veces; la segunda v ez en un d estila do r de v idrio o platino.

Agua destilada, ag u a q u e sufrió un pro ceso de v ap o rización y co n densa ción.

Aireación, saturación de un líquido con aire; p o r ejem plo, 0 2 y C 0 2.

Aislamiento, m é to d o p a ra o b te n e r b acterias en cultivo p u ro p o r su b cu l tivos de colonias separadas, m ed ian te e l u so de d iferen tes tip o s d e m e dios de cultivo.

Aislamiento primario, aislam iento in icial y crecim iento d e m icroorganis m os a p a rtir de u n a m u estra clínica.

Álcali, u n a b a se so lu b le en ag u a que pro d u ce io n es hid ro x ilo (O H ) en un a so lución acuosa.

d io de cultivo p a ra e l aislam iento de

Alcalinidad, calid ad d e alcalino.

Francisella tularensis.

Alcalino, que p o see las pro p ied ad es

Adyuvante, q u e a y u d a o a siste en

Agente, alg o c ap a z d e p ro d u c ir un

de un álcali.

in m u n o lo g ía; u n v e h íc u lo u tiliza d o p a ra au m en tar la antigenicidad.

efecto sobre un organism o.

Alcano, un hid ro carburo alifático sa

Agente complejante, v éase A gente

Aerobio facultativo, u n m icro o rg a

quelante.

n ism o q u e p refiere v iv ir de m an era an aero b ia p e ro p u ede ad aptarse a las co n d icio n es aerobias.

Agente estabilizante, agente q ue re

tu rad o de la serie del m etan o cuyos átom os d e carbono e stán unidos p o r lig ad u ras sim ples. L o s átom os de c ar bono están co m p letam en te saturados co n los átom os d e hid ró g en o . L a fó r m u la gen eral es C nH 2n+2, d o nde n re p re sen ta el nú m ero de átom os de c ar bono.

Aerobio, q u e req u iere o xígeno o a i re atm o sférico para e l crecim iento y la rep ro d u cció n . Aerógeno, p ro d u cto r de gas ( C 0 2 y H2). Aerosol, su sp en sió n estab le de líq u i d o s o sólidos en aire, o xígeno o g a ses in e rte s , q u e se d isp e rsa e n u n a llo v izn a fina.

Aerotolerante, c ap acid ad de u n m i croo rg an ism o anaerobio p a ra desarro llar en u n m edio con aire, p o r lo c o m ú n de m an era d eficiente, e n esp e c ia l d e sp u é s d e u n a is la m ie n to anaerobio.

Afinidad, atracción. Agar-agar, unpolisacárido seco (el és ■ ter del ácido sulfúrico de un galactan o lineal) extraído del alga m arina j a p o n esa (algas rojas) y utilizado com o u n agente solidificante e n los m edios de cultivo biológicos. S e disuelve en ag uahirviendo, solidificaaproxim adam en te a lo s 38°C y p o r lo general las bacterias n o producen su licuefacción.

Agarconazúcartripleyhierro(TSI), m ed io que contiene glucosa, lactosa y sacarosa utilizado en el exam en de ru tina de lasm uestras provenientes de m a teria fecal para la identificación de bac terias en téricas gram negativas. T am bién puede evidenciarse la producción de sulfuro de hidrógeno y gas ( C 0 2 e H 2), y a que es un m edio sem isólido.

tard a o u n a sustan cia qu e n eu traliza e l efecto de u n acelerador; sustancia qu e co n serva u n eq u ilib rio quím ico.

Agente humectante, su sta n c ia q ue reduce la tensión superficial, que cau sa un a dispersión m ás fácil de los lí quidos sobre u n a superficie sólida; es decir, detergentes; am ónicos, catiónicos o no iónicos.

Agente oxidante, u n a su stan cia que pro d u ce la ox id ació n de o tra sustanc ia y es red u cid a en el p roceso; el acep to r de hidrógeno.

Agente quelante, un a sustancia que se com bina con un m etal en com ple jo s d iso ciad o s déb iles e n los q u e el m etal se une a un com puesto orgánico e n anillo p o r un io n es covalentes. El io n m etálico es secu estrado y u nido con firm eza en un anillo dentro de la m olécula del quelante.

Aglucona, m olécula no glúcida; pro ducto de la hidrólisis de u n glucósido.

Aglutinación, ag ru p ació n d e células suspendidas en un líquido.

Aglutinina, un an ticu erp o en co n tra do en el suero in m u n e que, cu an d o se ag reg a a u n a su spensión de sus m i cro o rg an ism o s h o m ó lo g o s, pro d u ce la a d h e re n c ia de los m ic ro o rg a n is m os entre sí p a ra fo rm ar grum os.

Agmatina, l- a m in o -4 -g u a n i-d in o bu tan o am ina resu lta de la descarbox ila c ió n d e la a rg in in a ; N H = C (N H 2)N H (C H 2)4N H 2.

Agua bidestilada, ag u a d estilada dos

Alcohol etílico, etanol; CH3CH2OH. P roducidoporvarios m icroorganism os que ferm entan sustratos diferentes.

Alcohol polihídrico, u n a lc o h o l (o fenol) qu e contiene m ás de un grupo h id roxilo (-O H ); los grupos hidroxilo deb en estar en carbonos diferentes.

Alcohol, u n c o m p u e sto o rg á n ic o qu e c o n tie n e el g ru p o h id ro x ilo (O H ), R -O H ; u n derivado de los hidrocarbu ros con uno o m ás átom os de hidróge no reem plazados p o r grupos hidroxilo.

Aldehido, u n c o m p u e sto o rg á n ic o q u e c o n tie n e e l g ru p o a ld e h id o (C H O ); u n derivado de los h id ro ca r b uros en e l qu e dos átom os de h id ró geno sobre el m ism o átom o de c a r bono fu ero n reem plazados p o r u n á to m o de o xígeno p a ra fo rm ar e l g rupo carb o n ilo ( 0 = 0 ) . E l g rupo carb o n ilo e stá u n id o a un áto m o de carbono y a u n á to m o de hidrógeno. o

R -C -H

E ste c o m p u e sto es u n in te rm e d ia rio o u n p r o d u c to d e la fe rm e n ta c ió n b a c te ria n a fo rm a d o a p a rtir d e a z ú cares, a lc o h o l e tílic o , á cid o p irú v ico y o tra s su s ta n c ia s p o r las b a c te ria s q u e p ro d u c e n á c id o a c é tic o y a c e to n a -b u tan o l.

804

Apéndices

A ld o sa , un azú car que es u n a ld eh i d o po lih íd rico .

Alicíclico, compuesto, u n co m p u es to o rg án ico q u e ex h ib e c a ra cte rísti cas alifáticas, pero cu y os átom os de carb o n o están en u n anillo e n lugar d e u n a cad en a abierta.

Alícuota, u n a fracció n o porción. Alifático, compuesto, u n co m p u e s to o rg án ico co n u n a estru ctu ra de c a d e n a abierta.

Almidón, 1 ,4 -a-g lu can o ; p olisacárid o co m p u esto p o r lo m en o s p o r dos fraccio n es: a) am ilo sa o a -a m ilo s a , u n a cad en a recta d e u n idades de 1,4a -g lu c o p ira n o sa , y b ) am ilo p ectin a o fS-amilosa. E l a lm id ó n es in so lu b le e n a g u a fría, alco h o l o éter y es p a r c ia lm e n te so lu b le e n a g u a caliente; h id ro lizad o a varias fo rm as de dextrín as y a glucosa.

Alqueno, unhidrocarburo alifáticoque

(-N H 2) y carb o x ilo (-C O O H ). C o n s titu y e n u n a c la se d e ácid o s o rg á n i co s c ara cte riz ad a p o r la su stitu ció n de u n g ru p o a m in o en e l re sid u o alq u i lo R .-C H (N H 2)C O O H . L os am in o á cidos, los ladrillos de las m oléculas de proteína, pro p o rcio n an u n a fu en te de nitró g en o y energía a un orga nism o. A lgunos organism os requieren am in oácidos p a ra el crecim iento. L os am in oácidos im p o rtan tes e n el m eta b o lism o bacterian o in clu y en glicina, alan in a y serina.

Amplio espectro, amplia eficacia; d e n o ta a n tib ió tic o s e fic ac e s c o n tra u n a v ariedad de bacterias, tanto gram positivas com o gram negativas.

Anabolismo, m etabolism o construc tivo en el cual el m aterial nutritivo es asim ilado p o ru n a c é lu la p a ra construir o restau rar el m aterial celular y otras m ate ria s vivas. P ro c e so p o r el cu al las sustancias quím icas sim ples se con vierten en sustancias m ás com plejas; síntesis de m aterial p o r la célula. Tam b ién se den o m in a asim ilación.

contiene d os átom os d e h idrógeno m e n o s q u e el alcan o co rrespondiente y p o r consiguiente es insaturado y ade m ás tiene dos átom os de carbono u ni dos p o r u n a ligadura doble. L a fórm u la g e n era l es C nH 2n; e l n o m b re del com puesto term in a en -eno o -ileno.

g an ism o q ue prefiere v iv ir en aerob io sis pero p u ed e ad aptarse a las c o n d iciones anaerobias.

Amida, u n derivado d e u n ácido or

Anaerobio, u n org an ism o que p uede

g án ico (R -C O O H ) en e l qu e un g ru p o O H está reem p lazad o p o r el g ru p o am in o (-N H 2). L a fó rm u la gen e ra l p a ra u n a a m id a p rim a ria es: R -C O -N H 2; el co m p u e sto se d e n o m in a según el ácido d el cu al deriva, c am b ia n d o la te rm in a c ió n -ico p o r am id a y elim in an d o la p alab ra ácido.

Amilasa, u n a de u n g ru p o de e n zi m as q u e ro m p en el alm idón o am ilolíticas, qu e clivan el alm id ó n y el g lu có geno.

Amilopectina, p o lisacárid o de caden aram ificad a (glucano) en el alm idón.

Amilosa, p o lisacárid o n o ram ificado

Anaerobio facultativo, un m icro o r

c recer y rep ro d u cirse en au sen cia de o xígeno o aire atm osférico.

Anaerógeno, n o p ro d u c to r de gas ( C 0 2 y H 2).

Análisis colorimétrico, a n á lisis cuantitativo de u n a su sta n cia que co m p a ra la in ten sid ad d el co lo r pro d u ci do p o r u n reactivo con u n c o lo r e s tán d ar p ro d u c id o de m an era sim ilar e n un a so lu ció n de c o n cen tració n c o nocida.

Análisis espectrofotométrico, d eter m in ació n de la estru ctu ra y /o la c an tidad, p o r ab so rció n de la luz a cu al q u ier lo n g itu d de onda, v isib le o no.

lo g o (su stra to ) o a n ta g o n ista m etabólico.

Anhídrido, resid u o de un ácido d e s p u és de e lim in arlo s elem entos de agua de los gru p o s carboxilo.

Anhidro, sin agua. Anión, p o rc ió n d e l e le c tró lito qu e p osee u n a carga n egativa y se m ueve h acia el ánodo.

Anodo, electrodo co n carga positiva de un a célula electrolítica. V éase P o los.

Anómero, epímero, u n a de las dos m oléculas de azú car son epim éricas que están en el átom o de carbono hem ia c etal; p o r ejem p lo , a -D -g lu c o sa y P -D -glucosa. V éase E pím ero.

Antagonismo, véase In h ib id o r co m petitivo.

Anticoagulante, un a su sta n c ia que im p id e la coag u lació n , p o r ejem plo, ox alato de potasio, citrato de sodio y heparina.

Antigénico, q u e in d u c e la p ro d u c ción de an ticuerpos en u n anim al; ac tú a c o m o un antígeno.

Antimicrobiano, u n ag en te b io ló g i c o o q u ím ic o qu e in h ib e e l crecim ien to d e los m icroorganism os.

Antitoxina, an tic u erp o fo rm ad o en resp u esta a u n a su stan cia antigénica v en enosa de origen b io ló g ic o . S u stan cia o an ticu erp o que n eu tra liz a o se u n e a la toxina, com o la e x o to x in a b ac teriana.

Apoenzima, p orción de pro teín a in ac tiva de un a enzim a; a p o en z im a + c o en zim a (r) holoenzim a.

Apolar, sin p o lo s o proyecciones. Aromático, compuesto, u n c o m p u esto o rgánico cíclico derivado del benceno.

Asépticamente, realizar un p ro c ed i

Analítico (AR), g ra d o de u n a su s

m ien to sin p e rm itir la co n tam inación p o r m icroorganism os.

Amina aromática, u n co m p u esto en

tan c ia quím ica.

el cu al u n g ru p o am in o o u n g rupo am i n o su stitu id o e stá u n id o a u n anillo de benceno.

Aséptico, lib re de la p re sen c ia d e m i

Análogo de vinilo, u n g ru p o m o n o

cro organism os vivos capaces de cau sar in fecció n o contam inación.

(g lu can o ) en el alm idón.

Amina, u n d e riv a d o o rg á n ic o d el am o n íaco en el cual u n o o m ás áto m o s d e h id ró g en o so n reem p lazad o s p o r u n ra d ic al alq u ilo . F ó rm u la g e neral: R -N H 2; d en o m in ad a según los g ru p o s alq u ilo en el n itró g en o c o n la term in ac ió n am ina. É sto s so n c o m p u esto s b ásico s que reac cio n a n con lo s á cid o s in o rg án ico s p a ra fo rm a r sales.

Aminoácid.', u n co m p u esto o rg á n i co q u e c o n tie n e lo s g ru p o s a m in o

v alen te C H 2:C H -; eten ilo , d erivado d e l c o m p u e sto e tile n o b iv in ilo ; un co m puesto q u ím ico qu e es estru ctu ralm en te sim ilar a otro pero q ue d i fiere en un cierto co m p o n en te y p u e de ten er un a activ id ad m etab ó lica si m ilar u opuesta.

Análogo, un co m p u esto que in terfie re con el m eta b o lism o o la fu n ció n de otro co m p u esto sobre la b a se de u na sim ilitu d e stru ctu ral. L o s d o s c o m puesto s son sim ilares e n lo qu e re s p e cta a la función, pero difieren en la estructura. T am bién d en om inado an á

Asimetría, sin sim etría; d e sp ro p o r ción entre dos o m ás partes.

Asimilación, v éase A nabolism o. Atomo, u n a u n id a d q u ím ic a c o m p u esta p o r tres tip o s d e p a rtícu la s:p ro tones, electrones y neu tro n es; la p a r te m ás p eq u eñ a de un elem ento que es ind estru ctib le e in d iv isib le desde el p u n to de vista quím ico.

Autoclave, un aparato qu e genera va p or bajo presión, utili zado para esteri lizar equipos, m ateriales y productos.

Glosario Autolisina, u n a sustan cia b acterian a

la p a red c elu lar de las bacterias.

cap az de d esin teg rar la célu la que la contiene.

Bacteria, m icro o rg an ism o m icro scó

Autólisis, lisis o d e sin te g ra c ió n de célu las p o r la acció n d e sus p ropias en zim as; autodesin teg ración.

Autolítico, que p erten ece o cau sa au tólisis.

Autooxidación, co m b in ació n direc ta de u n a su stan cia co n ox íg en o m o lecu lar a la tem p eratu ra ordinaria.

Auxocromo, u n g rupo q uím ico cuya p resen cia en u n a m o lé c u la qu e c o n tien e u n g ru p o cro m ó foro p erm ite a e sa m o lé c u la fu n cio n ar com o u n c o lo ran te. E l au x o cro m o p ro p o rc io n a p ro p ied ad es fo rm ad o ras de sal y es resp o n sab le d e tran sferir el c o lo r de u n co lo ran te a u n a su stan cia sobre la q u e actúa. V éan se C ro m ó fo ro y C o lorante.

Auxótrofo, m icro o rg anism o im itan te q u e só lo p u e d e c u ltiv a rse p o r la co m p lem en tació n d e u n m edio m ín i m o co n facto res de crecim ien to o am i n o ácid o s n o req u erid o s en las cepas d e tip o salvaje.

Benceno, anillo H

p ico dim inuto, form ado p o r u n a c é lula, que se m ultip lica p rin cip alm en te p o r fisión b in aria y c arece de c lo rofila.

Bacterias gramnegativas, bacterias que pierd en el colo ran te prim ario del p ro ced im ien to d e co lo ració n de G ram (v io leta cristal), son deco lo rad as p o r e l alco h o l y to m an el c o lo r de la c o lo ració n de co n traste (safranina), lo qu e pro d u ce un co lo r ro sa roji*zo.

Bacterias grampositivas, b acterias qu e tom an el colorante p rim ario del p ro cedim iento de co loración de G ram (violeta cristal), resisten la decolora ció n p o r el alcohol, no tom an e color d e la coloración de contraste (safrani na) y retienen su color vio leta inicial.

Bacterias gramvariables, b acterias qu e retien en el colo ran te de G ram a veces, p o r lo co m ú n en cultivos jó v e nes, p ero n o lo re tien e n e n otros m o m entos, p o r lo co m ú n en los cultivos m ás viejos.

805

Hcn cH C H

Benceno, co m p u esto aro m ático p rin cipal, orgánico, q u e co n tien e u n a n i llo cerrad o de seis áto m o s d e c arb o no u n id o s c o n lig a d u ra s a lte rn a d a s sim ples y dobles; C GH 6

Bimolecular, qu e involucra dos m o léculas; p o r ejem plo, re ac ció n a y b.

Binomio, qu e co n siste de dos n o m bres; p o r ejem plo, gén ero y especie.

Bioquímica, cam p o de laq u ím ic aq u e trata d e los p ro cesos d e los m ic ro o r ganism os vivientes, c o m o las b a cte rias y los p ro d u cto s derivados d e e lla s; qu ím ica de los p ro ceso s de los seres vivos. B io sín tesis,fo rm ació n d e un com pues to quím ico po r enzim as, y a sea en el organism o (in vivo) o p o r fragm entos o extractos de células (in vitro).

Azida, a zid a só d ica (N aN 3); u n a s u s -

Bacterias heterotróficas, bacterias

ta n c ia q u e in h ib e lo s m ic ro o rg a n is m o s g ra m n e g a tiv o s; u n a s u s ta n c ia b a c te rio stá tic a . U tiliz a d a e n lo s m e d io s d e b id o a su a c c ió n b a c te rio s tá tica.

qu e d ep en d en de sustratos orgánicos p a ra su s re q u e rim ie n to s n u tritiv o s, so n in cap aces d e u tiliza rel d ióxido del carb o n o com o ú n ica fu en te de c arb o no y d eben o b ten er este elem ento a p artir de los co m puestos o rg án ico s. L a m ay o r p arte d e las b a cteria s im p o r tantes en m ed ic in a perte n ec e n a esta clasificación.

to s” ; m edio en riq u ecid o p a ra e l ais la m ien to y e l c u ltiv o d e Bordetella pertussis, ag ente etio ló g ico de la tos convulsa.

Bacterias mesófilas, b a c te ria s q ue

Bovino, un anim al com o buey, vaca,

Azo-, prefijo que in d ica la presen cia d el g ru p o -N :N -.

Azúcar reductor, m o n osacárido o disa c á rid o (p . ej., g lu c o s a , fru c to s a ) q u e re d u c e las sales de c o b re o de p lata e n u n a solu ció n caliente, alca lin a (p ej., F eh lin g ); actú a com o in d icad o r de gru p o s ald ehido o cetona libres.

Azúcar simple, u n m o n o sa c á rid o ;

c recen m ejo r a tem p eratu ras m o d e ra d a s d e a lre d e d o r d e 25 -4 0 °C . L a m a y o ría de las b a c te ria s p a tó g e n as crecen a u n a tem p eratu ra óp tim a de 32-35°C .

p o r ejem plo, glucosa.

Bactericida, d e n o ta u n a su sta n c ia ,

Azúcares, h id rato s de carb o n o d u l

m a te ria l o a g e n te q u ím ic o q u e r e s u lta le ta l p a r a la s b a c te ria s ; p r o d u c e la m u e rte b a c te ria n a ; es ir r e v e rsib le .

ces; p o r lo general, la sacarosa; los ti p o s in clu y en sacaro sa (rem o lach a o c a ñ a d e a zú c ar), g lu co sa, fru cto sa, a rab in o sa , in o sito l, m alto sa, g lu có g e n o y la c to sa . V é a s e H id ra to s de carb o n o .

Bacilo, b acteria e n fo rm a d e bastón; ta m b ié n u n g é n e ro de b a c te ria s en fo rm a de b astó n d e la fam ilia Baci-

llaceae. Bacilos coloideos, v éase C oliform es. M icro o rg an ism o s que resid en en el in testino.

Bacitracina, U SP, BE, p o lip é p tid o an tib acterian o d e estru ctu ra quím ica co n o cid a; p erten ece a la clase de an tib ió tico s q u e in h ib en la síntesis de

Bacteriófa*go, un v iru s c o n afinidad esp ecífica p o r las b a c te ria s; p o r e je m p lo , corinebacteriófa*go.

Bacteriología, e stu d io b io ló g ic o y qu ím ico de las bacterias.

Bacteriostático, acció n d e u n a g en te qu e in h ib e el crecim ien to b a cteria no . R e a c c ió n re v ersib le; c u an d o se re tira el inhibidor, se rean u d an el c re cim iento y la reproducción.

Biotipo, g rupo de cepas bacterianas qu e se d iferen cian d esd e el p u n to de vista fisio ló g ico d e o tras cepas d e la m ism a fuente.

Bordet-Gengou, medio de, p lac ad e

etc.

Browniano, movimiento, v éase M o v im iento brononiano.

Bubón, u n a in flam ació n y tu m e fac ción d e los ganglios linfáticos; p o r lo general en la in g le o e n las axilas.

Buffer (tampón), so lución qu e c o n tien e u n ácido d éb il y su base co nju gada. E l ag regado a un sistem a p o si bilita a éste resistir los cam bios en la con cen tració n del ion hidrógeno.

Cadaverina, p e n ta m e tile n d ia m in a , N H 2C H 2C H 2C H 2C H 2C H 2N H 2, u n lí q uido inco lo ro co n u n o lo r pu trefa c tivo fo rm ad o p o r la d escom posición de lis in a o de m ate ria l p ro tein ác e o p o r las bacterias. Caldo, un m edio d e cultivo co m p u e s to p o r n u trien tes esenciales p a ra las b acterias h eterotróficas; u n líquido.

Base, u n co m p u esto q ue pro d u ce io

Cambio químico, u n a alteració n en la co m p o sició n de u n a sustancia.

nes hid ro x ilo (O H ) en so lución a cu o sa; un ace p to r de protones.

Cápsula, c a p a d e c u b ie rta e sp e sa, c o n stitu id a so b re to d o p o r h id rato s

806

Apéndices

de carb o n o , que ro d ea la p a red celu la r de m u ch as bacterias. L a p re sen c ia d e u n a cáp su la au m en ta la patog en icid ad b acteriana.

Característica, u n ra sg o o p ro p ie d ad distintiva.

Caramelizar, azúcares fu ndidos en el m e d io q u e to m a n u n a c o lo ra c ió n b ro n c e a d a p o r el e x ce siv o c a le n ta m ien to ; degradación.

Carbamida, d iam id a del ácido c ar b ó n ico . L a u re a o u n o de sus deriva dos son u n a carbam ida.

Carbinol, alcohol m etílico. Carbohidrasa (citasa), e n zim a que d eg rad a (hidroliza) los h idratos de car bono: m altasa, lactasa, sacarasa, am ilasa, etc.

Carbohidrato, v éaseH id rato s d ecarbono.

Carboxilasa, e n zim a q u e perten ece a las d esm o lasas q u e d escarb o x ilan lo s a -c e to á c id o s a lo s ald eh id o s c o rresp o n d ien tes. D e m an era esp ecífi ca, actú a so b re el ácido pirú v ico p a ra fo rm ar acetald eh íd o y dió x id o de carb o n o . S u co en zim a es la cocarboxilasa.

Caseína, p rin cip io p ro teico de la le ch e; u n a fo sfo p ro teín a q u e precip ita c o n la acid ificació n . L as enzim as coa g u lan tes de la lech e (q u im osina, p e p s in a y q u im o trip sin a ) h id ro liz a n la c aseín a a u n a p a racaseín a soluble que a su vez, en p resen cia de iones de cal cio , se co n v ierte en c aseín a in so lu ble, u n p aracasein ato (p aracaseinato d e calcio ). E l p aracasein ato se d en o m in a “cu ajad a de la lec h e ” ; e l líq u i d o claro resid u al se d en o m in a “ su e ro de la lech e” .

Catabolismo, p ro c e so m e ta b ó lic o q u e co n siste e n la ru p tu ra de m o lécu las o rg á n ic a s c o m p le ja s e n s u s ta n cias m ás sim ples llevado a cabo po r las b acterias co n lib eració n de en er g ía, u n a p a rte d el p ro c e so to ta l del m etab o lism o . T am bién d en om inado D esasim ilació n .

Catalasa, u n a e n zim a qu e d e sco m p o n e el p e ró x id o d e h id ró g e n o (H 20 2), lib eran d o o x íg eno libre. Catálisis, efec to q u e u n c atalizad o r ejerce sobre u n a reacción quím ica.

Catalítico, relacio n ad o con la catáli sis o q u e la efectúa.

Catalizador, u n a su stancia q ue ace lera o red u ce la v elo cid ad u n a reac ció n q u ím ica o física sin de stru irla ni m odificarla. E l térm in o p o r lo g en e ra l se ap lica a la aceleración; e l tér m in o cataliza d o r negativo se u tiliza

cuando retard a la reacción.

Catión, ion qu e p o see u n a carga p o sitiva y se d irige h acia el cátodo.

Cátodo, po lo negativo de u n a b atería o sistem a eléctrico. V éase P olos. Cáustico, corrosivo o quem ante. Cefalina, m ie m b ro de u n g ru p o de

co n tien e un g rupo c arb o n ilo ceto n a (C = 0 ); p o r ejem plo, ácido pirúvico.

Cetona, un derivado de los hid ro ca r buros; co m p u esto o rgánico qu e co n tiene el g rupo carb o n ilo ( C = 0 ) u n i do a d o s rad icales orgánicos. F ó rm u la general:

líp id o s den o m in ad o s fosfolípidos.

Cefalosporina, u na de varias su stan cias an tibióticas p rov enientes de los h o n g o s; eficaz c o n tra b acterias gram positivas y gram negativas. Celsius, o tra den o m in ació n de centíf grado.

Célula, un id ad estructural de todas las plan tas y anim ales. Celulosa, p o lisacárid o del g rupo de los hexosanos, u n po lím ero de la g lu c o sa q u e c o n stitu y e e l m ate ria l e s tru ctu ral d e las pared es celulares de las plantas. Centelleo, destello de luz pro d u cid o e n u n c ris ta l q u ím ic o p o r la a b so r ció n de u n fo tó n ionizado; el m in ú s culo destello de luz o bservado sobre u n a p an talla flu o rescen te se p roduce a p a rtir d e la em isió n e sp o n tán ea de p artícu las cargadas a través de la su perficie sensibilizada.

Centígrado, e sc a la d e te m p e ra tu ra en la qu e el p u n to de co n g elación del a g u a p u ra es de 0 °C y e l p u n to de eb u llició n es d e 100°C.

Centrífuga, aparato p a ra sep arar los co m p o n en tes o in g red ien te s de un a m ezcla p o r acció n de la fu erza cen trífuga, p o r lo gen eral p o r la ro tación en u n a m áquina.

Centrifugación, separación de só li dos de los líquidos o de líquidos con d e n sid a d e s re la tiv a s d ife re n te s p o r ro tac ió n rápida. Cepa bacteriana, u n cultivo p u ro de b acterias form ado p o r descendientes de u n ú n ico aislam iento.

Cepa tipo salvaje, c ep a en contrada en la natu raleza o u na cep a estándar; v éase A u x ó tro fo y P rototrofo.

Cepa, co n ju n to d e d escendientes que se o rig in a de un antepasado co m ú n y retien e las características de los an cestros. V éase tam b ién Subcepa.

Ceramida, térm ino g en eral p a ra d es c rib ir cu alq u ier ácido g raso N -acetilo derivado de la esfingosina. Cerebrósido, g alactolípido; clase de g lu co esfin g o líp id o s; esp ecíficam en te, u n a m o n o g lu c o silc e ra m id a e n c o n tra d a en la v ain a de m ie lin a del tejid o nervioso. Cetoácidos, u n ácid o o rg á n ic o qu e

R — C — R'

Cetosa, un azú car sim ple que es un a c eto n a polihídrica. Ciclo de Krebs, sistem a enzim ático q ue convierte el ácido pirú v ico a d ió x id o d e c a rb o n o c o n la lib e ra c ió n c o n c o m ita n te d e e n e rg ía c a p tu ra d a en las m oléculas de ATP; un p roceso aerobio. T am bién d en om inado ciclo del ácido c ítrico o ciclo del ácido tricarboxílico (T C A ). Ciclo del ácido cítrico, v éase ciclo de K rebs.

Ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), véase C iclo de K rebs.

Ciclo glucolítico, v é an se G lucólisis o V ía m etab ó lica de E m b den-M eyerh o f-P am as (E M P).

Cimógeno, u n a p ro en zim a; e n zim a inactiva.

Cinético, qu e p erten ece al m o v im ien to; se refiere a fuerzas qu e influyen en el m o vim iento de los cuerpos. Cisterna, (3-m ercaptoalanina, C 3H 7 0 2N S ; u n am in o ácid o derivado de la cistina. Cistina, P ,P ’-d itio b isa la n in a, C 6H , 0 4N 2S2. U n am inoácido que co n tie ne azufre y p uede ob ten erse p o r o x i d ació n d e la cisterna. Citasa, en zim a c arb o h id rasa citohidrolítica. Citocromo oxidasa, u n a en zim a que e n p re se n c ia de o x íg en o m o le c u la r o x id a el cito cro m o c. Citocromo, sistema de, g rupo de hem o p ro teín as in tra ce lu la res p ro d u c i das p o r to das las b a cteria s aerobias qu e se o c u p a de la tran sfere n cia de electrones e n las prin cip ales vías del m etab o lism o b io ló g ico de oxidaciónreducción. Citocromo, un o d e u n g rupo de p ig m entos hem o p ro teico s (a, b y c) p re sente en la m ay o ría de las células v i vas, c o n excepción d e u n as p o cas b a c terias (p. e j., especies de Clostridium) u n o de un g rupo de tran sp o rtad o res reve: sibles de la oxid ació n -red u cció n en la respiración. P u ed e alte rn a r o x i dació n y reducción. Citrato de sodio, u n an ticoagulante que fo rm a u n com p lejo no io nizado

Glosario 807 co n el calcio, lo q u e en co n secu en cia im p id e la coagulación.

Clivaje, ru p tu ra de u n a m o lécu la en d o s o m ás m o lécu las sim ples.

Clorurodetriféniltetrazolio (TTC), sa l m o n o te tra z ó lic a ; 2,3,5-TTC; C 19H 15N 4C 1. C uando se red u ce fo r m a u n pig m en to d e co lo r oscuro, so lu b le e n a g u a, c o n o c id o c o m o form azán , u tilizad o p a ra lo ca liz ar siste m as oxid ativ o s enzim áticos.

Coagulación, separación de un m a terial dispersad o de m an era coloidal o d e u n sólido d isuelto a p artir de un líq u id o por fo rm ació n de u n a m asa in so lu b le o gelatin o sa, com o la c o a g u lació n de la alb ú m in a d e l huevo, el cu ajo de la lech e o la co ag ulación de la sangre.

Coenzima. u n a su s ta n c ia o rg á n ic a no p roteica de bajo peso m olecular que p uede unirse a una e n zim a y qu e en co n secu en cia refu erza sistem as a cti vos específicos de la enzim a. E l tér m in o co en zim a es sin ó n im o de g ru po p ro stético cuando se lo u tiliza en relación con proteínas conjugadas que p o seen activ id ad enzim ática. Cofactor, g rupo pro stético com o el hem , las co enzim as y los iones in o r g ánicos com o el m agnesio, esencial para la acción de la enzim a. V éase tam bién A ctivador. Colágeno prin cip io activo de la pro teín a fib ro sa del tejido conectivo, ten dones y hu eso s de los m am íferos.

Coagulasa ligada, d eterm in ació n de

Coliformes, b a cilo s gram n eg ativ o s a e ro b io s y a n a e ro b io s facu ltativ o s, qu e no fo rm an esporas y qu e ferm en tan la lacto sa con fo rm ació n de gas (Escherichia cotí y gru p o s Klebsiella-Enterobacter). S o n im p o rta n te s d esde el p u n to de vista sanitario p a ra c o m p ro b ar la co n tam in ació n b a c terian a del agua, d e los alim en to s y de la leche.

la p ru eb a en p o rtao b jeto que m ide el facto r de ag regación

Colina, ion (2-hidro xietil) trim efilam onio; HOCH2-CH2-N(CH,)3+; fa c

Coagulasa, e n zim a q u e c au sa c o a

to r lip otrópico, facto r de transm etilatión. S e encu en tra en la m ay o ría de los tejidos anim ales, y a sea lib re o en com binación c o n lecitina.

Coagulante, ag en te q u e c au sa coa gulación.

Coagular, solid ificar lo líq u id o o c u a ja r p o r acció n q uím ica o ferm entación. Coagulasa libre, d e te rm in a ció n de la pru eb a de co ag u lasa e n tubo.

g u lació n d el plasm a.

Coagulasa, facto r que reaccio n a con la, (C o a g u la se R e a c tin g F a c to r (C R F )), u n factor d el p lasm a que se co m b in a c o n la co ag u lasa libre en la p ru eb a de co ag u lasa en tu b o p a ra for m ar u n a su sta n c ia q u e co n v ierte de m a n e ra in d ire c ta e l fib rin ó g e n o en fibrina, lo cu al p ro d u ce la form ación d e u n coagulo. Coágulo ácido (cuajada ácida), coa g u lació n d e la caseín a en la leche c o m o resu ltad o de la p ro d u cció n de áci d o láctico p o r los m icroorganism os. P o r lo g en eral los in d icad o res de tor n a so l o de p ú rp u ra d e b ro m o cre so l e stán in co rp o rad o s en la leche para m o strar u n a reacció n ácida.

Cocarboxilasa, co en zim a de la carb o x ila sa o p irú v ico d eshidrogenasa. E s u n p in m id in etiaz o l del ácido pirofosfórico.

Coloide, agregados de átom os o m o léculas en u n estado finam ente dividi do, dispersos en un m edio gaseoso, lí quido o sólido; no puede pasar a tra vés de un a m em brana sem iperm eable

Colonia, crecim iento visible (m acros có p ico ) de m icroorg anism os p o r lo general en un m edio sólido y de m a nera habitual proveniente de la m u lti plicación de un único m icroorganis m o; todos pertenecen a la p ro genie de u n a ú nica b acteria preexistente. Colonia, morfología de la, aspecto m acro scó p ico de las colonias bacte n a n a s en u n m ed io d e c rec im ie n to sólido: tam año, form a, consistencia, p ig m entación, o lo r y g rado de p ro li fera c ió n c o n stitu y en las p n n c ip a le s características observadas.

Codescarboxilasa, fo sfa to d e piridoxal; co en zim a de varias am in o á ci d o descarboxilasas.

Coloración, so lución de un co lo ran te o co lo ran tes utilizad a para im partirc o lo ra lo s m icroorganism os d e m o d o qu e ellos o sus co n stituyentes p u e d a n ser o b serv ad o s y d ifere n cia d o s p o r la m icroscopia.

Codificación genética, inform ación q u eresid een lo sp lásm id o s(ep iso m as) o en el cro m o so m a b acteriano y que d eterm in a ciertas características, c o m o la resisten cia a los antibióticos.

Colorante ácido, u n co lo ra n te que c o n siste en u n a g ru p am ie n to ácid o d e átom os (aniones), q ue es la parte activa d e la c o lo ra ció n , co m b in a d a con un m e ta l; tien e afinidad p o r e l ci

C o co , b acteria con fo rm a red o n d a o esférica.

toplasm a.

Colorante azo, u n grupo crom óforo b á sic o azo -N :N -. U n d eriv a d o d e l azo b en cen o e n e l cu al un anillo b e n c en o o n a fta le n o e s ta u n id o a c ad a átom o de nitrógeno. Colorante básico, un colo ran te que consiste en u n a ag rupación orgánica b ásica de átom os (cationes), la cual co n stitu y e la parte activa de la co lo ración, com b in ad a c o n un ácido, p o r lo gen eral inorgánico; tien e afinidad p o r los ácidos nucleicos. Colorante, m aterial u tilizado p a ra co lo rear o teñir, qu e co n siste en anillos de ben cen o co n gru p o s cro m ó fo ro y au x o cro m o .V éase A u xocrom o y C ro m óforo. Combinación, u n ió n de d o s o m ás sustancias para form ar una sustancia nueva, o u n a reacció n q uím ica en la cual dos elem entos se co m b in an p a ra fo rm ar un co m puesto binario o se c o m b in a n do s c o m p u e sto s b in ario s p a ra form ar un co m p u esto co m p le jo.

Complejo, c o m b in a c ió n re la tiv a m ente estab le de dos o m as co m p u e s tos en un a m o lécu la m ás grande. Compuesto diazo,com puestoquecontiene dos grupos azo: R -N :N -R -N :N R, que incluyen m uchos colorantes. C o m p u e s to hetero cíclico , com pues to cíclico cuyo sistem a de anillos con tiene elem entos distintos del carbono.

Compuesto inorgánico, u n c o m p u esto qu e no co n tien e m n g ú n c ar bono. Compuesto no saturado, co m p u es to o rg á n ic o q u e c o n tie n e lig a d u ra s dobles o triples y es capaz de fo rm ar pro d u cto s adicionales. C o m p u e s to o r g á n ic o , c o m p u e sto que co n tien e carbono, p a ra d ifere n ciarlo del co m p u esto que no c o n tie ne carb o n o (inorgánico).

Compuesto quinoide, estru ctu ra quin oide qu e contiene el grupo crom atofórico; u n p a raq u in o id e . V ease C ro m óforo.

Compuesto, una su stancia co m p u e s ta p o r do s o m ás e le m en to s un id o s q u ím icam ente en p roporciones defi nidas p o r el peso. Concentración de iones hidróge no, n ú m e ro de io n e s d e h id ró g e n o p o r un id ad de volum en de un a solu ción; se u tiliza p a ra in d icar la acidez

808

Apéndices

o la alcalin id ad de u n a so lución y se e x p resa co m o pH . P o r lo co m ú n se d esig n a co n el sím bolo [H +]. E l p H es el lo g a ritm o de la in v e rs a de la c o n c e n tra c ió n de io n es h id ró g e n o , p H = lo g 1/[H+],

Concentración, can tid ad de u n a sus ta n c ia q u e ex iste e n u n a u n id a d de v o lu m en , p o r ejem p lo , la m ed ic ió n d e u n a so lu c ió n e n m a s a de so luto p o r u n id ad d e m asa de solución, o la can tid ad de m oles o iones hidrógeno p o r u n id ad de v olum en o m asa.

Condensación, u n tip o de reacció n en el cu al dos o m ás m oléculas de la m is m a su sta n c ia se c o m b in a n p a ra fo rm ar un a sustan cia nueva con peso m o le c u la r m ás a lto y p ro p ie d a d e s q u ím icas d iferentes. Confirmatorio, que surge de una com p ro b ació n establecida con firm eza. Confluente (crecimiento), c rec i m iento bacteriano en el que las colo nias se superponen un as con otras y n o p u ed en ser tom adas co n éxito en fo rm a individual p ara los subcultivos.

Conjugado, fu sió n , u n id a d , p a r o u n ió n con ju n ta. L as p ro teín as c o n ju g ad as están u n id as a o tro s tip o s de m olécu las. L o s co m p u estos qu e co n tie n e n d o s o m ás lig a d u ra s d o b les, q u e altern an ligaduras sim ples y do b les se d e n o m in an co n ju g ad o s. E jem p lo s: C H ,= C H -C H = C H -C H 3. L as p ro teín as co n ju g ad as c o n tien en re si duos de am in o ácid o s m ás sustancias c o m o p ig m e n to s (c ro m o p ro teín a s), h id rato s de carbono, etc. L os co n ju g ad o s de lig ad u ras do b les tienen dos o m ás lig ad u ras do b les un id as entre sí p o r u n a lig ad u ra sim ple.

Conservante, sustancia que inhibe el crecim iento de m icroorganism os sinque necesariam ente los destruya; po r lo ge neral una sustancia que retrasa, im pide o enm ascara los cam bios no deseables.

Contador de centelleo (líquido), c en tellea d o s d ispositivo u tilizado p a ra d etectar y co n tar las partícu las ra diactivas.

Coordinación, acc ió n a rm o n io sa e in tegrada de varias p artes y procesos de u n organism o, prueba, etc.

Cultivo puro, u n cultivo q ue co n tie ne el crecim iento de un a ú n ica e sp e cie de bacterias.

Correlación, grado de, en trar o estar en re la ció n m utua.

Cultivo, u n crecim iento de m icro o r ganism os.

Cortar, d iv id ir en dos partes. Cristalización, c am b io d e l e stad o

Cultivos mixtos, crecim iento de dos o m ás m icroorganism os en el m ism o m edio.

disuelto, fundido, líq u id o o gaseoso a u n estado sólido de fo rm a ord en a d a y característica.

Cristaloide, qu e se p arece a un c ris tal o que es u n cristal; cuando e n so lu ció n p u ed e atravesar u n a m em b ra n a sem iperm eable. Cromático, p e rte n ec ien te a los c o lores.

Cromatografía en capa delgada (Thin Layer Chromatography (TLC)), cro m ato g rafía a través de un a cap a delg ad a de celu lo sa o m aterial in erte sim ilar ap o y ad a sobre un a p la c a de v id rio o p lástico . V éase C ro m atografía.

Cromatografía gaseosa, form ade cro m atografía en la cual la fase m óvil es un a m ezcla de gases o vapores que es tán separados sobre la base de su dife rente adsorción en un a fase estaciona ria (sólida). V éase C rom atografía. Cromatografía gas-líquido (GLC), ig u al qu e la cro m ato g rafía gaseosa, p ero la fase estacio n aria es líq u id a en lu g ar de sólida. V éan se C ro m ato g ra fía y C ro m ato g rafía gaseosa.

Cromatografía, a n á lisis de a b so r ció n ; se p a ra c ió n de su sta n c ia s q u í m icas y p artícu las sobre la b ase del m ovim iento d iferente a través de un siste m a b if ásico. P roceso analítico b a sad o e n d iferen cias en la v elo cid ad de d istrib u ció n de los co m p o n en tes de las m ezclas entre u n a fase m u tu a m ente in m iscib le m óvil y u n a fija. Cromóforo (cromatóforo), g ru p o q uím ico cu y a p re sen c ia o to rg a u n c o lo r e sp e c ífic o a u n c o m p u e sto y al cual se un e co n ciertos otros grupos (au x o cro m o s)p arafo rm arco lo ran tes. L o s grupos m ás com unes son quinoides, nitro y azo. V éase A uxocrom o.

Contaminación, tran sferencia de m i c ro o rg a n ism o s n o d e se a b le s a m e dio s de cultivo u otros m ateriales po r co n tacto directo.

to.

Continuidad, sucesión sin in terru p

Cromógeno, sustan cia que desarro

ción.

lla un p ro d u cto coloreado cuando se o x id a. V é a n se C ro m ó fo ro y A u x o crom o.

Control de calidad, reg ulación y co n tro l d el m an ten im ien to de un re ac ti vo, p ro ced im ien to , fu n ción, acción, etc., m ed ian te el uso de co n tro les po sitivos y negativos cono cidos.

Conversión, cam bio de u n isó m ero a otro o cam b io de u n a un id ad o siste m a de m ed id a a otro.

Cromogénico, p ro d u c to r de p ig m en

Cuajada, p ro teín a p recip itad a de la lech e que co n siste prin cip alm en te de caseína; p u ed e ser e l resu ltad o de la coag u lació n p o r un ácido o de la re ac c ió n d e l c u a jo . V é a n s e Q u im o sin a del cuajo y C o águlo ácido.

Cultivo-stock, c u ltiv o de m ic ro o r g a n is m o s m an te n id o c o m o re se rv a p a ra su uso futuro, esp ecies co n o ci das m antenidas e n e l lab oratorio. Se u tiliza p a ra co n tro l de calid ad y para otras p ruebas y estudios. Cúpula, fo rm a de taza o e stru ctu ra tip o bóveda. Curvade crecimiento, representación gráfica del crecim iento (cam bios poblacionales) de las bacterias en las fa ses de u n m edio de cultivo: fase de re tardo, fase logarítm ica o exponencial, estacionaria y fasg de declinación o m uerte. V éase Fase de retardo y F a se logarítm ica para m ás detalle. Cutáneo, relacio n ad o con la piel, d-, sím bolo qu e significa dextrorrotatorio. L os m on o sacárid o s y d isacá ridos son ópticam en te activos; es d e cir, ro tan e l p lan o de la luz p o lariza da. L os qu e ro tan h a cia la derech a se dice qu e son dextrorrotatorios.

Degradación, ru p tu ra en m oléculas o com p o n en tes m ás sim ples.

Densidad óptica (DO), can tid ad de luz a b s o rb id a e n c o lo rim e tría y en fotom etría.

Densidad relativa (specific gravity), Peso específico, re la ció n d el p eso de u n v o lu m e n d a d o de u n a su sta n c ia co n el p eso de u n volum en ig u al de agua.

Densidad, m asa p o r un id ad de volu m en.

Derivado proteico, su sta n c ia d e ri v ad a de p ro teín as sim ples y co n ju g a das p o r h id ró lisis o d e s n a tu ra liz a ción. In clu y e pro teín as p arcialm ente hid ro lizad as com o proteosas, pep to nas y p é p tid o s. U n ej em p lo de u n a p ro teín a desn atu ralizad a es u n proteico.

Derivado, com puesto, p o r lo general orgánico, o b tenido de o tro co m p u es to p o r u n pro ceso q u ím ico sim ple; el co m p u esto orgánico que contiene un ra d ic al estructural sim ilar a aquel del cu al proviene.

Desabsorción, in v crsad ela absorción; evolución o liberación de un a sustan cia volátil a partir de un a solución.

Desaminación reductiva, hidrólisis de a m in as y e lim in a c ió n d el g rupo am ino.

Glosario 809 Desanimación, p ro ceso de elim in a ció n d el g ru p o am ino (N H 2) de u n am i noácido. Desaminasa, e n z im a q u e q u ita un g ru p o am in o (-N H 2) d e u n a m o lécu la co n la lib eració n resu ltan te de am o n íaco (N H 3).

Desasimilación, tam b ién d en o m in a d a catab o lism o . V éase C atabolism o.

Descarboxilación, p ro ceso de re m o ció n del C 0 2 d e un ácido carboxílico (-C O O H ), co n la e lim in ació n del g ru p o carboxilo.

Descarboxilasa(s), e n zim a que lib e ra C 0 2 del g rupo carb o x ilo (-C O O H ) de u n a m o lécu la, p o r ejem plo, de un am inoácido. Descomposición, p ro c e s o d e d e s co m p o sició n de u n a su stan cia en su s tan cias m ás sim ples. Desecado, desecación, seco, secado. Desecador, dispositivo p a ra las su s tan cias secantes; p o r ejem plo, frasco d e v id rio cerra d o q u e c o n tie n e u n a su stan cia d elicuescente.

Desecante, agen te secante; u n d e se c a n te q u ím ic o a c tú a p o r a b so rc ió n (es decir, re ac cio n a co n ag ua) y un d esecan te físico actú a p o r adsorción (p. ej., K O H , C aC ]2).

Desfibrinado, elim in ació n de fib ri n a de la sangre.

Deshidratado, elim in ació n d e agua. P o r lo g en eral se refiere a m ed io s de cultivo que pu ed en ser reco nstituidos p o r e l agregado de agua. V éase Re constituir.

Deshidrogenación, e lim in a ció n de h id ró g en o de una m olécula. Deshidrogenasas, en zim as de p ro teí nas co n ju g ad as que p o seen actividad de o x id ació n deb id o a sus gru p o s p ro s tético s, p o r eje m p lo , N A D , NADE, F M N y FA D ; efectú an la oxidación de u n su strato p o r la acep tació n o la tra n s fe re n c ia d e h id ró g e n o p o r r e d u cció n u ox id ació n alternadas. V éa se G ru p o p rostético.

Desmineralizar, e lim in a r m in e ra les; p o r ejem p lo , ag u a d e sm in e rali z ad a u tilizad a p ara p re p ara r m edios de cultiv o b acterianos.

Desmolasa, e n zim a in v o lu c rad a en la ru p tu ra de u n a cad en a de carbono; p o r ejem p lo , (1-ceto carboxilasa, am i n o ácid o descarb o x ilasa, cim ohexasas y aldolasas.

Desnaturalizado, adulterado o inade cu ad o p a ra el consum o, com o el alco hol. L os cam bios p u ed en ser físico s, q u ím ico s o b io ló g ico s, c o m o el au m en to de la digestibilidad, la pérdida

de la actividad enzim ática, los cam bios e n las características inm unológicas. A m enudo no h ay cam bios en el p eso m olecular. E n algunos casos el pro ceso p u ed e revertirse. C uando las proteínas se desnatura] izan, se ro m pen las u niones de hid ró g en o y otras ligaduras subsidiarias.

Desnitrificación, pro ceso anaerobio p o r el q ue las b acterias d esn itrifican tes red u cen los nitratos ( - N 0 3) a n i tritos ( - N 0 2) lib eran d o nitró g en o li b re (N 2) y am o n ía co (N H 3) ,a la a t m ósfera p o r reducción. E s u n p roceso inverso a la nitrificación.

Diastasa, té rm in o a n tig u o . V é a s e A m ilasa.

Diastereoisómero, isó m e ro cu y as m oléculas están en p arte superp u es tas y e n p arte en im ágenes esp e cu la re s d e las o tra s . V é a n s e Isó m e ro s, Isom erización.

D iazonico, sal, r a d ic a l d iv a le n te -N :N - u tilizado p a ra fo rm ar co lo ran tes azo p o r el acoplam iento co n co m p u esto s fenólicos nativos o p o r el aco p la m ie n to e n z im á tic o c o n e l c o m p u e sto b e n c e n o lib e ra d o . E l tip o general es

Desoxirribosa, D -2 -d e so x irrib o s a , C H 2O H C H O H -C H O H C H 2 C H O . U n h id rato de carb o n o p e n to sa co n s titu y e n te d e l á c id o d e so x irrib o n u cleico (D N A ). V éase A cido desoxirribonucleico.

Despolimerizar, despolimerización, destrucción, n eu tralizació n o cam bio en la d irecció n de la polaridad.

Detergente, a g en tep u rifica d o ro lim p iad o r qu e d estru y e o d añ a la o rg a n iza ció n estru ctu ral de la célu la p o r qu e a fecta la función d e su m em b ra n a sem ip erm eab le. E s h id ro so lu b le o lip o so lu b le y a y u d a a hum edecer, d isp e rsa r o pro d u c ir la sep aració n de p a rtícu la s sólidas.

Dextrán, u n po lisacárid o (polím ero d e la g lu c o s a ) fo rm ad o fu e ra d e la célula p o r la actividad e n zim ática de ciertas b acterias. E stá unido p o r e n laces 1,6 -glucosídicos.

Dextrina, g o m a de alm idón, am ilina; hidrato de carbono in term ed io e n tre el alm id ó n y los azúcares p ro d u cidos a p a rtir d el alm id ó n p o r h id ró lisis; de c o lo r ro ji*zo co n el y o d o y no ferm en tab le, p ero se convierte e n m al to sa y glucosa.

Dextrosa (glucosa), v éase G lucosa. Diacetil-, prefijo que indica la presen cia de J o s radicales acetilo (C H 3C O ). D iceto b u tan o -C H 3C O C O C H 3.

Diagnóstico presuntivo, diagnóstico inicial, tentativo, de u n a enferm edad basad o en las evidencias clínicas y a m en u d o ta m b ié n en el p rim e r paso d e l a isla m ie n to b a c te ria n o y d e re su ltados d e las pruebas. D eb en re ali zarse estu d io s m ás ex tensos p a ra la confirm ación.

Diamida, am ida d erivada de ácidos orgánicos en los cuales el g rupo hi ro x ilo (-O H ) fue reem p lazad o p o r el g rupo am ino (N H 2). L a fó rm u la g e n eral p a ra la am ida prim aria: R -C O N H 2; la diam id.i co n tien e dos grupos n h 2, n h 2- o - n h 2.

Dibásico, ácido que lib era dos io n e 5 de hidrógeno.

Iílfosíopiridma,. ieleótidode, (DPN); v é a s e N ic o tin a m id a a d e n in a d in u c le ó tid o (N A D ); ta m b ié n c o n o cid o com o co en zim a I, co zim asa y codeshidrogenasa. E l D P N es la co en zim a de la apozim asa, un co m p u esto aisla do de las levaduras qu e co n siste en rad icales de niacin am id a, ribosa, dos u n idades d e ácido fosfórico, rib o sa y adenina.

Difundir, disem inar, esparcir. Difusión, pro ceso en el que se m ez clan m oléculas diferentes; rá p id a en los gases, m ás len ta en los líq u id o s y m uy len ta e n los sólidos.

Digestión, proceso p o r el cual un nutrienteesdesintegradoenm oléculas so lubles sim ples, lobastantepequeñas co m o para atravesar la p ared celular.

Dilución, p ro c eso d e au m en tar la p ro p o rc ió n de so lvente a soluto en c u al quier solución p o re l agregado delm ism o u otro solvente m iscible. A m e n u d o u tiliz a d a p a ra e x p re s a r la can tid ad de soluto p o r u n id ad de v o lu m en d e solución. E l so luto p u ed e re p re s e n ta r las c é lu la s b a cteria n as. A n tó n im o (o p u e sto ) d e c o n c e n tra ción. V éase C oncentración. Diluyente, líq u id o u tilizado p a ra di lu ir o h acer m ás d éb il otro líquido.

Diplococos, co co s q ue se d isp o n e n de a p ares, p o r ejem plo, Streptococ cuspneumoniae (antes clasificado c o m o Diplococcus pneumoniae).

Disacárido, a zú car que p o r h id ró li sis p ro d u ce dos m oléculas de azú car sim ple; c o m p u esto de do s m o n o sacáridos. F ó rm u la general: C 12H 220 ! ,.

Discernible, p erceptible; evidente. Disco, p a p e l p la n o c irc u la r, p o r lo general de 6 cm de diám etro, iropreg-

810

Apéndices

n ad o co n u n reactivo q uím ico, u tili zad o p ara d eterm in ar la sensibilidad b io q u ím ica o antibiótica. V éase Im pregnado.

Diseminar, esp arcir o distribuir. Disgónico, d e crecim iento d eficien te (u tiliza d o p a ra d e sc rib ir cultivos bacterian o s).

aplicación de u n po ten cial eléctrico.

rim ien to s especiales de cultivo.

Electrón, p a rtícu la ató m ica que lle

Ensayo, p ru e b a de p u re z a p a ra d e

va un a carga negativa co n un a m asa 1/837 del átom o de hid ró g en o (pro tón). L o calizad o en las capas del elec tró n o n iv eles de e n e rg ía fu e ra d el núcleo.

term in ar com p o n en tes p o r análisis.

Electronegativo, que atrae e le ctro

Dismutación, p ro ceso en el cu al un a

nes.

su sta n c ia eso x id a d a y red u c id a d e m a n era sim ultánea; cam b io de u na su s tan cia en dos.

Electrones, sistema de transporte de, secu en cia de reaccio n es enzim á-

Disociación, ruptura física de u n a m o lécula; la m olécula se divide en m olé culas m ás sim ples, m enos com plejas.

Disociado, sep arad o ; d e g rad ad o en co n stitu y en tes m ás sim ples p o r m é to d o s c o m o la io n izació n . T am bién u tilizad o p a ra d escrib ir subcepas o ri g in ad as de cepas b acterianas puras.

Disolución, desin teg ración; desag re gación; autólisis.

Disperso, dispersión, e sp a rc ir; di lu ir; cau sar la d esap arición de algo.

Divalente, que p osee dos valencias. DL,-isómero, m ezcla racé m ic a; un co m p lejo m o lecu lar de p artes ig u a les de las fo rm as D y L , o rig in a d o d u ran te la síntesis q uím ica. L a racem iz a c ió n de a m in o á cid o s o c u rre cu an d o las p ro teín as so n h id ro liz adas en p resen cia de u n álcali. V éan se d-, dextro rro tato rio y 1-, levorrotatorio.

Ebullición, punto de, tem p eratu ra a la cu al la p resió n de v apor de un lí q u id o se ig u a la co n la te m p e ra tu ra atm o sférica am biente (que lo rodea). Efervescencia, escape de gas de un líq u id o d eb id o a la p resió n dism in u i d a o a la tem p eratu ra elevada.

Efervescente, exh ib e burbujeo deb i d o al escap e de gas, sin ebullición. Elaborar, hacer, crear, producir. Electroforesis en gel de campo pul sado (PFGE), tipo e sp ecializad o de an álisis de R F L P (polim orfism os de lo n g itu d es d e lo s frag m entos de re s tricció n ); u n a técn ica d estin ad a a la am p lificación.

ticas que m ed ian entre la oxidación de u n sustrato y la re d u cc ió n del o xí geno.

Elemento, u n a de m uchas form as fu n dam entales de la m ateria que no p u e de d egradarse en sustancias m ás sim ples p o r m étodos quím icos h ab itu a les.

Elución, sep aració n de un sólido de o tro p o r la v a d o o e lim in a c ió n , p o r m edio de un solvente apropiado, de u n m aterial de otro que es insoluble en ese solvente.

Emulsión, d isp ersió n coloidal de un líquido en otro líquido.

Enantiomorfo, cristal que tien e otro cristal com o u n a im a g e n especular; sustan cia activa ó p ticam en te o pues ta; p o r ejem plo, form as dextrógira y levógira.

Entérico, perten ecien te a los in testi nos.

Enterobacteriaceae, clasificación de la fam ilia de bacilo s entéricos gram negativos qu e no fo rm an esporas y a cu y a to talid ad de m iem bros ferm enta n la glucosa. D esarrollan b ien e n m e dios de cultivo a rtificiales, fo rm an á ci do o ácido y gas a p a rtir de la g lu co sa, re d u ce n los nitratos, son m óviles o in m ó v iles y no p ro d u cen oxidasa. P o r lo co m ú n se d e n o m in a n b a c te rias entéricas. V éase E ntérico.

Enterococos, el g ru p o de m ic ro o r ganism os encontrados en los in te sti nos; co cos gram positivos dispuestos de a pares, aislados o en cadenas c o r tas; gén ero E nterococcus.

Enterotoxina, citotoxinaespecíficapara las células de la m ucosa intestinal.

Enzima constitutiva, e n z im a p ro d u c id a p o r la c élu la in d ep e n d ien te m ente de la co m p osición del m edio en el cual crece; no d ep en d e del su s trato p a ra su form ación.

Enzima de adaptación (inducida),

pro d u cid o den tro d el m icroorganism o o en un a de sus partes.

u n a e n zim a cu y a p ro d u cció n re q u ie re o se e stim u la d e m a n e ra n o tab le p o r u n a m o lé c u la e sp e cífic a , e l in ductor, el cu al es el sustrato de la e n zim a o u n co m p u esto co n estru ctu ra sim ilar a él. E l térm in o preferid o es el de e n zim a inducida; el in d u cto r es el co m p u esto co n estru ctu ra sim ilar re sp o n sa b le de ev o car la fo rm ació n de la enzim a.

Endonucleasa, n ucleasa que cliva los

Enzima extracelular, e n zim a e x cre

Endoenzima, e n zim a que es lib era da sólo cuando ocu rre la desin teg ra ció n de la célula que la produce. V é a se E n zim a intracelular.

Endógeno, endogénico, orig in ad o o

polinucleótidos (ácidos nucleicos) en las uniones internas, lo que produce fragm entos de polinucleótidos y oligonucleótidos de diversos tam años.

tad a en el am biente. U n a en zim a que p u e d e a is la rse c o n fa c ilid a d de las célu las vivas. T am bién d e n o m in ad a exoenzim a.

Energía, cap acid ad de trab ajo en tér m in o s de calor, luz, eléctricos, cin é ticos, quím icos o nucleares. L a u n i dad pa ra m ed ir la energía caló rica es la caloría. L a energía qu ím ica es p ro d u cid a p o r la o x id ac ió n de m uchos co m puestos diferentes.

que cataliza las reaccio n es dentro de la célu la viva. T am bién d en om inada endoenzim a.

Enzima inducida, v éase E n zim a de adaptación.

Enzima intracelular, u n a e n z im a

Enolasa, u n a en zim a qu e perten ece

Enzima proteolítica, e n zim a qu e hi-

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), técn ica p a ra el an áli

a las hid rasas q ue actú a sobre el á ci do 2 -fo sfoglicérico p a ra fo rm ar á ci do f6 sfo pirúvico y agua.

sis de p ro teín as solubles de las c élu las enteras.

Enriquecimientos, sustancias com o

d ro liz a las p ro te ín a s e n p ro te o s a s , p ep tonas, etc. U n a e n zim a exocelular segregada p o r m uchas bacterias p a ra d eg rad ar las proteínas.

Electroforesis, m ig ra ció n de p a rtí cu las suspendidas en u n cam po eléc trico; en p articular, la separación crom ato g ráfic a acelerad a de co m p u e s to s p o r la in m ersió n de c ad a extrem o d el m ed io en u n e lectró lito y p o r la

los factores de crecim iento (X y V ), las vitam inas o los m ateriales com o la sangre agregadas a los m edios de cu ltiv o p a ra fa v o re c er el cu ltiv o de lo s m ic ro o rg a n ism o s c o n re q u e ri m ie n to s e sp e c ia le s de crec im ien to . V éase M ic ro o rg an ism o s co n re q u e

Enzima respiratoria, en zim a qu e es p a rte d e l siste m a d e o x id a c ió n -re d u c ció n ; in v o lu c rad a e n la transfe* re n c ia de electro n es e lim in ad o s del oxígeno.

Enzima, u n catalizad o r orgánico p ro teico, pro d u cid o p o r u n a célu la viva

Glosario y c a p a z d e in flu ir e n u n a re a c c ió n q u ím ica sin su frir u n cam b io estru c tu ral (alteració n ) en la reacción. L as en zim as m ed ian to d o s los p ro ceso s m etab ó lico s.

Eosina, sal só d ica de d ib ro m o d in itro flu o re sc eín a , U tilizad a co m o co lo ran te y com o in h ib id o r d e l c rec im ien to d e alg u n o s m icro o rg an ism o s cu n d o se in co rp o r a e n lo s m ed io s d e c u ltiv o . S e d i su e lv e c o n ra p id e z e n e l a g u a, co n flu o rescen cia verde. T am bién es so lu b le en alcohol.

com p o n en tes c o n la a y u d a de un p ris m a o retícula.

n o p a rap ro d u c irp la sm in a , lo cu a l cau sa la licu efacció n de la fibrina.

Espectrometría, m ed ició n de la lo n

Estreptococos del grupo D, a q u e

g itu d d e o n d a d e líneas o ban d as en u n e sp e c tro e id e n tific a c ió n d e los elem entos qu e las producen.

llo s m ie m b ro s d e l g é n e ro S tre p to c o c c u s q u e p o se e n e l a n tíg e n o d e l g rupo D de L ancefield, u n p o lisacárid o C específico contenido en la p a re d celular.

Espontáneo, voluntario; que ocurre sin in flu en cia extem a.

Espora, célu la rep ro d u ctiv a de b a c terias, hon g o s o pro to zo ario s; en las b a c te ria s, p u e d e n se r fo rm a s re s is ten tes inactivas den tro d e la célula.

Espuma (caldo), véase P elícula.

Epímero, epimérico, anóm ero; una

Estable, fijo; resisten te al cam bio.

d e d o s m o lé c u la s q u e sólo d ifie ren e n la d isp o sició n esp acial cerca de un ú n ico áto m o de carbono. V éase tam b ién A nóm ero.

E stafilo cin asa(S f),u n ap ro tein asaco n acción sim ilar a la urocinasa y a la estreptocinasa. V éase E streptocinasa.

Episoma, clase de elem en to s gen éti cos e n las b acterias q u e pu ed en ex is tir co m o en tid ad es au tó nom as q ue se rep lican de m an era in d ep en d ien te del cro m o so m a b acterian o o com o parte d el c ro m o so m a b acterian o y que se m u ltip lican co n él.

Equimolecular, d e n o ta so lu c io n e s q u e c o n tie n e n u n n ú m e ro ig u a l de m olécu las.

Equívoco (resultado), qu e tien e dos o m ás significados, am biguo. In cier to co m o u n a in d icació n o signo; du doso. U tilizad o a v eces en el registro de lo s resu ltad o s b io q u ím icos; signi fica resu ltad o .

Eritrocito, v éase G ló b ulo rojo. Eritrosa, u n m o n o sacárid o d e cuatro carb o n o s; u n a tetrosa.

Escatol, P -m etilindol, C 8H 6N _ C H 3, u n p ro d u c to d e c ie rto tip o de d e s c o m p o sic ió n b a cteria n a de las p ro teínas.

Estafilocoagulasa, véase C oagulasa. Estafilotrombina, v éase T rom bina.

Estándares terciarios, cu an d o un a so lu ció n es titu lad a c o n tra otra.

Estequiometría, de manera estequiométrica, térm in o s re fe re n te s a las relacio n es d e p eso e n las fó rm u las y ecu acio n es quím icas.

Ester, co m p u esto orgánico form ado p o r u n a reacció n entre u n ácido y un alcohol. D erivado ácido. F ó rm u la ge neral R -C O -O -R ’.

Esterasa, u n a d e u n g rupo de en zi m as den o m in ad as h id ro lasas, las cu a les h id ro lizan los ésteres.

Estereoisomerismo, fen ó m en o m o s

Esfingomielina, fo sfo líp id o q ue p o r

Estereoisómeros, c o m p u e sto s qu e

h id ró lisis p ro d u ce ácid os grasos, áci do fo sfó rico , co lin a y el am inoalcoh o l esfingosina. h o l; constitu y en te d é lo s cerebrósidos.

p re sen ta n la m ism a fó rm u la m o lecu la r y la m is m a fó rm u la e stru c tu ra l p ero d ifieren en su orien tació n esp a cial. V éanse Isó m ero s geom étricos e Isóm eros ópticos.

Especie, identificación de, d e te rm i

Estéril, esterilidad, lib re d e m ic ro o r

n ació n de las esp ecies de u n org an is m o de g én ero conocido.

gan ism o s vivos y sus productos; e s tad o de ser estéril.

Especie, u n tip o d e m icroorganism o;

Esterilización, p ro c e s o q u ím ic o o

u n a u n id ad d e clasificación e n la ta xon o m ía; u n a subdivisión de u n g é nero. E l n om bre d e la esp ecie no se e scrib e co n m ay ú scu la in icial, pero sí e n itá lic a o sub ray ad o; p o r ejem p lo , Escherichia (g én ero ) cotí (esp e cie); Escherichia coli.

físico p a ra m ata r todos los m ic ro o r g an ism o s, p o r lo co m ú n p o r m ed io d el calor.

Espectro, lu z sep arad a en sus partes

altera las m em branas d e los e ritro ci tos y a fecta la p erm eab ilid ad d e las m em b ran as; aso c ia d a c o n o rganelas subcelulares.

Estroma, m e m b ra n a d e l e ritro c ito c o m p u esta po r m oléculas lipoproteicas disp u estas en u n a cu b ierta bim olecular.

Estructura pirrol, C 4H 5N ; co m p u es to h e te ro cíc lic o c o n u n a n illo azol. C u an d o se c a lien ta e n p re sen c ia de u n ácido fo rm a un precip itad o rojo. H

calid ad o cantidad; su stancia u tiliza d a p a ra estab lecer la p o ten cia de so lu ciones volum étricas.

acetal d e u n m o n o sacárid o sim ple.

Esfingosina, co m p lejo de am inoalco-

Estreptolisina O (SO), c ito lis in a ;

Estándar, u n a fo rm a e stab lecid a de

trado p o r co m puestos ópticam en te ac tivos que p re sen ta n d iferentes d isp o sic io n e s e sp a c ia le s d e su s áto m o s; p o r ejem plo, D - y L. V éase Isom erización.

Escofina, u n glucó sid o ; un derivado

811

Estreptocinasa, fibrinolisina; un aen z im a ex tra ce lu la r e n co n trad a e n los cultivos de ciertas cepas d e estrep to cocos hem o lítico s qu e p u ed e Usar la fib rin a h um ana. CUva e l p lasm inóge-

E ta n o l, véase A lco h o l etílico.

Eter, ó xido orgánico; dos rad icales al q uilo un id o s a u n áto m o de u n ox íg e no. F ó rm u la general: R -O -R .

Etilendiaminotetraacetato(EDTA), ta m b ién d e n o m in a d o ácid o se c u es trador. U n an tip ro o x id an te q ue “ se cuestra” el agente m etálico oxidativo que aum enta la susceptibilidad de las grasas a la oxidación. U n anticoagu la n te q u e p ro d u c e la q u e la c ió n d el calcio iónico y en con secu en cia in h i be la form ación d e coágulos sanguí neos. E l nom bre com ercial es Versene. V éase A gente quelante.

Eugónico, describe el cultivo b acte riano que crece de m anera exuberante.

Exocelular, p ro d u c id o f u e ra d e la célula, e n e l am biente circundante.

Exoenzima, v éase E n zim a e x trace lular.

Exonucleasa, n u cleasa qu e lib e ra un nu cleó tid o po r vez, e n fo rm a seriada, co m enzando en un ex trem o d e u n polinu cleó tid o (ácido nucleico).

Exopeptidasa, u n a e n zim a qu e cata liz a la hid ró lisis d el am inoácido ter m in al d e u n a c a d e n a p e p tíd ica ; p o r ejem plo, carboxipeptidasa.

Extendido, frotis; p rep aració n en un portaobj eto de v id rio o en un cu b reo b je to de un a cap a d elg ad a de m aterial p a ra la observación m icroscópica. Extracelular, fu e ra de la célula. Extracto de carne, u n extracto de car ne que contiene com ponentes m inera

812

Apéndices

les solubles utilizado en la preparación de m edios de cultivo com o el caldo nu tritivo.

Fenotipo, sum a total de las caracterís

Filtración, pro ceso d e sep arar las p a r

ticas expresadas, tanto externas com o intem as (tam año, color, form a, etc.).

tícu las suspendidas de u n líq u id o p o r m edio de un m edio poroso.

Exudado, rezu m ad u ra o salid a g ra

Fermentación tormentosa, reacción

Filtrado, u n líquido qu e pasa a tra

dual a través d e los tejidos; p o r ejem plo, líq u id o o sem isó lido q ue p u ede fo rm ar co stras o p u ed e infectarse.

e n leche torn aso lad a m arcad a p o r la ruptura; característica de Clostridium perfringens. E l grum o fo rm ad o con anterioridad p o re lm icro o rg a n ism o se ro m p e p o r la p resió n del gas p ro d u cid o p o r el m icro o rg an ism o , lo qu e o torga a la leche gru m o sa u n aspecto turbulento y espum ante.

v és de un filtro.

Facultativo, cap acid ad de h acer a l g o au n q u e n o se h ace de m an era h a b itu a l; p o r eje m p lo , lo s a n ae ro b io s facultativos p u ed en viv ir en ausencia d e o x íg e n o a tm o sfé ric o p e ro n o lo h acen de m an era hab itual.

fa*gocito, c élu laq u e in g ie re bacterias, p artícu las extrañas u o tras células.

Fahrenheit, e sc a la de te m p e ra tu ra en la q u e 3 2 °F es el p u n to de c o n g e lació n d e l ag u a y 2 1 2 °F es e l p unto d e ebullición.

Fase de retardo, seg u nda fase de la cu rv a d e c recim ien to d esp u és de la in o cu lació n b acterian a; fase e n la que la velo cid ad de m u ltip licación aum en ta con el tiem p o . N o h ay m arcad o au m en to en la can tid ad de b acterias, si b ien ex iste u n aum en to co n sid erab le e n el tam añ o celular.

Fase estacionaria, etap a en el ciclo d e crecim ien to de u n cultivo b a cte ria n o c u a n d o la p o b la c ió n c e lu la r ig u ala a la p o b lació n de m uertes.

Fase logarítmica, tam b ién d e n o m i n a d a fase e x p o n e n c ia l. P e río d o en la c u rv a de crec im ien to c u an d o o c u rre la m u ltip lic ac ió n m ás rá p id a de las b a cteria s. El tie m p o de g e n e ra c ió n (tiem p o re q u erid o p a ra fo rm ar d o s c é lu la s h ija s) p u e d e se r c o rto , a lre d e d o r d e 2 0 m in p a ra Escheri chia coli, o m ás p ro lo n g ad o , c erc a d e 6 0 -8 0 m in p a ra Lactobacillus aci

dophilus. Fase, u n a e ta p a de crecim ien to o d e clin ació n d e u n a po b lació n bacteria na; su stan ciah o m o g én ea sólida, líq u i d a o g a se o sa q u e e x is te c o m o u n a p o rc ió n d istin ta y sep arad a p o r m e d io s m ecán ico s de u n sistem a h etero géneo.

Fenilo, ra d ic al C6H 5- del b en cen o o fenol.

Fenol, ácido carbólico; C 5H 5O H . U n d e sin fe c ta n te g e n era l; c o m p o n e n te al 5% d e lo s antisépticos.

Fenol ftalcína, c o m p u esto ob ten id o p o r a cc ió n del fen o l so b re e l ácido itálico ; un anhíd rid o ; u tilizad o com o u n in d icad o r d e los iones hidrógeno.

Fermentación, ox id ació n de a zú ca res y otros co m puestos orgánicos m e d iad a p o r enzim as secretadas p o r m i c ro o rg a n ism o s u o tras c élu las p a ra d eg radar los sustratos a alcohol y d ió xido de carbono; u n pro ceso an aero bio. O x id ació n in co m p leta en la que el o x íg en o g a se o so n o e stá in v o lu crado. L a fe rm e n ta c ió n p ro d u c e un ren d im ien to de en erg ía alto.

Fermentador heteroláctico, m i croorganism o que fe rm e n ta la g lu co sa a co m puestos com o el ácido acé tico y el dió x id o de carbono a sí c o m o el á cid o láctico.

Fermentador hom*oláctico, m i croorganism o que pro d u ce ácido lác tico casi en la m ism a can tid ad a p a r tir del azúcar.

Fibrina, p ro teín a in so lu b le form ada du ran te la c o ag u lació n de la sangre p o r la u n ió n de la tro m b in a y el fibrinógeno. L a fib rin a fo rm a la po rció n esen cial del co ág u lo sanguíneo.

Fibrinógeno, p ro te ín a d e l p la s m a m u y p o c o so lu b le ; u n a g lo b u lin a . E x iste e n sangre y e n otros líquidos anim ales. E l fib rinógeno se convier te e n un po lím ero in soluble, la fib ri na, p a ra fo rm ar un coágulo. E l fib ri nóg en o in ic ia su tran sfo rm ació n g ra cias a la e n zim a tro m b in a fo rm ad a a partir d e la pro e n zim a protrom bina.

Fibrinolisina, su s ta n c ia p ro d u c id a p o r ciertas bacterias (sobre to d o e s tre p to c o c o s h e m o lític o s d e l g ru p o A ), la cu al p u ed e p ro d u c ir la lic u e fa cc ió n de los co ág u lo s d el p lasm a sanguíneo o de los co águlos de fib ri na; disuelve o d estruye lafibrina. T am b ién d e n o m in ad a estreptocinasa, Fibrinólisis, d estrucción enzim ática

Filtro bacteriano, un filtro utilizado para sep arar las b acterias de u n m e d io líquido.

Filtro de membrana, u n disco d e nitro ce lu lo sa co n p o ro sid a d un ifo rm e de 0,03-3 m m utilizad o para la filtra ción m icrobiológica. Filtro Millipore, v é a s e F iltro de m em brana.

Filtros Seitz, u n filtro de d isc o de am ianto so sten id o en p o sición p o rm e dio de un recip ien te especial; u tiliza do p a ra la filtración bacteriana, sobre todo de m edios de cultivo.

Flagelo, exten sió n fina, flexible, de tip o p ilo so d e c iertas b acterias, qu e es el órgano d e lo co m o ció n (m ovili dad). P u ede estar adherido a un o o a am bos extrem os de un m icro o rg an is m o o p u e d en estar d ispuestos e n to d a la superficie b acteriana. S e o rig i n a den tro d e la célu la p ero se extien de p o r fu e ra de la m ism a.

Flavinaadenmadinucleótido(FAD), isoaloxazina adenina dinucleótido que c o n sta d e u n a u n id ad d e rib o flav in a (vitam ina B 2) y un a unidad de difosfa to de ad en o sin a (A D P). E l co m p u e s to in terv ien e en los sistem as enzim áticos de oxid ació n -red u cció n y es im p o rta n te e n e l m e ta b o lism o de aquellos m icroorganism os q ue c are cen del siste m a d e c ito c ro m o . U n a coenzim a.

Flavina mononucleótido (FMN), fo sfato de riboflavina. U n sistem a de tres anillos; la iso alo x azin a se une al alco h o l co rresp o n d ien te de la rib o sa (ribitol) qu e a su vez e stá fosforilado. U n a coenzim a.

Flavoproteínas, en zim as re sp ira to rias qu e co n tien en F M N o FA D c o m o co enzim as. V éan se F lav in a ad e nin a dinucleótido (FA D ) y flav in a m o nonu cleó tid o (FM N ). Floculación, fo rm ació n de u n p re ci p itad o gru eso a p a rtir de u n a susp en sión de p artícu las finas.

de la fib rin a e n la sangre coagulada, lo qu e pro d u ce la d iso lu ció n del coá gulo.

Floculo, ag rupación de p eq ueñas m a

Filamentoso, c ara cte riz ad o p o r e s

Fluoreno, u n a de las tres c lases de

tru cturas largas, filiform es.

c o lo ra n te s d e riv a d o s d e l x a n te n o ; am inoxanteno. V éase X anteno.

Fenómeno, u n sín to m a u ocu rren cia

Filiforme, d e sc rib e el c re c im ie n to

de c u alq u ier clase, y a sea ord in ario (h ab itu al) o extrao rd in ario (no h a b i tu al), resp ecto de u n a enferm edad.

en un a estría o e n un cultivo p o r p u n ció n qu e es un ifo rm e a lo largo d e las líneas de inoculación.

sas ad herentes de b acterias e n un lí quido.

Fluoresceína, p ig m e n to flu o rescen te qu e otorga c o lo r (ftaleína) a u n m i cro organism o vivo; u n co lo r flúores-

Glosario cente, am arillo verdoso, hidrosoluble, q u e d ifu n d e lib re m en te. P ro d u c id o p o r ciertas b acterias.

Fragmento, porción aislada pequeña. Furanosa, azú car que p o see un a n i llo fu ran o co m o la y-glucosa.

813

tien e hem o g lo b in a y tran sp o rta o x í g en o c o m o o x ih em o g lo b in a a otras células.

Fluorescencia, e m isió n d e lu z (no

Glucano, p o liglucosa; p o r ejem plo,

reflejad a) p o r un a su stancia bajo ilu m in ació n ; lu z transm itida.

alm idón, celulosa, am ilo sa del alm i d ó n y glu có g en o d e la am ilosa.

Fluorescente, que p o see u n co lo r po r la lu z tran sm itid a y otro p o r la luz re flejada.

Fli íoruro de sodio, u n an tico ag u lan te y c o n serv an te. C o m o a n tic o a g u lante, fo rm a u n co m p lejo de fluoruro de calcio n o io n izad o que im p id e la co agulación.

Fondo, p orción m ás in ferior de un tu bo en pico d e flauta con m edio de agar; p o rció n inferior del pico de flauta.

Formazán, el p ro d u cto de la red u c ció n d e l c lo ru ro d e 2 ,3 ,5 -trife n iltetraz o lio (T T C ); u n p ig m e n to h id ro soluble d e co lo r in ten so (rojo).

Fórmula estructural, fó rm u la que

Fusiforme, en form a de huso, com o el anaerobio

Fusobacterium nucleatum.

Fusión, punto de, tem peratura alacu al el estado sólido y el estado líquido de un a sustancia están en equilibrio.

Galactosidasa, e n zim a que cataliza e l fraccio n am ien to d e galactósidos.

Galactósido, u n glucósido, (3-galactó sido-lactosa, que co n tien e el h id ra to d e c a rb o n o g a la c to sa ; g lu có sid o de galactosa. Gammaglobulina

(y-globulina),

fracció n de las p ro teín as séricas. C o n tien e la m áx im a con cen tració n de an ticu erp o s específicos.

m u estra la d isp o sició n de los átom os de u n a m olécula.

Gel, un co lo id e sem isólido. Gelatina, u n a p ro te ín a in c o m p le ta

Fórmula, u n a expresión de los cons tituyentes de u n com puesto p or sím bolos.

qu e carece d e trip tó fan o y es soluble e n ag u a hirv ien te y se tran sfo rm a en gel cuando se enfría. U tiliz ad a e n los m ed io s de cultivo p a ra d eterm in ar la actividad p ro teo lítica de los m ic ro o r gan ism o s y tam b ién p a ra la p rep ara ció n d e peptona.

Fortificado, fortalecido; enriquecido. Fosfatasas, g ru p o d e e n z im a s qu e catalizan e l fraccio n am ien to de ésteres d el ácido fosfórico; el fosfato se sep ara de su co m p u esto orgánico.

Fosfato de piridoxal, codescarboxilasa; un aldehido derivado de la piridoxina; una sustancia con actividad de vita m ina B 6; coenzim a en el m etabolism o de los aminoácidos, que interviene en la transam ination, la desam inación y la descarboxilación. Véase Piiidoxina.

Fosfolípidos, sustan cias sím il grasa q u e p u ed en degrad arse a ácidos g ra sos, glicerol, ácido fo sfó rico y (a ve ces) u n a base nitro g en ada.

Fosfoproteína, c o n ju g a d o p ro teico e n el cual el ácido fo sfórico está esterificad o al h id ro x ilo d e u n am in o á cid o , en especial serina.

Fosforilación, e ste rific a tio n de un a

Gelatinasa, e n z im a e x tra c e lu la r (exoenzim a) qu e lic ú a la gelatina.

Gen, unidad funcional d e la herencia. C ada g en o cupa un lu g ar específico, o locus, en u n crom osom a, p uede re p roducirse de m an era exacta en cada división celular y p uede dirigir la sín tesis d e u na e nzim a u o tra proteína.

Género, c la sifica ció n q u e c o n tien e u n a o m ás especies. A lineado debajo de u n a tribu o fam ilia. U n g rupo de especies estrech am en te relacionadas co n m uchas características sim ilares p ero algunas diferencias. E l nom bre d e l g é n e ro sie m p re se e sc rib e c o n m ay ú scu la in icial y e n itá lic a (o su b rayado); p o r ejem plo, Escherichia o E sc h erich ia .

m o lé c u la co n ácido fo sfórico; invo lu cra e l agreg ad o d e u n g rupo fo sfa to (-H 2P 0 3) a u n com puesto.

Glicerina (glicerol), C3H5(OH)3; un

Fotocromógeno, fo rm a d o r d e p ig

u n a de las p ro teín as m ás im p ortantes del p lasm a sanguíneo; los an tic u er p o s pro d u cid o s p o r el o rganism o son globulinas. S o n in so lu b lesen ag u ap e ro solubles en ácidos y álcalis fuertes y e n so luciones salinas neutras.

m en to co m o co n secu en cia de la ex p o sic ió n a la luz.

Fotometría, m ed ició n de la in ten si d ad de la luz.

Fragilidad, s e n sib ilid a d o fa lta de re sisten c ia a facto res capaces d e c au sa r la ru p tu ra ; p o r e je m p lo , c o n tra m em b ran as sem ip erm eables, frag ili d ad celular.

alcohol trihídrico (polihídrico).

Globulina, u n a p ro teín a sim ple pero

Glucolípido, líp id o c o m p le jo qu e contiene esfingosina, u n ácido g raso y u n azúcar, pero no contiene ácido fosfórico. Glucólisis, vía anaerobia para el m e tabolism o de los hidratos de carbono en la cual la glucosa es hidrolizada a ácido pirúvico o ácido láctico y etanol. Tam bién denom inada v ía m etabólica de E m bden-M eyerhof-P am as (EM P).

Glucosa (dextrosa), C 6H 120 6; un m o n osacárido, a zú car hexosa. E l p ro d u cto fin al de la hid ró lisis de m uchos p o lisac árid o s. M u ch o s m icro o rg an is m os u tilizan la g lu co sa com o fuente de energía. Glucósido, co m p u esto que contiene un a m o lécu la de h id rato de carbono y u n a su stan cia qu e n o es u n hidrato de carbono, qu e co n la h id ró lisis pro duce los dos co m puestos separados; p o r e jem p lo , los fru ctó sid o s p ro d u cen fructosa, el galactó sid o p roduce galactosa.

Gotas, porciones de líquido; p o r lo c o m ú n 0,1-0,3 m L. Grado, u n a p o sic ió n o un id ad ; un a m ed id a de tem p eratu ra (p. ej., °C). Gram, coloración de, colo ració n d i ferencial qu e in co rp o ra dos co lo ra n tes con colores co n trastantes; inven tad a e n 1847 p or C h ristian G ram , de a llí su n om bre. L as bacterias so n c la sificadas com o gram positivas o gram negativas, lo que d epende de su c a p acid ad de re te n er o p erd er el c o lo ran te prim ario (v io letacristal) cuando se las som ete a un ag ente d eco lo ran te. V éan se B acterias gram positivas y B acterias gram negativas. Gram, morfología en la coloración, e x te n d id o m ic ro sc ó p ic o q u e d e te r m in a el color, la fo rm a y la d isp o si ción de las bacterias. E l color es d e term in ad o p o r la re ac ció n de G ram ; gram positivo (v ioleta) o gram negativo (rojo). F orm as: cocos, bacilos, coc o b a c ilo s y e sp irilo s. D isp o s ic ió n : célu las a isla d as, e n p a res, e n c a d e nas, e n racim os, etc.

Granular, c o m p u esto p o r g rán u lo s o qu e re cu e rd a a ellos; o bservado en m u ch as esp ecies bacterianas.

Glóbulo blanco (GB), véase L eu co

Grasa neutra, un triéster de u n o o m ás

cito.

Glóbulo rojo (GR), eritrocito; c élu

de los ácid o s grasos de c ad en a larga y glicerol.

la no n u clead a de la sangre que co n

Grupo alquilo, un rad ical univalen

814

Apéndices

te derivado d e un alcan o p o r la elim i n ació n de u n átom o d e hidrógeno.

Grupo amino, g ru p o -NH, u nido a u n carb o n o a (es decir, el átom o de carb o n o al lad o del g ru po carboxilo).

Grupo carbonilo, u n rad ical o rgáni co biv alen te (-C O -) que se encu en tra e n ald eh id o s, ceto n as, ácid o s y sus derivados.

Grupo carboxilo. u n rad ical o rgáni co univ alen te (-C O O H ) que es el g ru p o fu n cio n al de todos los ácidos carb oxílicos.

Grupo funcional, u n g rupo que c a ra c te riz a u n a m o lécu la; sus p ro p ie d ad es físicas y quím icas. U n a co m b in ac ió n de g rupos fu n cionales p u e d e b rin d ar la caracterización. Grupo prostético, p o rc ió n no p ro teica de u n a enzim a, esencial p a ra la activ id ad enzim ática. T am bién den o m in ad a C oenzim a.

Halófilas, bacterias cu yo crecim ien to se acelera p o r la co n cen tració n al ta d e sal o dep en d e de ella. V éase Halofílico. Halofilico, q u e p u ed e to lerar u n a co n cen tració n alta de sal; p o r lo com ún al 10%.

Hapteno, su stan ciaesp ecíficalib re de p ro teín as que p u ed e co m binarse con an ticu erp o s in vitro pero que n o p u e de e stim u la r la fo rm a c ió n de a n ti cu erp o s cu an d o se inyectan. C uando se co m b in a c o n u n a p ro te ín a tra n s po rtad o ra, actú a co m o d eterm inante de la esp ecificid ad an tigénica.

Hélice, enro llam ien to de la estru ctu ra; p o r ejem plo, D N A , h élice de W atson y C rick. Hem, hemo, p ro to p o rfirin a de h ie rro, n o p ro teica, insoluble, C 34H 33O 4 N 4 F eO H , constitu y en te de la h e m o g lo b in a y de otros p ig m en to s celula res resp irato rio s. C o n stitu y e la p o r ció n del p ig m en to de la p arte lib re de p ro teín a de la m o lécu la de h em o g lo bina. A ntes se la d en o m inaba hem atina.

Hematina, v éase H em . Hemina, h em atin a, clo ru ro de h em e n el c u al e l F e + se tra n s fo rm a en F e 3+; la h em atin a e^ el h idróxido; fac to r X p ara las especies de H a em o p hilus.

Hemoglobina (Hb), co m p u esto c o lo read o d en tro de u n g lóbulo ro jo que tran sp o rta oxígeno. E stá relacionado d e sd e e l p u n to de v ista e stru c tu ra l co n la clorofila; p ig m entd resp irato ■ rio de la sangre.

Hemolisina (bacteriana), sustancia

so lu b le e la b o ra d a p o r las b a c te ria s que disuelve o d estruye los glóbulos rojos con la con sig u ien te lib eració n de hem oglobina. E ste fenóm eno p or lo com ún lo m anifiestan las bacterias patógenas.

Hemolisis ( a , (3 y y), presencia de una

Hidrófobo, que repele el agua; las ca denas laterales alcalinas de los am inoá cidos son hidrófobas y tienden a dejar la fase acuosa y congregar en otra fase.

Hidrogenación, re ac ció n q u ím ica en la qu e se agrega hid ró g en o a un c o m puesto.

zo n a de glóbulos rojos h em olizados alred ed o r de u n a co lo n ia crecid a en un a placa de agar sangre. E xisten tres tipos de hem olisis. E n la hem olisis a (alfa), las colonias están rodeadas po r unazo n ad eh em ó lisisin co m p leta(v erdosa). E n la hem olisis P (beta), las co lonias están rodeadas po r un a zona de hem olisis com pleta (clara, transparen te). L a ausencia de hem olisis se deno m ina hem ó- lisis y (gam m a).

Hidrolasas, enzim as que catalizan las reaccio n es de hid ró lisis y actúan so b re u n iones ásteres, com puestos glucosilados y ásteres carboxílicos. L as p rincipales subdivisiones de estas en zim as son carb o h id rasas, esterasas, am idasas y proteasas.

Heparina, anticoagulante ácido m u-

Hidrólisis, reacció n q u ím ic a e n la q u e

copolisacárido.Interfiereconlaform ación d etro m b o p lastin ain trín secay co n la acción de la trom bina; previene la conversión de fib rinógeno a fibrina, que es catalizada po r la trom bina.

se ag reg a ag u a a u n a m olécula, lo que pro d u ce la p o ste rio r ru p tu ra de la m o lé c u la y la co m b in a ció n d e u n p ro d u c to c o n el g ru p o h id ro x ilo y d el otro co n el átom o de hidrógeno.

Heterogéneo, q u e c o n siste e n m ás

Hidrolítico, que se refiere a la h id ró

de un a fase y p o r co n siguiente no es u n ifo rm e ; p o r e je m p lo , c o lo id e s; com p árese co n H om ogéneo.

Hidroquinona, alcaloide; com puesto

Hexosa. un azú car sim ple; u n m onosacárido que contiene seis átom os de carbono.

Hibridación, d e sn a tu ra liz a c ió n de

Hidrógeno, un gas; la sustancia m ás liviana conocida. E l átom o de hidróge no consiste en un protón y un electrón.

lisis o la produce. orgánico caracterizado po r el conteni do de nitrógeno y la propiedad de co m binarse con los ácidos para form ar sa les. U n a sustancia b asica derivada de los vegetales; un alcaloide com plejo que contiene sistem as de anillos.

la cad en a doble (double-strands (ds)) d el D N A en cadenas sim ples (singlestrands (ssD N A )) d etectad a co n una so n d a d e ssD N A c o m p le m e n ta ria m arcada. U tilizad a p a ra d em o strar la re la ció n del D N A de d iferen tes m i croorganism os.

d ad de ab so rb er o recu b rirse co n la hum edad; q ue cam b ia de fo rm a con las m odificaciones d el con ten id o de hum edad.

Híbrido, p ro g en ie de vegetales y a n i

trad a p o r ex p erim entos. C om p árese con Teoría.

m ales (bacterias) d e p ad res qu e son gen éticam en te disím iles.

Hidrasa, e n zim a que agreg a o elim i n a ag u a de su sustrato sin cau sar h i drólisis.

Hidrato, un co m puesto qu e contiene agua de cristalización.

Hidratos de carbono, g ran grupo de co m puestos orgánicos qu e contienen carbono, hid ró g en o y o x ígeno, co n H y O en p ro p o rció n p a ra fo rm ar agua. L o s h idratos de carbono in cluyen a zú cares, alm id o n es, c elu lo sa y g lu c ó g en o . V é a n s e M o n o sac árid o , D isacárido, T risacárido y Polisacárido.

Hidrazina, u n a d ia m in a ¡g a se o s a ; H 2N -N H 2.

Hidrazona, u n co m p u esto form ado a p a rtir de u n h id rato de carbono p or acción de la fenilhidrazina.

Hidrocarburo, cualquier com puesto que contiene sólo hidrógeno y carbono.

Higroscópico, q ue tie n e la p ro p ie

Hipótesis, teoría que no j u t T d em o s

hom*ogéneo, co m p u esto sólo de p a r tes del m ism o tipo; que p osee u n a es tru ctu ra sim ilar deb id o a que descien den de un antep asad o com ún. C o n siste en partes o elem entos sim ilares. C o m párese con H eterogéneo.

Homólogo, el m ism o con resp ecto al tip o y a la e sp e cie, d e l m ism o tip o qu ím ico p e ro qu e difiere p o r un tn crem en to fijo en cierto s co n stitu y en tes. Se co rresp o n d en en el tipo de e s tru ctu ra y e n e l o rig en b iológicos, p e ro no n ecesariam ente en la función.

hom*opolímero, po lím ero de u n ú n i co tip o de residuo.

hom*opolisacárido, h om opolím ero; po lím ero sacárido que p o r hidrólisis pro d u ce u n a ú n ica sustancia. Imagen especular, qu e p osee u n p la no de sim etría que divide u n a m olé cu la e n m itades; algo q ue exhibe i s i m etría inversa a través de un plano.

Glosario Imida, sin ó n im o su g erido p a ra polip ép tid o ; co m p u esto q u e co n tien e el g ru p o = N H o u n a am in a secundaria, R 2N H 2, d o n d e R es u n rad ical acilo o u n c o m p u esto p ro v en iente de los an h íd rid o s ácid o s en lo s q u e el oxígeno es reem p lazad o p o r N H ; así, O C :N H , carbim ida.

Impregnado, saturado. Inactivar, d estru ir la actividad Incubación, m an te n im ien to de los cultivos b acterian o s en co n d icio n es fav o rab les p a ra su c rec im ien to (so b re to d o la tem p eratu ra). E l período d e in cu b ació n es el intervalo d e tiem p o e n tre la in o c u la c ió n y e l c re c i m ien to v isib le de las b acterias en los m ed io s de cultivo artificiales.

Indicador, alg o q u e p erm ite v isu ali z ar la fin aliza ció n d e u n a reacció n ; u n c o m p u e sto que c am b iad e co lo r con las m o d ificacio n es en la c o n ce n tra ció n de io n es h id ró g en o (pH ) d e un a so lu ció n o m edio. Indicadores redox, cierto s co lo ran tes, c o m o el azu l d e m e tile n o o el azu l creso l, q u e p u ed en re em p la z ar el cito cro m o en un sistem a in vitro y q u e actú an co m o acep to res d e hid ró g e n o . E l c o lo ra n te re d u c id o e s autoo x id ab le.

Indicán, in d o x il-|3 -D -glucosa; p ro v en ien te d e los vegetales. U n a fu en te d e índigo. Indigo (sinónimo, azul índigo), ind igotina, adjetivam ente, u n p ig m e n to de co lo r azu l vio leta oscuro.

Indigotina, v éase ín d ig o . Indirrubina (rojo índigo), 2,3 ’-biin-

sa o p erso n a com o u n a calid ad n a tu ral e in separable; véase Intrínseco.

Inhibición, d ism inución o deten ció n de u n a función, com o d e te n er el c re cim ien to o la m ultiplicación. E l c re cim ien to es in h ib id o p o r el agregado d e su sta n c ia s q u ím ic as c o m o c o lo ra n te s y a n tib ió tic o s e n los m ed io s de cultivo; v éase B acteriostático.

815

Invertido, colocado h acia abajo; po r ejem plo, cuando se refiere a la coloca ción de los tubos de D urham dentro de un caldo con hidratos de carbono para atrapar el gas p roducido ( C 0 2 y H2) cuando un m icroorganism o ferm enta un hidrato de carbono particular.

In vitro, fu era d e las célu las vivas; e n u n am biente artificial.

Inhibidor competitivo, c o m p u esto

In vivo, den tro de vegetales, tejidos y

in h ib id o r del m etab o lism o b acteria no qu e com pite co n el sustrato p o r el g ru p o activo d e la e n z im a o c o n la e n z im a p o r e l su stra to (a n ta g o n is m o). C om p eten cia p o r e l m ism o sitio de la en zim a en tre do s m o lécu las d i ferentes co n sim ilitudes estructurales.

anim ales vivos, incluso en el hom bre.

Inhibidor no competitivo, su sta n c ia qu e se co m b in a c o n u n g rupo d i feren te de la m o lécu la en zim ática del q u e lo h ace el sustrato, o u n a su stan c ia q ue interfiere co n la ru p tu ra del com p lejo sustrato-enzim a.

Inhibidor, su stancia qu e detien e u na re ac ció n quím ica. Inmunofluorescencia, m éto d o m i c ro sc ó p ic o p a ra d e te rm in a r la p r e sencia o la u b icació n de un antígeno (o an ticuerpo) m ed ian te la dem o stra ció n de flu o resce n cia c o n luz u ltra vio leta cu an d o la p rep aració n es e x p u e sta a u n an ticu erp o (o antígeno) m arcado co n fluoresceína.

Inmunógeno, antígeno. Inoculación, aguja de u n a p iez a de alam b re de p latin o o aleació n de cro m o (crom o-níquel) de alrededor de 7,5 a 10 c m d e larg o , fu s io n a d a e n un m an g o d e v idrio o de m etal. U tiliza d a p a ra estriar los m ed io s de cultivo b a c te ria n o s o “p ic a r” c o lo n ia s (s e le c c io n a r co lo n ia s a isla d as) p a ra la tran sferen cia a otro m edio.

Involución, formas de, células b a c terian a s co n fo rm as a n o rm a le s qu e se encu en tran en u n cultivo envejeci do (viejo).

Ion, u n áto m o , ra d ic al, m o lé c u la o p a rtíc u la c o n c a rg a e lé c tric a , e n el que la carga se debe a la p érd id a o a la gan an cia de un o o m ás electrones. V éan se A n ió n y C atión. Ion hidroxilo, rad ical -O H Ionización, pro ceso de ionizar. Ionizar, se p a ra r e n io n es; d iso c ia r átom os o m o lécu las e n átom os o ra dicales co n carga eléctrica.

Isomerización, co nversión de un sus tra to a u n a fo rm a isó m e ra com o la co n versión de un a m o lé c u la de fo rm a L o D a u n a m ezcla d e can tid ad es ig u a les de am b as form as. V éase R acém ica, m ezcla.

Isómeros geométricos, com puestos que difieren en su co n fig u ració n p o r q u e c a re c e n de r o ta c ió n lib re ; c o n m ás frecu en cia los q u e poseen lig a duras dobles.

Isómeros ópticos, estereo isó m ero s,

un b e n z o p irro l, C 6H 4 N H C H :C H , p ro d u cid o p o r lad esco m p o sició n d el triptófano y de otros co m p u e sto s relacio n ad o s p o r la acció n de cierto s m icroorganism os.

un alam bre de platino o de crom o-ní quel con un extrem o fijo en u n m ango de m etal o de vidrio y el otro curvo en u na vuelta. U tilizado paratransferir g o tas de líquido; la cantidad de m aterial transferido se denom ina “ansada” .

que difieren en su efecto sobre el pla no de la luz polarizada, en especial los qu e contienen uno o m ás átom os de carbono asim étricos; puede ser enantio m o rfo s o diastereo isó m ero s. L os enantiom orfos son dos isóm eros ópti cos en los que todos los átom os asim é tricos correspondientes tienen u n a con figuración en im agen especular. Todos los otros no enantiom orfos (o isóm e ros) se denom inan diastereoisóm eros. V éase D iastereoisóm ero.

Indoxilo, p ro d u cto d e la d esco m p o

Inoculación, in tro d u cció n de un m i

Isómeros, co m puestos q ue tien en la

sició n pu trefactiv a d el trip tó fan o en el in testin o de los seres hu m an o s m e d ian te la acció n bacteriana; u n anillo h e te ro c íc lic o d e 5 m ie m b ro s fu sio n ad o a u n an illo bencén ico.

cro organism o o inoculo en u n cu er po o anim al o en m ed ios de cultivo.

m ism a fó rm u la m o lecu lar pero d ife rentes fórm ulas estru ctu rales; diferen tes d isposiciones d e átom os. L a dife ren cia estru ctu ral p u e d e ser física o quím ica.

Inducir, causar; producir.

In situ, en el lugar, en el sitio. Insoluble, q ue n o p u e d e ser disuelto. Intracelular, den tro d e u n a célula. Intrínseco, in n ato ; qu e e stá co n ten i

d o lin a -2 ,3 -d io n a ; isó m ero d e l ín d i go; v éase tam b ién U rorroseína.

Indofenol oxidasa, u n a indofenolasa; u n a e n zim a o x id an te e n la citocro m o oxidasa.

Indol,

Inerte, que n o p resen ta nin g u n a a c ción.

Inestable, q u e se d e sc o m p o n e co n facilidad.

Inherente, q u e existe en alg u n a co

Inoculación, ansa de, p o r lo general

Inoculo, m aterial qu e contiene el m i cro o rg an ism o a ser in tro d u cid o en un m edio o tran sferid o al m ism o.

do o dentro de algo; ig u al que in h e rente.

Isoniazida (IN H ), h id razid a d el áci do iso n ico lín ico u tiliza d a en el trata m iento de la tuberculosis.

Isótopos, átom os co n el m ism o n ú m ero a tó m ico p e ro p e so s a tó m ico s diferentes; las pro p ied ad es q u ím icas son idénticas.

816

Apéndices

Jabón, sal de u n ácid o g raso de c a d e n a larga. L , sím b o lo que sig n ifica levorrotatorio . L o s m o n o sa cá rid o s y d is a c á ri d o s son ó p ticam en te activos; es d e cir, ro tan el p lan o de la luz p o lariza da. L o s q u e rotan h acia la izq u ierd a se dice que son levorrotatorios.

Lactalbúmina, a lb ú m in a d e la le ch e; u n a p ro teín a hidrosoluble. Lactoglobulina, g lo b u lin a presen te e n la leche.

Lactosa, azúcar de leche; C 12H 240 12. U n disacárido utilizado po r ciertos m i croorganism os; con la hidrólisis, la lac tosa se divide en glucosa y galactosa.

su stancia bio ló g ica p rep arad a en fo r m a d ese ca d a p o r con g elació n ráp id a y d esh id ratació n e n el estad o c o n g e lad o en co n d iciones de alto vacío. Se realiza co n m ás facilid ad p a ra el uso gen eralm en te p o r el agregado de agua d e stila d a estéril. V é ase R e co n stitu ción y D ilución.

Lipasa, enzim a perteneciente al grupo esterasa de las hidrolasas que rom pe las grasas a ácidos grasos y glicerol.

Lípido, g rupo de sustancias qu e ex is ten d e m an e ra n atu ral e n los ácidos grasos m ás altos; grasa, aceite, cera o u n derivado de estas sustancias.

Líquido ascítico, líquido, seroso que

Macromolécula, cu alq u ier m o lécu la co m p u esta de varios m onóm eros, en esp ecial proteínas, ácidos n u clei cos, po lisacárid o s, glu co p ro teín as y glucolípidos.

Maltosa, azú car de m alta; d isacári do fo rm ad o p o r la h id ró lisis del a l m id ó n ; c o m p u e sto de do s re sid u o s de glucosa.

Mammalia (mamíferos), c la se de v e rte b rad o s c o n ó rg a n o s se c re to res de lech e (p. ej., m am as, u b res) para alim en tar a sus crías.

Marcado, que describ e un co m p u es to al qu e se le agregó un isó to p o ra diactivo.

Lecitina, g rupo de fo sfolípidos; á s teres de lo s ácidos oleico, esteárico, p alm ítico u o tros ácid os g raso s co n ácido g licero fo sfó rico y colina.

se acu m u la en la cavidad peritoneal de un individuo co n ascitis (hidrope sía). S e lo u tiliza p a ra e n riq u ecer los m edios d e cultivo artificiales p a ra el d e sa rro llo d e m ic ro o rg an ism o s co n re q u erim ie n to s e sp e ciale s d e c re c i m iento.

Leucobase, b a se b la n c a o in co lo ra; u n c o m p u e sto re d u cid o . F o rm a o x i d a d a d e l c o lo ra n te a z u l d e m etile no.

Líquido sinovial, líquido estéril, v is co so , se c re tad o p o r las m em b ran as sinoviales; en contrado e n las cavida des articulares, b o lsas articulares, etc.

Leucocito, u n g lóbulo b lan co (G B );

Líquidos no miscibles, líq u id o s que

célu la n u clead a d e la sangre que p o see activ id ad fa*gocítica.

no se m ezclarán.

tiene un efecto.

Lisar, desintegrar.

Mediar, realizar o efectuar.

Levadura, u n hon g o u n ice lu la r u ti

Lisina, a n tic u e rp o o su s ta n c ia q ue

Medio artificial, m ed io de co m p o si

lizado com o nutrien te en los m edios de cultivo bacterianos.

desin teg ra las células y es específico en su acción.

Levulosa (fructosa), un m onosacá-

Lisis, d e stru cció n d e u n a célu la p o r

rid o ; u n co n stitu y en te del d isacárido sacaro sa o d el p o lisacárid o inulina.

u n a U sina; d e sc o m p o s ic ió n d e u n a su stan cia o u n sistem a.

ció n co n o cid a con precisió n y, p o r lo tanto, rep ro d u cib le; am biente artifi cial qu e apoya el crecim iento y la re p ro d u cció n de las b acterias. T am bién se lo con o ce com o m ed io sintético.

Licuefacción, tran sfo rm ació n de un

Lisosoma, v a cu o la; p a rtíc u la re la

Latente, re ta rd a d o ; a p a re n te m e n te inactivo.

gel en u n líq u id o p o r la acció n enzim ática d e ciertas b acterias.

Ligadura doble, u n a unión covalente q u e es el re su lta d o de c o m p a rtir dos p ares de electro n es; p o r lo gen e ral rep resen tad a co m o C H 2= C H 2 (etileno). Ligaduras cruzadas, u n ió n de dos c ad e n as d e m o lé c u la s d e l p o lím e ro p o r p u e n te s c o m p u e sto s de u n e le m en to , g rupo o co m p u esto qu e unen cierto s átom os d e carbono de la c a d e n a p o r u n io n es q u ím ic a s p rim a rias. O cu rre en la n atu raleza en sus tan c ias co m p u e stas p o r c ad e n as de p o lip ép tid o s unid as p o rp u e n te s d isu l fu ro del resid u o de cistina, p o r ejem plo, insulina. Ligando, m o lécu la o rgánica u n id a a u n io n m etálico cen tral p o r m últiples u n io n es de co o rd in ación; p o r e je m plo, p o rció n porfirin a del hem o.

su stan cia p o r m ed io de isótopos ra diactivos; p o r ejem plo, 14C .

Material viscoso, su sta n c ia e sp e sa qu e se adhiere a la a g u ja de in o cu la ció n cuan d o se toca; sedim ento que se levanta com o un rem olino u n ifo r m e cuando se a g ita n lo s m ed io s de cul tivo líquidos.

Matiz, p ro p ied ad del color. Mecanismo, m ed io p o r el cual se ob

Medio basal, u n m ed io qu e contiene

c io n a d a co n la m em b ran a c ito p lasm ática que co ntiene enzim as hidrolizantes.

to d o s lo s re q u erim ie n to s n u tritiv o s n e c e sa rio s p a ra m a n te n e r e l c re c i m ien to y la rep ro d u cció n b acterian a en un am biente artificial.

Lisostafina. m ezcla de p eptidasas y

Medio de cultivo, m ezcla d e su stan

Usozim a.

Lisozima, m u ram id asa, m u copéptido, en zim a glu co h id ro lasa qu e hidroü z a las un io n es 1,4-P en tre el ácido N -a ce tilm u rám ico y la N -acetilg lu cosam ina. D estru y e las paredes celu lares de ciertas bacterias.

Locus (pi., loci), un lugar, sitio. Logarítmica (relación, escala), c u an d o se m arca e l eje vertical de u n g rá fico e n lo garitm os de n ú m eros n atu rales; el gráfico se con o ce com o re p re s e n ta c ió n se m ilo g y la e sc a la vertical se d en o m in a e scala log.

Logaritmo (espacio), p o ten c ia a la

u n a línea.

cual un nú m ero fijo, d en om inado b a se (por lo co m ú n 1 0 o e ( 2 ,7182818)), d eb e ser elevado p a ra p ro d u cir u n n ú m ero dado.

Liofilizado, liofilización (biológica),

m- (prefijo), abreviatura; véase m eta.

Lineal, q u e perten ece o se asem eja a

Marcador, h a c e r id e n tific a b le u na

cias nu tritiv as en u n a fo rm a sólida, s e m is ó lid a o líq u id a q u e re ú n e los requisitos p a ra el crecim iento y la m u l tip licació n bacterianos.

Medio diferencial, m edio con ciertos reactivos o sustancias químicas (por lo general colorantes) incorporados que produce un tipo de crecim iento o cambioquím icodespuésdelaincubaciónque perm ite la diferenciación entre tipos de bacterias. Los resultados habituales son la inhibición de ciertos m icroorganis m os m ientras se perm ite el crecimiento de otros, o un cam bio del p H denotado porunareaccióndecolorespecíficacuando ocurren los cam bios químicos.

Medio sintético, m ed io para el aisla m ie n to y e l cu ltiv o b a cteria n o s que co n siste e n con stitu y en tes quím icos co n o cid o s; sinónim o, m ed io d efin i do quím icam ente.

Glosario 817 Membrana semipermeable, m em b ran a que p erm ite el p aso de ag u a y cristalo id es p ero q u e retien e los co loides.

cro o rg an ism o que c rec e y se re p ro duce m ejo r co n ten sió n red u cid a de o x ígeno, co n u n a c an tid ad p eq u eñ a de o xígeno atm osférico o aire.

Mercaptán, v éase Tiol. Meso - (compuesto), d iastereoisóm e-

Microorganismos con requeri mientos especiales de cultivo (“fas tidious”), m icroorganism os q ue son

ro que contiene al m en os dos o m ás carb o n o s asim étrico s y q u e p u ed e ser d iv id id o en dos m itad es con co n fig u ra c ió n e n im a g e n esp e cu lar. V éase D ia stere o isó m e ro . E l m esó m e ro es u n isó m ero ó p ticam en te inactivo sin efecto sobre la luz polarizada,

meta- (m-), prefijo que in d ic a las p o sicio n es 1 y 3 del an illo de benceno.

Metabólico, perten eciente al m etab o lism o o que se refiere a él.

Metabolismo, su m a to ta l de to d o s los cam b io s qu ím ico s que tienen lu g ar d en tro de u n a célu la p o r los c u a les se m an tien en las actividades n u trí tiv asy funcionales. P ro c e so sp o r los que u n org an ism o u tiliza los alim en to s p a ra p ro d u cir el p ro to p lasm a v i vo, p ara alm acen am ien to , p a ra p ro d u cir en erg ía y p ara elim in ar los p ro du cto s de desecho.

Metabolito antagonista, véase A n á logo.

Metabolito, cu alq u ier su stan cia quí

d ifíc ile s d e c u ltiv a r y a is la r e n los m edios de cultivo básales, sintéticos y h abituales. R eq u ieren ciertos e n ri q u ecim ientos p a ra el crecim iento ó p tim o, com o sangre o vitam inas. V é a se E nriquecim ientos.

Microtécnica, m an ejo de objetos d i m in u to s p a ra e stu d io s m ic ro s c ó p i co s; m é to d o d e p ru e b a q u e u tiliz a cantid ad es m ás p eq u eñ as de su stra tos y reactivos pero con el qu e se o b tie n e eF m ism o re su lta d o fin a l qu e co n los pro ced im ien to s habituales.

Migrar, m overse de u n área a otra. Minúsculo, m uy pequeño. Miscible, c ap az de m ez cla rse o d i solverse en todas las pro p o rcio n es y de p e rm an ecer así d espués que el p ro ceso de m ezcla cesa.

Modificación, cam bio o variación. Molécula, u n a c o m b in ació n q u ím i ca de dos o m ás átom os que form an u n a su stancia q u ím ica específica.

m ic a (n u trien te) q u e p a rticip a en el m etab o lism o ; facto r de crecim ien to esencial.

Monocromo, qu e p re sen ta un color;

Metabolizar, llevar a cabo el m eta

Monómero, u n id a d m o le c u la r qu e

bo lism o .

se repite p a ra fo rm ar u n a e stru ctu ra grande o polím ero. V éase Polím ero.

Metacromasia, co n d ición e n la cual u n com p o n en te celu lar to m a u n color d iferen te de la solu ció n colo ran te con la que se tiñó.

Metacromático, co lo rantes que e x h ib en m etacro m asia. V éase M e tac ro m asia.

Metal, c u a lq u ie r e le m e n to q u e se d estaca p o r el brillo, la m aleabilidad, la d u ctilid ad y la co n d u ctib ilid ad de la electricid ad y del calor.

re p re se n ta d o p o r u n a so la lo n g itu d de onda.

Monosacárido,

a z ú c a r sim p le, C 6H 120 6, q u e n o p u ed e d esco m p o n e rse p o r h id ró lisis; p o r ejem plo, g lu co sa y fructosa.

Monovalente, qu e p o see u n a v alen cia o p o ten cia de uno y es capaz de u n irse a u n so lo c o m p le m e n to ; un am boceptor.

Morfología, el estudio de la form a y

p artícu las p o r el m o vim iento cin éti co de las m o lé c u la s d e l líq u id o . Se o b se rv a c o n fre c u e n c ia en las su s p e n sio n es líq u id a s d e b a cteria s. E s un a falsa m ovilidad.

Mucoide, qu e se asem eja a un líq u i do gom oso, acuoso, q ue recu b re las m em branas m ucosas.

Mureínas, peptidoglucanos que co m p o nen el sáculo o cu b ierta c elu lar de las bacterias. V éase tam bién Sáculo.

Mutación genética, u n cam bio en la c o m p o s ic ió n g e n é tic a q u e p u e d e tran sm itirse a la descendencia.

Muíante, un organism o o m icroorga nism o con u n gen cam biado o nuevo.

NaCl, v éase S o lu ció n fisiológica. Nativo, n atural; innato, no h e red ita rio; no adquirido.

Nefelometría, a n álisis cu an tita tiv o para d eterm in ar la can tidad de p a rtí culas de un a su spensión m ediante la d isp ersió n de la luz que p a sa a través de la suspensión.

Nefelómetro, instru m en to sim ilar a u n co lorím etro óptico, que u tiliza el fen ó m en o Tyndall para m ed ir la den sidad de la co n centración de su stan cias e n suspensión.

Neonato (neonatal), re cién n acid o en las p rim e ras 4 sem an as d esp u és del nacim iento.

Neutralidad, estad o de ser neutro. Neutralización, re a c c ió n e n tre un ácido y u n a base p a ra fo rm ar u n a sal y agua; el p ro c eso de p ro d u c ir un a solución n eu tra (pH 7,0).

Niacina, desig n ació n oficial para el á cid o n ic o tín ic o e n su p a p e l c o m o vitam ina.

Nichrome, n o m b re c o m e rc ia l p a ra u na aleació n de alta fu n d ició n (N i y C r) u tilizada com o un sustituto del p la tino (crom o-níquel).

Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), antes nu cleó tid o de difosfo-

tilo (C H 3) o sustitu ció n de otro áto m o o rad ical p o r u n g ru po m etilo.

la estructura de los m icroorganism os vivos, en especial el tam año, la form a y la disposición de u n m icroorganis m o. C on frecuencia, la m orfología se relaciona con las reacciones b ioquím i cas. V éanse C olonia, m o rfo lo g ía de la y G ram , m o rfología en la co lo ra ción de.

Mezcla, u n agregado d e dos o m ás sus

Movilidad, falsa, m o vim iento invo

Nicotinamida adenina dinucleóti do, fosfato de (NADP), an tes n u

tan cias que no se co m b in an q u ím ica m en te y que ex isten en u n a p ro p o r ció n n o fija en tre sí.

luntario; es decir, m o vim iento brow n ian o .V éase M o vim iento b ro w n ia n o .

c le ó tid o de trifo s fo p irid in a (T P N ); fo rm a reducida, N A D P H .

Mediación, sustitu ció n de un átom o de h id ró g e n o p o r u n g ru p o m etilo (C H 3).

Mediato, agregado de u n rad ical m e

p irid in a (D P N ); fo rm a re d u c id a , N A D H . U n n u c le ó tid o de p irid in a que contiene u n a am ida del ácido n i cotínico derivada de la v itam in a n ia cina.

Movilidad verdadera, m ovilidad vo

Ninhidrina, n in id rin a , n o m b re c o

Microbiología, c ien cia qu e estu d ia

luntaria. V éase M o v ilid ad falsa.

los m icro o rg an ism o s u n icelu lares que in c lu y e n b a cteria s, lev a d u ras, h o n gos y virus.

Movimiento browniano, m o v im ien

m ercial p a ra el h id rato de tricetohid rin d en o ;rea c tiv o u tiliza d o p ara la de term in a c ió n de a m in o á cid o s y su s tancias relacionadas.

Microorganismo microaerófilo, m i

to o scilatorio irregular y ráp id o de p a r tíc u las p eq u eñ as susp en d id as en un líquido, atribuible al b o m bardeo de las

Nitrato, cu alq u ier sal de á c id o n ítri

818

Apéndices

co o c u alq u ier c o m p u esto que c o n tien e el rad ical m o n o v ale n te -N 0 3.

Nitrificación, ox id ación del nitró g e n o en el am oníaco a ácidos nitroso y n ítrico o sus sales.

Oligosacárido, h id ra to de carb o n o q ue pro d u ce un n úm ero p equeño de m o n o sacáridos cuando se pro d u ce la h id ró lisis; p o r ejem p lo, disacáridos. Opaco, im p erm eab le a la luz.

Mirificante, que cau sa la oxidación

Opalescente, q ue p re sen ta u n a tur-

d el am o n íaco o d el n itró g en o atm os férico a n itratos y nitritos; p o r ejem plo, p o r bacterias nitrificantes y catá lisis n id ifican te.

b idez lechosa.

Mtrito, cu alq u ier sal de ácido n itro so o cu alq u ier com p u esto que c o n tie n e el rad ical m ono v alente - N 0 2.

Nitrogenaddl relacio n ado con el n i tró g en o o que lo contiene.

No cromogénico, que carece de cro-

Organela (organoide), u n a d e las partes especializadas de un protozoario o de u na célula de los tejidos que r e a liz a a lg u n a fu n c ió n in d iv id u a l. U nidades subcelulares. Organismo, especie bio ló g ica viva. orto- (o-), prefij o qu e in d ica dos co n s titu y en tes en p o sicio n es ad y acentes en el anillo benceno.

m ó g en o s o m ateria co lorante; que no p ro d u ce color.

Ortocromático, coloración delm ism o

No disociado, que ex iste en un a fo r m a m o lecu lar no diso ciada; no io n i zado, n o electro lítico . V éase Ionizar.

Oxalato, de litio, de potasio, de sodio o de am onio; un anticoagulante. F o r m as no ionizadas del com plejo oxa lato de calcio que red u cen la concen tración de calcio ionizado p o r debajo del requerido para la coagulación.

No inoculado, que n o tien e nin g ú n m ic ro o rg an ism o se m b rad o ; estéril. C o n frecu en cia se u tiliza u n control n o in o cu lad o ju n to co n tubos p o siti vos y negativos co n o cidos, en esp e cial cu an d o la in terp retació n se basa en u n leve cam bio de color.

No viable, m uerto. Nomenclatura, sistem a de den o m i n ació n de vegetales, anim ales y m i cro o rg an ism o s; n o m en c latu ra b in o m ial. V éase B inom io.

Nucleasa, en zim a que h idroliza el áci d o n u c le ic o o sus p ro d u c to s de h i d ró lisis; p o r|e ie m p lo , p o lin u c leo tid a sa , n u c le o tid a sa y n u c le o sid a s a . V éan se ta m b ié n E n d o n u cle asay E x o nucleasa. N u c le o p ro teín a ,u n c o n ju g a d o d e p ro teín a que contiene ácidos nucleicos.

Nucleósido, una base purina o pirim idina u n id a a ribosa o desoxirribosa.

Nucleótido de trifosfopiridina (TPN), v éase N ico tin am id a adenina d in u cleó tid o , fo sfato de (N A D P).

Nucleótido, u n fo sfo rrib ó sid o o un fo sfo d eso x irrib ó sid o obtenido p o r lo co m ú n p o r la hidrólisis de los ácidos n u cleico s. U n com puesto form ado po r u n a m o lécu la de u n azú car (pentosa), ácid o fo sfó rico y una b ase p u rin a o pirim id in a.

Nutriente, u n m aterialo su stan ciaq u e p u ed e u tilizarse com o un a fuente de alim ento. Obligado (estricto), térm in o utiliza d o p a ra d escrib ir u n m etabolism o re s trin g id o a u n único tipo, com o en el a n aero b io oblig ad o ; requ erim ien to s estricto s o absolutos.

color que el del colorante utilizado.

leche) son calentados a alta tem p e ra tura, suficiente p a ra destru ir los m i croorganism os pató g en o s si se m an tie n e p o r u n p e río d o su fic ie n te de tiem p o . P a ste u riz ac ió n de la leche: 161°F (71°C ) durante 15 seg; no m e no s de 1 4 3 °F (6 1 ,6 °C ) d u ra n te no m enos de 30 m in; lu ego en friar de in m ediato a 50 °F (10°C ) o m enos.

Patogenicidad, po ten cial para p ro d u c ir en ferm ed a d , d e p en d e d e l g rad o de virulencia.

Patogénico (patógeno), térm ino p a ra describ ir la cap acid ad de p ro d u cir en ferm ed ad ; (b acterias p ro d u cto ras de enferm edad).

Película (espuma), cap a d elg a d ac o n tin u a o in terru m p id a en la superficie de crecim iento de las b acterias en un m edio líquido; c aracterística de c ie r tas bacterias.

Penicilinasa, b-lactam asa I; en zim a p ro d u cid a p o r algunas esp ecies b a c terianas qu e inactivan ciertas p e n ic i linas (p. ej., p en ic ilin a G).

Oxgall, no m b re com ercial de B B L ; bilis p ro v eniente de la vesícula biliar (“gallb lad d er” ) de buey (“o x ”).

Pentosa, azú car sim ple; u n m onosa-

Oxidación, re a c c ió n q u ím ic a en la

Pepsina, en zim a digestiva enco n tra

que se p ie rd e n ele ctro n e s de u n o o m ás átom os de u n a sustancia; co m b i nació n de u n a sustan cia con el o x íg e no; un aum ento en la valencia (la e li m in ació n de hid ró g en o es u n a deshidrogenación). E n la m ism a reacció n o tra u o tras sustancias ganan los elec tro n es y son reducidas.

d a en el ju g o gástrico; actú a sobre las proteínas.

Oxidasa, e n z im a q u e p e rte n e c e al grupo de las desm olasas, que tran s fiere h id ró g e n o d irec ta m en te de su sustrato al oxígeno.

Ozono, gas 0 3; agente oxidante, p- (prefijo), abreviatura, véase para-. Pancreático, digerido, secreciones p an creáticas que con tien en enzim as digestivas; p an creatina, tripsina, am ilopsina, esteapsina, q u im o sin a e invertina.

Papaína, P apase, no m b re com ercial; p e p sin a vegetal p ro veniente del fru to de la papaya; u n a en zim a proteolítica activa. Papase, n o m b re c o m e rc ia l p a ra la e n zim a p ro tecto ra proveniente de C a rica papaya: véase P apaína.

cárido co n cinco átom os de carbono en su m olécula, p o r ejem plo, ribosa.

Peptidasa, e n zim a que h id ro liza péptidos a p ép tidos sim ples y am in o áci dos; lib era am inoácidos individuales de u n péptido.

Péptido (polipéptido), c o m p u e sto que consiste en dos o m ás am in o áci dos. V éase P olipéptido.

Peptidoglueano, glu can o q u e tiene adheridos po lip ép tid o s cortos.

Peptización, cam bio de un a g elatina a u n líq u id o p o r u n m o d o distinto de la fundición.

Peptólisis, hidrólisis de la p e p to n a a am inoácidos.

Peptona, p ro te ín a p a rcialm en te hidro lizad a utilizad a e n m edios de cul tivo; soluble en agua y no co ag u lad a p o r el calor.

Peptonización, d ig e stió n de la c a seína en la leche p o r las enzim as proteolíticas; so lu bilización de la caseí n a de la leche.

para- (p-), p re fijo qu e in d ic a dos

Perhidrol, véase S uperoxal. Peritoneo, m em b ran a serosa qu e re

constituyentes unidos a átom os de c ar b o n o o p uestos en el anillo benceno.

cubre las p aredes abdom inales y las visceras.

Parafina, alcano; h id ro ca rb u ro ali-

Permeabilidad, c a p a cid a d de a tra

fático saturado; v éase V aselina.

Pasteurización, pro ceso p o r e l cual

vesar o p e n etrar u n a su stancia o m em brana.

los líquidos u otros m ateriales (p. ej.,

Permeasa, p roteína específica e n al

Glosario g u nas m em branas celulares b acteria nas q u e facilita el p asaje be azúcares a trav és d e la m em b rana en la direc ció n d el grad ien te d e concentración; p arte del sistem a d e transporte activo.

co p ro fu n d a s , d e v id rio o p lástic o , u tilizad as pa ra cultivar bacterias. P o seen u n a tap a qu e se ad ap ta arriba y a los lad o s. D e sa rro lla d as p o r R . 1 P etri, u n alu m n o de K och

Peroxidasa, e n zim a q ue c a taliza la

Plasma sanguíneo, p o rc ió n líq u id a

tran sferen cia d e o x íg en o desde el p e ró x id o d e h id ró g en o o d esde un p e ró x id o o rg án ico a u n su strato a p ro p iad o , lo que en co n secu en cia o xida e l sustrato.

d e la sangre, o b ten id a p o r c en trifu g a c ió n d e la sa n g re a n tic o ag u lad a ; contiene los factores de laco ag u lació n p e ro no los eritrocitos.

Peróxido de hidrógeno, H 20 2 a g en

D N A ex tracrom osóm ico; piezas cir culares de D N A que actú an de m an e ra in d ep en d ien te de los crom osom as.

te o x id an te fuerte.

pH n e u tr o , n i ácid o n i b á sic o p H 7 . L as c o n c e n tra c io n e s d e io n e s h id ró g e n o y d e io n es h id ro x ilo so n ig u a les. pH, sím b o lo que in d ica la acid ez o la alcalin id ad de u n a solución; el lo g a ritm o n eg ativ o d e la c o n c e n tra c ió n d e io n es hidró g en o , p H = log 1/[H+], el lo g aritm o de la in v ersa de la co n c e n tra c ió n d e io n e s h id ró g e n o . E n las solu cio n es, u n p H d e 7 es el p u n to n eu tro en el cual la con cen tració n de io n es h id ró g en o e iones hidroxilo es igual. C u an d o la co n cen tració n de io n es h id ró g e n o e x ce d e la c o n c e n trac ió n de io n es h id ro x ilo, se p ro d u c e u n a co n d ic ió n á c id a c o n valores d e p H b a jo s q u e d ism in u y e n a l o m eno s. L as solucio n es e n las cuales la co n cen tració n d e io n es hid ro x ilo ex ced e la co n cen tració n d e iones h i d ró g en o so n alcalinas, co n valores de p H q u e van h asta 13 o 14.

Plásmidos, episo m as, p a n íc u la s de

Plasmina, en zim a p ro teo lítica activa

819

tos de un eje; dos puntos con p ro p ie d ades físicas opuestas. E l p o lo n eg a tivo, o cátodo, es un term inal e léctri c o c a rg a d o c o n e le c tro n e s; e l p o lo positivo, o ánodo, se vuelve positivo p o r la p érd id a de electrones.

Porción, u n a de dos o m ás p artes en la qu e se divide algo.

Potencia, potenciación, au m ento del p o d e r de u n a actividad.

Precipitación, pro ceso de fo rm ación de grum os; la fo rm ació n de agreg a dos no perten ece a la solución.

Precipitado, depósito (sedim ento) de

derivada d e l plasm in ó g en o ; esencial e n la ilisolución d el co ág u lo de san g re (fibrinólisis).

u n sólido in so lu b le e n un a solución d esp u és de p ro d u c id a u n a re ac ció n q u ím ica p o r e l agregado de u n re a c tivo precipitante.

Plasminógeno, g lo b u lin a p re se n te

Precursor, su s ta n c ia (c o m p u e sto )

e n la san g re c irc u la n te y d en tro de los coágulos; p re cu rso r inactivo de la plasm ina.

que preced e la fo rm ació n de otra su s tan cia (com puesto).

Pleomórfico, q ue p re sen ta varias fo r

cepto fundam ental.

m as distin tas o c o n fig u racio n es e x hib id as p o r u n a ú n ica cep a o especie.

Plomo, acetato de, Pb(C2H 30 2)23 H ,0 (P bA c), sal del m etal; in d ica d o r p a ra la pro d u cció n de H 2S.

pOH, lo g aritm o neg ativ o (b ase 10) de la co n cen tració n d e iones h id ro x i lo (OH ).

Polar, que p erten ece a un polo. Polaridad, d e sc rib e u n cu erp o co n d o s p o lo s o d ife re n te s p ro p ied a d es en los pu n to s extrem os.

Principio, teo ría o p rem isa; u n co n Proenzima, fo rm a in a c tiv a d e u n a enzim a.

Propiedades, características p o r las qu e se id en tific a u n a su stan cia; p o r ejem plo, color, solubilidad.

Proteasa, e n z im a qu e h id ro liz a las un io n es p ep tíd icas de las p ro teínas, lo q ue p roduce la lib eració n de p ro teín a s m ás sim p les y p é p tid o s. L as p ro teinasas y las pep tid asas p erten e cen a este g rupo de enzim as.

Pigmento, m ateria co lo rante de diver

Polimerización, u n ió n c o n ju n ta de

sas secrecio n es; p ro d u c to sin tetiza d o , in tracelu lar, n o vital. E l p ig m e n to p u ed e estar reten id o den tro de la célu la y a sí p uede co lo rearse la m asa d e célu las bacterian as o p u ed e excre tarse e n el m ed io y co lorearlo.

m u ch a s m o lé c u la s p a ra fo rm ar u n a m ás grande; u n po lím ero tiene la m is m a c o m p o s ic ió n p o rc e n tu a l q u e la un id ad m ás p eq u eñ a pero p ro p ied a des diferentes.

Proteína globular, p ro te ín a c o m p u esta p o r cadenas p o lip ep tíd icas e n ro llad as (cadenas de residuos de am i n o á cid o s) qu e se m a n tien e n u n id as p o r gru p o s de unión cru zados p o r e n laces relativ am en te débiles. S e p ro d u cen en las células, so n solubles en so lu c io n e s a c u o s a s y so n a ta c a d a s con facilid ad p o r las enzim as debido a sus enlaces débiles.

Polímero, com puesto, p or lo co m ú n

Proteína hemo, u n a crom oproteína,

Piógeno, p ro d u cto r de pus.

de alto p e so m olecular, form ado p o r la c o m b in a c ió n d e m o lé c u la s m ás sim ples.

pigm entada debido al grupo prostético no proteico hem o-hierro-proporfirina.

Poliol, polih id ro x ialco h o l; esp ecífi

com plejos d e alto p eso m o lecu lar que fo rm an la p arte p rin cip al del protop lasm a y están asociados con la m a teria viva. E stán co n stituidos p o r un n úm ero ex trem adam ente grande de a a m in o á c id o s u n id o s p o r lig a d u ra s peptídicas.

Pico d e flauta (medio), m ed io en un tu b o que se deja so lid ificar en u n án gu lo (inclinado) p ara au m e n tar la su p erficie.

Piridina, C 5H 5N , co m p u esto heterocíclico.

Piridoxina, 5 -h id ro x i-6 -m etilo -3 ,4 p irid in a d im e ta n o l; u n c o m p o n e n te d el co m p lejo de la v itam in a B 6.

Pirimidina, sustan cia h eterocíclica; su stan cia p rin cip al de diversas bases p resen tes en lo s ácidos n u cleico s (uracilo , tim ina, citosina).

Placas de Petri, placas red o n d as, p o

Policromático, que m u estra m ás de u n color, en particu lar cuando se ob serva co n luz polarizada.

c am en te , los a lc o h o les e in o sito le s de los azúcares.

Polipéptido, m o lé c u la q ue consiste e n m u ch o s am in oácidos unidos. V é a se Péptido.

Polisacárido (polisacarosa), un h i drato de carbono form ado po r la co m b inación de m uchas m oléculas de m onosacáridos (m ás de tres); p o r ejem p lo, alm idón, g lucógeno y celulosa.

Polisacarosa, véase Polisacurido. Polos, pu n to s en los extrem os o p u es

Proteínas, c o m p u e sto s o rg á n ic o s

Proteinasa, en zim a q ue hid ro liza las p ro teín as a polipéptidos. Proteólisis, conversión de proteínas en p ep tonas solubles p o r desco m p o sición o hidrólisis.

Proteolítico, den o ta algo qu e p ro d u

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Apéndices

ce la d ig e s tió n o la lic u e fa c ció n de las p ro teín as o que d egrada las p ro teín as en co m p u esto s m ás sim ples.

b ases e n los ácidos nu cleico s (adenina, guanina).

Proteosa, d eriv ad o p ro te ic o se c u n d ario que es soluble en ag u a y no se c o ag u la p o r el calor; utilizad a com o u n co m p o n en te en los m edios de cul tivo.

Protón, n ú c le o p o sitiv o d e l á to m o de hid ró g en o co n u n a m asa de 1. U n a u n id a d d e e le c tric id a d p o sitiv a que es equ iv alen te a la carga del electrón y a la m asa d el io n hidrógeno.

Prototrofo, cep a q u e aparece de m a n e ra n a tu ra l, o tip o sa lv aje, q u e es au to su ficien te d esde el p u n to de v is ta nutritiv o y no req u iere sup lem en tos adicionales. Protrombina, g lu co p ro teín ad elp lasm a q u e se co n vierte en tro m b in a p o r la acció n de la tro m b o plastina extrín se c a d u ra n te la se g u n d a fa se d e la c o a g u la c ió n ; ta m b ié n d e n o m in a d a facto r II.

Prueba cualitativa, p ru eb ap araid en tificar los co n stitu y en tes de u n co m p u esto o de u n a m ezcla.

Prueba cuantitativa, p ru e b a p a ra d eterm in ar las cantid ades d e co n sti tu y en tes en u n c o m p u esto o en un a m ezcla.

Prueba de IM V iC , serie de pruebas u tilizad as p rin cip alm en te p a ra d ife re n c ia r en tre Escherichia coli y los g ru p o s Kiebsiella-Enterobacter. I, ind ol; M . ro jo d e m etilo; V, V oges-P roskauer; C, citrato; i p a ra eufonía.

Prueba de la mancha (análisis),

tisu ero y u n an tíg en o co m p lejo d is tin to del a n tíg e n o c o m p le jo (in m u n ógeno) qu e pro d u jo los diversos a n ticu erp o s esp ecíficos e n el antisuero.

Reacción de la gota, v éase P ru eb a de la m ancha.

Reacción de sustitución, re a c c ió n Purulento, qu e c o n d en e pus. Putrefacción, desco m p o sició n b a c terian a d e p ro teín as q ue pro d u ce un o lo r desagradable.

Putrescina, te tra m e tile n o d ia m in a (N H 2(C H 2)4N H 2) p ro d u c id a a partir del am inoácido o m itina.

Quelato (ion), co m b inación estru ctu ra l d e c o m p u e sto s o rg án ico s y á to m o s de m etal; p o r ejem plo, citocrom os, hem oglobinas.

Quimosina del cuajo, re n n in a del cuajo, coag u lació n en zim ática de la leche p o r la q u im o sin a (rennina) d e n o m in ad a “cu ajad a d u lce” po rq u e se fo rm a sin a lterar el pH. Quimosina, u n a e n zim a q ue convier te la c a se ín a so lu b le de la lec h e en p a racaseín a insoluble.

Quimotripsina, en zim a que p ro d u c e la c o ag u lació n de la leche; u n a endopeptidasa.

Quinona, estru ctu ra m o le c u la r p ro ductora de color encontrada en los p ig m entos naturales y e n los colorantes artificiales; el color producido se de be a la estructura quinoide. L a oxida ció n de los anillos fenólicos que con tienen los grupos hidroxilo en las po siciones orto y p arafo rm aelco m p u esto quinona. V éase C om puesto quinoide.

q u ím ica e n la cu al u n o o m ás ele m en tos o rad icales en u n co m p u esto son reem p lazad o s p o r otros elem entos o radicales.

Reacción en cadena de la ligasa (LCR), técn ica de am p lificació n p o r sondas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), u n a técn ica d estin ad a a la am p lificació n de la señal; técn ica altam en te sensible p o r la cual can ti d ades d im inutas de secuencias e sp e cíficas de D N A o R N A pu ed en am p lific a rse p o r m éto d o s en zim átic o s p a ra p ro p o rcio n ar m aterial suficien te a fin de alcanzar el u m b ral p a ra su detección.

Reacción endotérmica, cam bio q u í m ico en e l cual se absorbe calor. Reacción exotérmica, cam b io q u í m ico e n e l c u al se lib era calor. Reacción irreversible, un a reacció n que no p u ed e revertirse; u n a reacción perm an en te en un ú nico sentido h a s ta finalizar.

Reacción reversible, u n a re a c c ió n que establece un equilibrio; u n a reac ción qu e p uede o cu rrir de derech a a izq u ierd a o de izq uierda a derecha: A + B C + D ; un a reacció n incom pleta.

Reactante, su stan cia o riginal q ue e n

p ru eb a de la gota; p ru e b a de id en tifi cació n m icro q u ím ica realizad a sobre u n a p laca de p o rcelan a o u n p apel de filtro im pregnado.

Racémica, mezcla, u nam ezcla d ecan

tra en u n a re ac ció n quím ica.

tidades ig u ales de D - y L -isóm eros. V éanse Isóm eros e Isom erization.

Reactivo, su s ta n c ia u tiliz a d a p a ra p ro d u c ir u n a re ac ció n quím ica.

Prueba de Nessier, p ru eb a d elicada p a ra d etectar am o n íaco (NH3), ald e

Radical, u n g ru p o d e e le m e n to s o átom os qu e se com p o rtan com o una u n id ad e n u n a reacció n q u ím ica; p or lo co m ú n p a sa n intactos de un co m p u esto a otro; hab itu alm en te so n in capaces de u n a ex isten cia pro lo n g a d a en el estad o libre. E n las fórm ulas q u ím icas a m enudo fig u ran en tre p a rén tesis o corchetes.

Reconstitución, re stau ració n de u na

h id o s y hex am etilen o -am inas; p reci p itad o de co lo r castañ o co n el NH3; u tilizad o p a ra d eterm inaciones colorim étricas.

Pteridina, u n c o m p u e sto h e te ro c íclico de dos anillos en contrado com o u n co m p o n en te d el ácido ptero ico y d e lo s ácid o s p tero ilg lutám icos (áci d o fólico , ptero p terin a, etc.iJ.Jfi

Radioensayo, análisis qu ím ico que u tiliz a in d ic a d o re s ra d ia ctiv o s; p or ejem plo, 14C.

su sta n c iaalterad ap aralap reserv ació n y el alm acen am ien to e n su fo rm a o ri g in al prev ia; p o r ejem plo, re sta u ra ció n del m ed io d e cultivo d esecad o y alm acen ad o a su estad o líquido, p o r lo g e n era l m ed ia n te e l ag reg ad o de agua, aun q u e p u e d en utilizarse otros d iluyentes com o alcohol.

Reducción, elim in ació n d el ox ígeno

cu al u n a su stan cia (proteína, etc.) es n eu tra; a u n pH m ás b ajo o m ás alto, actú a co m o un ácido o u n a base, res p ectivam ente.

positivo utilizad o p a ra d eterm in ar la p e n etració n de los ray o s X.

o su e q u iv a le n te de u n c o m p u e sto q uím ico o agregado de h id ró g en o o su equivalente; la d ism inución de la v alen cia d e u n elem ento en co m b in a c ió n ; u n in te rc a m b io d e e le c tro n e s entre los átom os (el átom o qu e gana el electró n o los electro n es es red u ci do y el átom o qu e p ierd e e l electrón o los electro n es es oxidado).

Reacción cruzada (reactividad),

Reducir, su straer u n io n o x íg en o o

Purina, sustancia principal de algunas

un a reacció n esp ecífica entre u n an

agregar u n hidrógeno a u n a sustancia;

Puentes sulfhidrilo, ra d ic a l u n iv a

Radioisótopo, isó to p o radiactivo u ti

le n te -S H . L a c is te ín a c o n tie n e u n p u en te sulfhidrilo.

lizad o c o m o u n ra stre a d o r en la in v e stig a ció n cien tífica; p o r ejem plo, 14C

Punto isoeléctrico (pK), el p H en el

Radiómetro (radiométrico), un d is

Glosario p e rd er u n a c arg a p o sitiv a o g a n ar un a carg a negativa.

Reductasa, en zim a q ue c ataliza las reaccio n es d e reducción.

Relación de gases, ex p resa la can ti d a d d e u n a su stan cia o en tid ad re s p ecto d e otra. L a relació n de gasses se refiere a lo s g ases d ió x id o de c ar b o n o ( C 0 2) e h id ró g en o (H 2).

Sal orgánica, co m p u esto fo rm ad o a p a rtir de u n ácido en el cual el átom o d e hid ró g en o del g rupo carb o x ilo es reem p lazad o p o r u n m etal o u n ra d i cal am onio, u n sólido.

cu en cias de b ases h o m ologas.

S al, un co m puesto qu e consiste e n un ion positivo distinto del h idrógeno y u n ion negativo distinto del hidroxilo; producto d e la rea c ció n de u n ácido con un a base; el ion positivo deriva de la base, el io n negativo d e u n ácido. L as sales son los electrólitos.

Relación, tasa, pro p o rción; relación

Sales biliares, sal só d ica de un ácido

Relación genética, secuencias de se

de u n a en tid ad co n o tra e n lo qu e res p ecta a la can tid ad (concentración), etc.

Replicador, d isp o sitiv o , p o r lo g e

b ilia r (co n ju g a d o á cid o ); p o r e je m plo, taurocolato, glicocolato.

Sales buffer, sales q u e se co m portan

Reproducir, d u p lic a r; p ro d u c ir de

com o buffers, p o r lo co m ú n sales de ácidos co n u n a co n stan te de d iso cia ció n baja; p o r ejem plo, carb o n a ta s y fosfatos.

nuevo; repetir.

Satelitismo, crecim ien to de colonias

Residual, que p erm an ece o sobra al

m ás grandes de Haemophilus influen zae en la reg ió n cercan a al crecim ien

n eral auto m atizad o o sem iautom atizad o , u tilizad o p ara rep ro d u cir algo.

fin al d e u n proceso.

Residuo, sustan cia o sustancias que p e rm a n ec e n d esp u és de la fin aliza ció n de u n p ro ceso físico o quím ico.

Resistente, q u e resiste la acción o el efecto de algo. Resonancia, p ro p ied ad de u n a su s tan cia q u e tien e dos o m ás form as e s tru c tu ra le s p re se n te s d e m a n e ra si m ultánea. Respectivamente, in d ividualm ente, en el o rden desig n ad o ; p o r ejem plo, p rim ero , segundo.

Respiración, cu alq u ier re ac ció n q u í m ic a en la que se lib era en erg ía p o r lo s p ro ceso s vitales. L a tran sfo rm a ció n de la en erg ía tien e lu g ar p o r un p ro c eso aero b io o an aerobio. E s un p ro c eso de o x id ació n d e las células v ivas e n el cu al el o x í geno es el acep ta r de h id ró g en o p o r elim in ació n del h id ró g en o d el sustrato. Rumiante, cu alq u iera de los d iv er so s an im a le s u n g u lad o s, p o r lo c o m ú n co n cuernos, que tien en u n estó m ag o co n cu atro co m p artim ien to s y q u e m astican el alim ento p o r segun da vez; p o r ejem plo, v acas y cabras.

to de estafilococos u otras bacterias (p. ej., especies de Neisseria), d e b i do a qu e estas bacterias sin tetizan el fa c to r de c rec im ien to V, el cu al d i fu n d e al m ed io q u e las ro d e a; e s ti m u la c ió n d el c rec im ien to d e H. in fluenzae en la v ecindad de colonias que le ap o rtan el facto r V.

Saturada, solución, solución e n la q u e e l soluto está en equilibrio con el so lu to no disuelto; la solución contiene todo el soluto que p u ed e co n ten er a u n a tem peratura y un a presión dadas. Saturado, compuesto, u n co m pues to orgánico en el que todas las valen cias están ocupadas; u n com puesto que no tiene dobles ni triples ligaduras. Secretar, elaborarproductos celulares. Secuencial qu e fo rm a u n a se c u en cia, sucesión u orden; nú m ero de c o sas qu e se suceden en tre sí; en fo rm a colectiva, u n a serie.

Secuestrar, elim in a r u n io n m etá li c o de un siste m a fo rm a n d o u n io n com p lejo q ue no tien e las reacciones q u ím icas d el ió n elim inado.

Semisólido, blan d o y qu e fluye con

Sacárido, sucrato^cualquiera de una

lentitud.

se rie de c o m p u e sto s q u e c o n tie n en carb o n o , h id ró g en o y oxígeno, e n el cu al la relació n de h id ró g en o a o x í g en o es 2:1.

Sensibilidad, calid ad de ser a fecta

Sacarolítico, c ap a z d e ro m p e r los

ceptible a la acción o al efecto de algo.

azú cares p o r m ed io s q uím icos.

Señal de amplificación, sec u en c ia b lan co de D N A id entificada y am pli ficada de m odo tal qu e p u ed a ser d e tec ta d a ; p o r e je m p lo , c o n re ac ció n en cad en a de la p o lim erasa (PC R ).

Sáculo, p eq u eñ o saco o bolsa. Sal delicuescente, su s ta n c ia capaz d e ab so rb er h u m ed ad a p a rtir d el ai re y que se d isu elv e en él; p o r ejem p lo , C aC 12.

do con facilidad; qu e es influido con facilidad.

Sensible, altam ente susceptible; sus

Sepsis, v éase S epticem ia.

821

Septicemia (sepsis), cu ad ro m ó rb i do causado p o r bacterias pató g en as y sus to x in a s a so c ia d as e n la san g re; enferm ed ad sistém ica.

Serotipo, su b división tax o n ó m ica de b a cteria s b a sa d a e n las c a ra cte rísti cas antigénicas. S e u d o c atala sa .tip o d e c atala sa q u ec arece del grupo prostético h e m o y e s sen sible al pH ácido; un a falsa catalasa. S h u n t de las pentosas (vía metabólica de Warburg-Dickens), v ía m eta b ó ü c a alternativa de los hid rato s de carb o n o p a ra ferm en tar hexosas, p e n tosas y varios otros h idratos de car b o n o e n u n a d iv ersid a d de o rg a n is m os. Se d esvía de la v ía m etab ó lica de E m b d e n -M e y erh o f-P arn a s e n la o x id ac ió n d e la g lu co sa-6 -fo sfa to a 6-fosfogluconato, qu e a su vez se co n v ierte en fosfatos de pentosa.

Sideróforo, u n m acrófa*go que c o n tiene h e m o sid erin a enco n trad o e n el pulm ón.

Siembra del inoculo en pico de flauta (cola de pescado), m éto d o de inoculación en tubos con m edio a b ased e agar. C o locar el inóculo sobre el pico de flauta, cerca de la c u rv atu ra in clin ad a (fondo) y realizar un m o v im iento d e zig -zag so b re la superficie del m e dio. E l m áxim o d esarro llo se obtiene p o r el u so de buen o s co n stituyentes en el m edio.

Siembra en cuadrantes de la placa de Petri, con un lápiz de grasa e m ar ca la b ase d e la p lac a de P etri e n cua drantes; cad a cu ad ran te se u tiliza p a ra un único inóculo, estriado p a ra o b te n e r el m á x im o c re c im ie n to . E ste pro ced im ien to p erm ite que u na ú n i ca placa de P etri de m ed io sólido sea in o cu lad a co n cu atro co lonias p uras separadas p a ra estudios posteriores, en esp ecial p a ra o b ten e r el m áxim o d esarro llo de u n inó cu lo p a ra los e s tudios bio q u ím ico s o de sensibilidad a los antibióticos. N o p uede u tilizar se p a ra e l a is la m ie n to in ic ial. P a ra este m étodo se debe u tilizar un inó cu lo p ro v eniente de u n cultivo puro.

Siembra por punción, cultivo en el qu e se in o cu lan los m icroorganism os (con u n a a g u ja de in o cu lació n ) en la p a rte m ás p ro fu n d a d e l m ed io p a ra perm itir el p o sib le crecim ien to an ae robio. L a aguja que lleva el inóculo se in tro d u ce en u n a lín e a re cta desde la parte superior al fo ndo del tu b o y se re tira p o r el m ism o cam ino.

822

Apéndices

Símbolo, abreviatura de una o dos letras del nombre de un elemento. Simétrico, de manera simétrica, que posee partes constituyentes dispues tas en un patrón definido y repetido de manera continua en una dirección definida en el espacio.

Suero de la leche, suero de la leche delgado que permanece después que la cuajada y la crema se han separado. Suero sanguíneo, componente acuo so límpido de la sangre separado por la coagulación de sus componentes más sólidos.

Simultáneo, que ocurre, se realiza o existe en el mismo momento.

Sulbactam, 6 desaminopenicilina sulfona semisintética.

Sinérgico, sinergismo, efecto com binado de dos o más agentes que ex ceden la suma de sus efectos indivi duales.

Sulfonamida, compuesto con la es tructura típica RSÓ2NH2; derivado de la sulfanilamida; utilizado como agente antiinfeccioso en medicina.

Síntesis, elaboración artificial de un compuesto químico por la unión de sus elementos.

Sulfuro de hidrógeno (H2S), un gas producido por la hidrólisis ácida de muchos sulfuros.

Sistema, combinación de materia que contiene una o más fases, o grupo or ganizado y relacionado de hechos, fenómenos o ideas.

Superoxal, perhidrol; peróxido de hidrógeno (H20 2) al 30%; conocido como “100 volúmenes”, o, de mane ra inexacta, peróxido de hidrógeno al “100%” debido a que emite 100 ve ces su volumen de oxígeno.

Sobrenadante, remanente líquido después de la eliminación de la ma teria suspendida (sedimento), por lo común después de la centrifugación. Soluble, capaz de disolverse en un líquido; no se produce ningún cam bio químico; un proceso mecánico. Solución fisiológica (NaCl), una sal; cloruro de sodio. La solución fisioló gica isotónica contiene NaCl al 0,85%; conservante de muestras bac terianas.

Superóxido, un compuesto caracte rizado por la presencia en su estruc tura del ion 0 2-. Cada átomo de oxí geno posee un número de oxidación de -1/2 en lugar de -2 de un óxido normal. Suplemento, adición de lo que falta; un enriquecimiento. Suspensión, sistema que consiste en partículas pequeñas dispersas en un líquido; partículas que se depositan con lentitud en una posición.

Solución isotónica, una solución en el ambiente externo con la misma presión osmótica que la solución en una célula.

Sustrato oxidado, el dador de hidró geno.

Solución, mezcla hom*ogénea de dos o más sustancias que forman una so la fase.

Sustrato, sustancia sobre la que ac túa la enzima; enzimas específicas tienen sustratos específicos.

Soluto, una sustancia disuelta en un solvente.

Tasa, véase Relación.

Sonda de ácido nucleico, un seg mento de ácido nucleico de cadena simple que puede formar un híbrido de manera específica con su cadena complementaria por medio del su apareamiento de bases para detectar DNA o RNA.

Tautomería, forma de estereoisomerismo en la cual los compuestos son mutuamente interconvertibles. Dos fórmulas sonposibles, pero sólo se ob tiene una sustancia estable. Los com puestos pueden dar reacciones de un grupo carbonilo y en otras oportuni dades actúan como si tuvieran un gru po alcohol; ejemplos son las formas cetónicas y enólicas.

Subcepa, miembros de una cepa que difieren del aislamiento original. Subcultivo, trasplante de bacterias viables provenientes de un cultivo a un medio fresco.

Taxonomía (bacteriana), ciencia de la disposición, clasificación y no menclatura de las bacterias; la clasi ficación se basa en las relaciones na turales siempre que sea posible.

Subproducto, sustancia o sustancias que permanecen después de que el compuesto principal fue utilizado por un microorganismo; por ejemplo, ni tritos formados cuando el oxígeno es eliminado a partir de los nitratos.

Técnica de la gota suspendida, ob servación microscópica de microor ganismos suspendidos en una gota de líquido para determinar la presen cia o la ausencia de movilidad.

Solvente, una sustancia en la que se disuelve un soluto; un líquido.

Temperatura óptima, temperatura

más favorable para el crecimiento y la reproducción de un cultivo bacte riano. Tensión superficial, partículas de superficie de un líquido que posee fuerzas moleculares fuertes que tien den a empujarlas hacia el interior del líquido; el líquido actúa como una membrana estirada. Teoría, reducción de datos o hechos a un principio y demostración de sus interrelaciones. Tergitol, nombre comercial para un grupo de detergentes; sales de sodio o de amina de sulfatas de alquilo pri marios o secundarios superiores. Termoestable, relativamente resis tente al calor; resistente a 100°C. Termolábil. destruido por el calor; desintegrado por temperaturas meno res que el punto de ebullición del agua. Termonucleasa, nucleasa termoesta ble producida por los estafilococos, ca paz de degradar los ácidos nucleicos. Tetrosa, monosacárido que contiene cuatro átomos de carbono por molé cula. Tío- (prefijo), indica la presencia de azufre en un compuesto, por lo co mún como un sustituto del oxígeno. Tiol(mercaptán),grupodecompuestos orgánicos que se asemejan al al cohol pero con el oxígeno del grupo hidroxilo reemplazado por el azufre. Tipo, término utilizado en bacterio logía para designar una subdivisión de una especie; por ejemplo, Strep to coccu s p n e u m o n ia e de tipo I, de tipo II. Las bacterias son clasificadas por tipos cuando las características de di ferenciación son demasiado leves pa ra justificar establecer una subespe cie o variedad. Titulado (titulación), determinación de la cantidad de una sustancia en una solución por el agregado de un volumen medido de una solución es tándar hasta que ocurre la reacción deseada. Tolueno, hidrocarburo metilbenceno; C6H5CH3. También denominado to luol; utilizado sobre todo como un solvente químico. Toluol, véase Tolueno. Tóxico, venenoso. Toxina, sustancia venenosa liberada por ciertas bacterias; por ejemplo, es pecies de C lostridium . Transaminación, reacción química que involucra un intercambio entre el grupo amino de un aminoácido y el

Glosario grupo cetona de un cetoácido, lo que produce la formación de un nuevo aminoácido y un nuevo cetoácido. Transcripción, (o amplificación so bre la base de secuencias de ácido nucleico (nucleic acid sequence-ba sed amplification, NA SBA)) o am plificación de secuencias continuas triples (3 SR, self-sustaining sequen ce amplification). Utiliza tres enzimas en la mezcla de la reacción. Transducción, transferencia de ma terial genético (y expresión fenotípica sobresaliente) de una bacteria a otra por un bacteriófa*go. Transferasa, enzima de transferen cia; enzima que cataliza la transfe rencia de un grupo químico de una sus tancia (compuesto) a otra. Transferenciapor conjugación, trans posón conjugativo o “gen saltador”. Transformación genética, cambio genéticocausadoporlaincorporación de DNA purificado proveniente de células o virus dentro de otra célula. Translúcido, semitransparente. Transparente, claro; que permite el pasaje de la luz. Transpeptidación, reacción que in volucra la transferencia de uno o más aminoácidos desde una cadena peptídica a otra por acción de la “transpeptidasa”, o transferencia de una so la cadena peptídica, como en la sín tesis de la pared celular bacteriana. Transposón, elemento genético que puede sufrir una transposición, el cual transporta una porción de un plásmido y una parte del cromosoma de una bacteria a otra por transferencia por conjugación. Trasudado, similar al exudado pero con menor contenido de proteínas; véase Exudado. Triglicérido, cualquier áster que se produce naturalmente a partir de un ácido graso normal y glicerol. Fór mula general: CIUÍOOCRjjCH (OOCR2)CH2(OOR3); constituyente principal de grasas y aceites. Rj, R2, R3 por lo general con cadenas de lon gitudes diferentes. Trimetoprima (TMP), USP, BP, 3,4,5-trimetoxibenzil pirimidina; in hibe la reductasa del ácido dihidrofólico. Pirimidina, análogo estructural de lapteridina. 2,4-diamino-5-(3,4,5trimetoxibenzil pirimidina). Agente antimicrobiano; potencia los efectos de las sulfonamidas y sulfonas. Trimetoprima-sulfametoxazol (SXT), Gantanol; sulfametoxazol;

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N l-(5 metil-3-isoxazoíl) sulfanilamida; cotrimoxazol, combinación de dos antibióticos, sulfametoxazol y trimetoprima (TMP). Triptófano, a-amino-3-indol-ácido propiónico; CgH6N-CH2CH(NH2)COOH. Produce indol cuando es metabolizado por ciertas bacterias, tam bién es un nutriente requerido por al gunas bacterias. Triptona, peptona verdadera, que se debe diferenciar de la peptona pepsi na; peptona producida por la hidróli sis de las proteínas por acción de la enzima tripsina. Utilizada en los me dios de cultivo, en especial los utili zados para detectar la producción de indol. Tris, tris(hidroximetil)aminometano; buffer utilizado en las prepara ciones biológicas para los estudios o las pruebas de enzimas in vitro.

cual los electrones son compartidos por dos núcleos atómicos. Varía de no polar, que comprende electrones compartidos de manera uniforme por dos átomos, a sumamente polar, en la que los electrones unidos se compar ten de manera muy irregular. Unión giucosídica, uniones que for man polisacáridos a partir de unida des de monosacáridos.

Trisacárido, hidrato de carbono, C]8H310 16, que contiene tres azúca res. Trombina, enzima de la sangre que convierte el fibrinógeno en fibrina en la coagulación sanguínea.

H2N ^ C H 2 — COOH + H — N — CH-> —

TSI, véase Agar con azúcar triple y hierro. Turbidimetría, determinación del número de partículas finas suspendi das en un líquido por determinación del espesor del líquido que reduce la transmisión visual tanto como una solución estándar o un patrón es tándar; por ejemplo, nefelómetro de McFarland. Véase Nefelometría. Türbio, no límpido. Tween, óxido de etileno derivado de un éster del sorbitan; un agente emul sionante que dispersa los glóbulos de grasa y un agente no iónico humec tante activo de superficie. Utilizado en microbiología para reducir la tensión superficial. También denominado Tween 80. Tyndall, efecto, un haz transverso de luz es reflejado o dispersado por partí culas suspendidas en un gas o líquido. Ultravioleta, porción del espectro inmediatamente más lejos del viole ta, del lado de la longitud de onda corta; rayos invisibles que inducen actividad química y producen fluo rescencia. Unidad repetidora, unidad estruc tural original de un polímero, que se repite para formar el polímero. Véa se Polímero. Unidad, un estándar de medida. Unión covalente, tipo de unión en la

Unión peptídica, si nónimo de ligadura 9 ^ peptídica, ligadura __II___I que une los aminoáL N cidos en la molécula de la proteína; unión a través de los grupos carboxilo amino.

I L p e p tid e lin k (b o n d )

Unión polar, unión electrostática de dos|átomos establecida por el pasaje de uno o más electrones de uno al otro. Unión química, unión entre átomos o radicales diferentes de un compues to químico. Urea, compuesto nitrogenado, solu ble, cristalino; carbamida, CH4ON2. Ureasa, enzima que cataliza la hi drólisis de la urea con formación de carbonato de amonio. Urorroseína, cromógeno en orina que forma un color rojo cuando se agrega ácido nítrico; aumenta con la infección por Mycobacterium tuber culosis (TBC) y con otras enferme dades consuntivas. Valencia, un número que indica el poder de combinación de un elemen to o radical. Variable, no constante. Variación, alteración o modificación de un carácterenla descendencia; des viación de lo original; por lo común un cambio temporario en compara ción con una mutación. Variante, un microorganismo que varía, o difiere, del cultivo que le dio origen. Vaselina, jalea de petróleo, pomada de parafina, vaselina amarilla; mez cla purificada de hidrocarburos semisólidos derivados del petróleo; so luble en alcohol o cloroformo; utili zada como lubricante, limpiador y base de las pomadas.

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Apéndices

Vaspar, una mezcla de vaselina y pa rafina, con pesos iguales, utilizada para sellar los cubreobjetos en la téc nica de gota suspendida y para los tu bos con medios de cultivo líquidos inoculados con bacterias anaerobias. Versene, nombre comercial. Véase Etilendiaminotetraacetato (EDTA). Viable, vivo y capaz de reproducirse. Vía metabólica de Embden-Mey erhof-Pamas (EMP), principal vía de

fermentación de la glucosa. También denominada glucólisis o ciclo glucolítico. Relacionada con la fosforila ción de la glucosa con producción de ácido pirúvico y energía; es probable que el ácido pirúvjpo se degrade con posterioridad a ácido láctico. Forma anaerobia del metabolismo. Vía metabólica de Entner-Doudoroff, vía metabólica para la degrada ción de las hexosas por algunas bac terias. Los productos finales son pi-

ruvato y gliceraldehído-3-fosfato. Virulencia, capacidad potencial de un microorganismo de causar enferme dad; también denominada patogenicidad. Viscoso, pegajoso, gomoso, glutino so. Volátil, que se evapora con rapidez. Xanteno, compuesto cristalino que es la estructura básica de muchos co lorantes.

VJ SECCI ÓN

O Indices

Indice 1 - General

A AccuProbe prueba de confirmación de cultivo para Neisseria gonorrhoeae, 320 sistema de pruebas múltiples, 430, 435 Acetalización, 387 Acetato de plomo, 194 Acetil coenzima A (acetil-CoA), 268, 292 Acetoína, 302, 304, 411, 419 Ácido(s) aldónicos, 173 aminocefalosporánico, 242 aminolevulínico (ALA), 376 aminopenicilánico, 238, 240 benzoico, 178, 186 2-cetoglucónico, 173 clavulánico, 244 cólico, 25 desoxicólico, 25 fólico, metabolismo, 4 fórmico, fermentación, 58 grasos, 268 indolacético, 207, 214 láctico, 58 fermentación, 154 lactosa beta-galactosidasa, pruebas, 151 medios KIA/TSI, 226 con yema de huevo para las reacciones, 259 mixtos, fermentación, 58, 411 nucleicos, sondas, 320, 430,435,438 propiónico, fermentación, 58 succínico, 291 sulfhídrico, prueba de, 192 bioquímica, 192 interpretaciones, 201 medios con aminoácidos que contienen azufre, 194, 202 KIA/TSI, 228, 231 prueba con tiras reactivas de acetato de plomo (PbAc), 199, 204 objetivo, 192 precauciones, 202 teicoico, 26 Adenina, 130 Agar con desoxicolato citrato, 682c y lactosa, 682c y sacarosa, 683c

con eosina-azul de metileno, 683c Hektoen entérico, 682c con hierro de Kligler (KIA), 223 bioquímica, 226 formación de ácido sulfhídrico, 228 interpretaciones, 230 medios, 229 objetivo, 223 precauciones, 231 producción de gas, 227, 229, 231, 233 con lecitina lactosa para anaerobios, 428 lipasa para anaerobios, 428 con lisina-omitina-manitol (LOM), 428 MacConkey, 683c con sulfito de bismuto, 682c verde brillante, 682c Aglutinación de partículas de látex, 430, 437, 438 Agmatina, 115 Alcohol(es) azúcares, 55, 68 butílico (butanol), fermentación, 58 catalasa y, 76, 77 lípidos, 267 Aldehidos, 386 Aldosa, 386 Alfa hemolisina, 44 naftol, 347, 349, 350 bioquímica, 312 interpretación, 316 medios CTA/hidrato de carbono, 313, 316, 322 Elrod y Braun (modificada), 315, 317 medio para la identificación de gonococos (GCID), 315,317, 322 Neisseria, hidrato de carbono, pruebas de utilización, 312 objetivo, 312 Alfa precauciones, 321 pruebas alternativas, 319 con sustrato de enzima cromogénica, 318 sistemas en equipos, 317 API Quad-Ferm +, 317 BactiCard Neisseria, 319 Streptococcus, 265 Gonobio, 318 Gonochek II, 319

828

Indice 1 - General

Alfa (cont.) Minitek, 317, 322 Neisseria-Kwik, 318 Neisstrip, 319 Almidón, prueba de la hidrólisis del, 385 bioquímica, 385 interpretación, 393, 395 medios, 390, 394 micrométodo rápido, 394 objetivo, 385 precauciones, 394 procedimiento con etanol, 394 prueba con yodo, 392 reactivos, 391 Amidasas, 398 Amilasa, 387, 394 Amilopectina, 387, 392 Amilosa, 387, 392 Aminoácidos cistina, 192 desaminación, 207, 264, 362 descarboxilasas, 113, 185 fenilalanina, 362 glicina, 177, 184, 286, 288 leucina, 264, 265 metionina, 192 prueba de ácido sulfhídrico, 192 triptófano, 207 Amoníaco, 327, 362, 372, 398 Amoxicilina, 239 Ampicilina, 239 Anaerobios medios para la fermentación de hidratos de carbono para, 64 peroxidasa, 74 Andrade, indicador de, 59, 60, 69, 70, 684c Anfotericina B, 405 Anilina, 349 Antibióticos anfotericina B, 405 bacitracina, 3 cefalosporinas, 240 cefoperazona, 309 cefsulodina, 405 cicloserina, 270, 271 penicilinasa, 238, 402 plásmidos y resistencia, 237, 243 proteínas ligadoras, 238 prueba de beta-lactamasa, 236 sulfametoxazol, 270, 271 trimetoprima, 5 trimetoprima, 4, 270, 271, 309, 405 vancomicina, 405 API, sistemas para pruebas Quad-Ferm +, 317 sistemas de múltiples pruebas, 429, 430, 438 Aprotinina, 106 Arginina descarboxilasa, prueba de bioquímica, 115 descarboxilosa de Mpller, 117 dihidrolasa bioquímica, 116 cromatografía en capa delgada, 124

objetivo, 113 Autólisis, 27 Auxocromos, 369 Auxótrofo, 320 Azo, grupo, 381 Azúcar triple y hierro (TSI), agar, 223 bioquímica, 226 interpretaciones, 230 medios, 229 objetivo, 223 precauciones, 231 Azul de bromotimol, 684c de metileno, 297 prueba de reducción de la leche del, 296 bioquímica, 296 interpretación, 298 medio, 298 objetivo, 296 precauciones, 299 de toluidina O, 136, 146

B Bacilos grampositívos, diferenciación aerobios y anaerobios facultativos, 532-537c anaerobios, 554-559c interpretación, 81 método en portaobjeto, 79 en tubo, 79 de M ycobacterium, 80, 81 de Neisseria, 84 objetivo, 73 precauciones, 85 prueba para células enteras, 81, 82, 87 Bacitracina y sulfametoxazol-trimetoprima, pruebas de, 3 bioquímica de, 3 interpretación, 6 objetivo, 3 BactiCard sistema de múltiples pruebas, 431, 435 Neisseria, 319 BBL, sistema de múltiples pruebas, 430, 431, 436 Beta galactosida permeasa, 153 galactosidasa, 318 bioquímica, 151 interpretación, 157 objetivo, 151 ONPG, 151, 154 PNPG, 151, 157, 159 procedimientos, 156 pruebas, 151 rápidas, 157 reactivos, 155 hemolisina y prueba CAMP, 33 lactamasa, prueba, 236 bioquímica, 237 cefalosporinas, 240 enzimas beta-lactamasa, 237 Bacteroides/Prevotella, 244 Enterococcus faecalis, 243, 250 Haemophilus influenzae, 243, 249

índice 1 - General inhibidores de, 244 M oraxella catarrhalis, 243, 249 N eisseria gonorrhoeae, 243, 249 Staphylococcus, 243, 249

penicilinasa, 238 plásmidos y resistencia a los antibióticos, 237 ensayos rápidos acidométrico, 247, 248 nitrocefina (cefalosporina cromogénica), 244, 248 prueba yodométrica en portaobjeto, 246, 248 objetivo, 236 precauciones, 248 naftilaminas, 264 Bilis, prueba de solubilidad, 25 bioquímica, 25 objetivo, 25 procedimiento, 28 pruebas rápidas, 29 2,3-butanodiol, 302, 412 Butirato esterasa, 319c

c Cadaverina, 114,122, 124 Caldo para roio de metilo-Voges-Proskauer, 302, 415, 429 CAMP, prueba, 33 bioquímica,, 34 fosfolipasa D, detección, 45 interpretación, 42 inversa (RCT), 44 objetivo, 33 prueba en disco, 45 de la mancha, 46 Carbamatocinasa, 116 Caseína, 275, 276 Catalasa, prueba de, 298, 345 bioquímica, 74 para Enterobacteriaceae, 83 prueba de la estira con reacción de color, 85, 86 técnica del cubreobjeto, 84 tubo capilar, 84 Cefalina, 255 Cefalosporinas, 240 Cefoperazona, 309 Cefsulodina, 405 Celulosa, 386 Ceramidas, 35, 37 Ciclo del ácido glicoxílico, 293 de Krebs, 226,292 Cicloserina, 270, 271 Cinc, prueba de reducción, 330, 332, 337 Cisterna, 65, 66, 192, 331 desulfhidrasa, 192 Cistina, 66, 192 Cilucromos, 74, 296, 308, 327, 345 Citosina, 130 Citrato de amonio férrico, 193 prueba de, 92 bioquímica, 93 de Christensen, 94 objetivo, 92

829

prueba en sangre citratada, 95 Simmons, 94 Citrulina, 116 Clasificación bacterias gramnegativas, 580 grampositivas, 451 Enterobacteriaceae, 676 Clinitest, comprimidos, 174 Coaglutinación, prueba para Neisseria, 320 Coagulasa y manitol, agar y caldo, 428 prueba de, 98 aglutinación del látex, 105 bioquímica de, 99 coagulasa libre y, 100, 103 ügada y, 99, 103 manitol, 105, 109 termonucleasa en tubo, 104 objetivo, 98 placa vertida, 104 en portaobjeto, 103, 107 en tubo, 103, 107 Cocos grampositivos, diferenciación, 561-569c Coliformes, fermentaciones del grupo, 58 Colon-disentería-tifoidea, bacterias del grupo (grupo CDT), 58 Coloración metacromática, 138 ortocromática, 138 Colorantes auxocromos, 369 azul de metileno, 297 de toluidina O, 136, 146 naranja de acridina, 141 p-fenilenediamina, 349 verde de metilo, 138, 146, 373 Coordinación, 182 Cromatografía en capa delgada hidrólisis del hipurato, 186 prueba de arginina dihidrolasa, 124 gas-líquido (GLC), 433 hidrólisis del hipurato, 186 identificación de N eisseria gonorrhoeae, 320 pruebas de descarboxilasa, 124 Voges-Proskauer, prueba de, 418 líquida a alta presión (HPLC), 433 Cromóforos, 369 Cromógenos, 369 Cuajo, formación, 277, 281

D Desanimación arginina, 117 lisina, 121 Descarboxilasa, pruebas de (hsina-omitina-arginina), 113 bioquímica, 114 deFalkow, 118, 126 medios para, 117 de Mpller, 117, 126

830

Indice 1 - General

Descarboxilasa, pruebas de (hsina-ornitina-arginina) (cont.) objetivo, 113 pruebas alternativas agar con lisina y hierro (LIA), 121 caldo ninhidrina, 122, 126 rápidas lisina descarboxilasa, 123 omitina descarboxilasa, 124 reactivos para, 119 Desnitrificación, 327 Desoxirribonucleasa, pruebas de, 128 bioquímica, 129 interpretación, 139 medios, 135 objetivo, 128 procedimientos alternativos acidométrica, 144 agar DNA de Lombard-Dowell, 144 ensayo turbidimétrico, 143 indirecta rápida, 144 rápido de difusión en orificios en el agar, 143 prueba(s) de DNasa en agar con azul de toluidina O (TBO-DTA), 136, 140, 146 con verde de metilo (MG-DTA), 138, 140, 146 con manitol-ácido, 136, 139 ácida, 135, 139, 145 de termonucleasa, 140 Dextrinas, 385, 389 Diacetilo, 417 DiisopropilfluorofflSfato, 106 DNA (ácido desoxirribonucleico), 129 métodos de hibridación, 431 sondas, 430, 438 DNasa, enzimas, 132 estafilocqcica, 133 estreptocócica. 134 Serraría, 134

E EIA (enzimoinmunoensayo), 430, 434, 438 Electroforesis en gel con campo pulsado, 430, 433, 434, 438 ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), 430 Embden-Meyerhof-Pamas, vía metabólica de, 56, 58, 154, 226, 355 Endonucleasas, 132 Enterobacteriaceae. Véase también géneros específicos en Indice de microorganismos

cambios en la nomenclatura, 674 características generales, 681 clasificación, 676 cuadros de reacciones bioquímicas, 688-697c, 709-710c, 712-721c, 736-737c diagramas de diferenciación, 699-708c, 711c, 722-735c, 738-739c medios para el aislamiento y la identificación, 682-684c para pruebas combinadas, 428 reacciones

del citrato de Simmons, 92c en KIA/TSI, 223, 684-686c sistema de múltiples pruebas, 431 taxonomía, 673 Enterotube, sistema de múltiples pruebas, 432 Entner-Doudoroff, vía metabólica, 56, 58, 172, 312, 355 Enzima(s) adaptables (inducidas), 114, 151, 152 amilasa, 387, 394 beta-lactamasa, 237 caseasas, 276 catalasa, 298 constitutiva, 179, 237, 269 descarboxilasas, 114 DNasa, 132 fosfolipasas, 269 gelatinasa, 161 hipuricaza, 178 inducidas, 237 lecitinasa, 254 leucina aminopeptidasa, 264 lipasa, prueba para, 267 lisostafina, 286 oxidasa, 345 permeasa, 153 pirrolidonasa, 381 succínico deshidrogenasa, inhibición de, 291 triptofanasa, 207, 214 ureasa, 398 Episomas, 143, 237 Equipos, 317. Véase también Sistem a de múltiples pruebas

API Quad-Ferm +,317 API Rapid Strep, 265 BactiCard N eisseria , 319 Streptococcus, 265 Gonobio, 318 Gonochek n, 319 Minitek, 317, 322 Neisseria-Kwik, 318 Neisstrip, 319 Eritrocitos, membranas, 36 Eritrodextrinas, 389, 393 Escatol, 207, 214 Esculina, 8 prueba de la mancha, 13 Esfingomielina, 34, 35, 37, 41, 255, 270 Esfingosina, 35, 268 Estafilocoagulasa, 99 Estafilotrombina, 106 Estreptococos, 5 Estreptolisina, 7, 49 Exonucleasas, 132

F Factor V. Véase X y V, factores de la yema de huevo, 255 Fenilalanina desaminasa, prueba de, 362 bioquímica, 362 discos o comprimidos, 366 interpretación, 365

Indice 1 - General medio con fenilalanina, 363 líquido con fenilalanina-malonato, 365 objetivo, 362 precauciones, 366 reactivos, 364 Fenilenediamina, 349 Fenol, 181, 369 Fenolftalefna, 368, 374 Fermentación ácido(s) láctico, 58 mixtos, 58 propiónico, 58 alcohol butílico, 58 citrato, 93 grupo coliforme, 58 hidratos de carbono, 54, 56 ácidos mixtos, 302, 411 formación de gas, 278 lactosa, 154 (leche tornasolada), 275 produccción de gas, 302 prueba de O/F, 354 de rojo de metilo, 302 reacciones en KIA/TSI, 226 prueba del malonato, 293 shunt de la pentosa, 56, 58 vía metabólica de Embden-Meyerhof-Pamas, 56, 58 de Entner-Doudoroff, 56, 58 Fermentación alcohólica, 58 Fibrinógeno, 99,106 Fibrinólisis, 102 Flagelos, 310 Flavoproteínas, 74, 77, 297 Fluoresceína, pigmento, 335 Fluorescencia, 143, 377 Formazán, 308 Fosfatasa, prueba, 368 agar sangre fosfato (PDPBA), 372 bioquímica, 368 discos/comprimidos, 374 hidrólisis del PNP (p-nitrofenilfosfato), 374 interpretación, 372 medio con difosfato de fenolftaleína (PDP), 370 objetivo, 368 precauciones, 374 procedimiento con verde de metilo fosfato (MGP), 373 prueba de la mancha, 374 reactivos, 372 Fosfatidasa D, 254 Fosfatidiletanolamina, 255 Fosfoglicéridos, 35, 39, 254 Fosfolipasas, 269 C, 34, 37, 254, 269 D, 33, 34, 45 Fosfolípidos, 35,254, 267 Fosforólisis, vía metabólica, 313 Fucsina ácida, 684c

G Gamma-glutamil

831

aminopeptidasa, 319 p-nitroanilida, 319 Gelatina, pruebas de licuefacción de la, 160 bioquímica, 161 interpretaciones, 165 medio de gelatina nutriente en placa, 164, 166 para punción, 163, 166, 170 de Kohn de gelatina, 161,165, 169 de tioglicolato gelatina, 164, 166 método de película radiográfica, 167, 170 objetivo, 160 procedimiento del cloruro de mercurio, 166, 170 Glicéridos, 268 Glicerofosfolípidos, 35, 39 Glicerol, 267, 269, 289 Glicina 25, 177, 184, 286, 288 Glucógeno, 388 Glucolípidos, 268 Gluconato, prueba de oxidación del, 172 bioquímica, 172 interpretación, 175 medios, 173 objetivo, 172 reactivos, 174 Glucosa hidrólisis del almidón, 385 isómeros ópticos, 386 medios KIA/TSI, 226, 227 oxidación, 172 Glucosán, 385 Glucósido, 55 Gonobio, prueba, 318 Gonochekn, 319 GonoGen I, prueba, 320 Gramnegativas, bacterias, 580 cambios de nomenclatura, 584 descripciones y cuadros de los géneros, 592-646c características diferenciales, diagramas de, 592-594c diagramas bacilos aerobios y anaerobios facultativos diferenciación inicial, 647c MacConkey ausencia de crecimiento, 660 663c crecimiento en, 648-657 bacillus microaerófilos a anaerobios, 665-670c cocos aerobios y anaerobios facultativos, 664c anaerobios, 671c Grampositivas, bacterias, 451 clasificación, 451 descripciones y cuadros de los géneros, 466 diagramas, 530-577c bacilos aerobios y anaerobios facultativos Bacillus, 538c Corynebacterium, 539-543c Listeria, 544c reacción de catalasa, 532-537c anaerobios Clostridium, 546-553c diferenciación inicial, 545c reacción de catalasa, 554-559c

832

Indice 1 - General

Grumpositivas, bacterias (cont.) cocos aerobios y anaerobios facultativos) 560c Enterococcus, 570-571c reacción de catalasa, 561-569c Staphylococcus, 565-567c Streptococcus, 572-575c anaerobios, 576-577c PepiopstYcptococcus, 577c por la forma, 530c por requerimiento de oxígeno, 531c, 560c nomenclatura, 455 Guanidina, núcleo, 417, 418 Guanina, 130

H Hemaglutmación pasiva, 437 Hemina, 376 Hemoglobina, 422 Hemolisinas y prueba CAMP, 33 Hemoproteínas, 74 Hidratos de carbono ácidos mixtos, 302,411 clasificación, 55, 55c discos diferenciales, 61 fermentación, 56, 355 formación de gas, 278 KIA/TSI, reacciones en, 226 lactosa,163-164,295-297 en medios, 60 método de esterilización, 62, 357 para Neisseria, 312 oxidación, 172, 356 produccción de gas, 227, 230, 231, 233, 302 pruebas, 54 de fermentación de, 54 bioquímica de, 55 discos, 64 interpretación, 63 medios, 59, 64 objetivo, 54 produccción de gas, 70 del rojo de metilo, 302 Hidrazina, 365 Hidrólisis almidón, 385 de bilis y esculina, pruebas, 8 bioquímica de, 9 interpretaciones, 12 medios, 10 objetivo, 8 pruebas alternativas, 14 rápidas, 12 de la esculina, prueba, 8 del hipun.to, prueba de, 177 bioquímica, 177 cromatografía en capa delgada, 186 gaseosa, 186 detección del producto final glicina, 184 interpretación, 184 medí 182

ninhidrina, 184, 189 objetivo, 177 precauciones, 187 prueba del disco, 187 MA, 187 reactivo de cloruro férrico, 179, 189 Hidroxilamina, 327 Hidroxiprolil aminopeptidasa, 319 Hirudina, 106 Histozima, 179

I IDS Rapid ID, sistema de múltiples pruebas, 429, 430, 433, 435, 438 Immunocard, sistema de múltiples pruebas, 430 Indofenol, 346, 350 Indol, pruebas de, 206 bioquímica, 207 interpretaciones, 211 medios, 208, 213 múltiples pruebas, 213 indol-nitrito, 213, 215 movilidad-indollisina (MIL), 213 omitina (MIO), 213 sulfuro (SIM), 213 nitrato, medio, 428 objetivo, 206 prue' >as rápidas, 211 microtécnica, 212 prueba en mancha, 211, 214 reactivos de Ehrlich, 209, 214 de Kovac, 209, 214 Indolil, 144 Inmunofluorescencia directa (DEA), 430 para la identificación de Neisseria gonorrhoeae, 320, 323 prueba con anticuerpos monoclonales (FA), 435 Inositol, 55 Isómeros ópticos, 386

K Kanamicina-bilis, prueba del disco, 16

L Lactasa, 153 Laurilsulfato de sodio, 26 Lecitina, 36 Lecitinasa, prueba de, 254 bioquímica, 254 interpretaciones, 259 medios, 256 objetivo, 254 precauciones, 260 Lecitovitelina, 255 Leucina aminopeptidasa (LAP), prueba, 263 enzima y sustrato, 264 interpretación, 265

índice 1 - General objetivos, 263 precauciones, 265 praeba(s) de mancha en disco, 265 en los sistemas en equipo, 265 reactivo DMACA, 264 Ligadura hemiacetal, 387 Ligandos, 182 Lipasa, prueba de la, 267 bioquímica, 267 interpretación, 272 medios, 270 con yema de huevo para las reacciones, 259 objetivos, 286 precauciones, 282 prueba de la caseólisis rápida para Enterococcus, 282 Lisina descarboxilasa, prueba para agar con lisina y hierro (LIA), 121 bioquímica, 114 caldo ninhidrina, 122 cromatografía gaseosa, 124 descarboxilasa de Mpller, 118 de Falkow, 118 método de Brooker-Land, 123 de la mancha, 123 objetivo, 113 Lisostafina, prueba de sensibilidad, 284 bioquímica, 284 interpretación, 288 objetivo, 284 precauciones, 288 procedimientos, 287 reactivos, 287 Lisozima, 286

M Malonato, prueba de, 291 bioquímica, 291 caldo para fenilalanina-malonato, 365 interpretación, 294 medios, 293 objetivo, 291 precauciones, 295 Maltosa, 321, 387, 388 Meíio(s) agar para aislamiento del Clostridium botulinum (CBI), 270 con base de esculina y estreptomicina-cloranfenicol, 17 con bilis y esculina (BEA), 11, 194c, 197 para Bacteroides, 8, 14 y caldo con bilis, esculina y azida, 11 chocolate, 321 para Clostridium difficile, 258 Columbia, 256, 373 con desoxicolato y citrato, 682c y lactosa, 682c y sacarosa, 683c entérico Hektoen, 682c con eosina y azul de metileno, 683c con hierro de Kligler (KIA), 229 infusión de cerebro y corazón (BHIA), 422

833

lecitina lactosa para anaerobios, 256, 428 lipasa para anaerobios, 257, 428 con leche tornasolada, 281 lipasa manitol salado (LSM), 271, 272 con lisina y hierro (LIA), 121 MacConkey, 683c para la prueba de DNasa (DTA), 135 con azul de toluidina O (DTA-TBO), 136, 140 estándar, 135, 139 con manitol, 136,139 con verde de metdo (DTA-MG), 138, 140 para Salmonella-Shigella, 682c sangic fosfato (PDPBA), 372 con sulfito de bismuto, 682c con trehalosa-manitol-fosfato (TMJ’A), 429 con triple azúcares y hierro (TSI), 229 con tripticasa y cistina (CTA) con hidratos de carbono, 313, 316, 322 y soja (TSA), 382, 422 con triptosa y fosfato (TPA), 373 verde brillante, 682c con xilosa-lisina-desoxicolato, 682c yema de huevo de McClung-Toabe, 258 para aislamiento y diferenciación de Enterobacteriaceae, 682-684c almidón, 390 base descarboxilasa de Mpller, 117, 126 bicarbonato (NaHC03), 316 buffer fosfato, 333, 404 caldo con esculina para anaerobios, 14 con gluconato y peptona, 173 hipurato, 182 infusión cerebro y corazón (BHIB), 422 para malonato, 293, 294 ninhidrina, 122 nutritivo, 199 peptona, 208, 213 PYR, 382 TB para la reducción de nitrato, 333 con tiopeptona, 199 de Todd-Hewitt, 382 con trehalosa-manitol, 429 con tripticasa y nitrato, 213 y soja (TSB), 199 triptófano, 208 carbón vegetal (gelatina de Kohn), 161 caseína, 208 citrato de Christensen, 94 de Simmons, 94 coagulasa agar manitol, 105,109,428 comprimidos Key para sustrato de la prueba de glucona to, 174, 175-187 entéricos OF, 356 escuüna, tamponado, 13 fenilalanina, 294, 363 fermentación de hidratos de carbono, 59, 64 para anaerobios, 64 caldo con peptona y levadura, 64 discos diferenciales, 61

834

índice 1 - General

Medio(s) (cont.) para estafilococos y entéricos, 68 para estreptococos, 67 con indicador de Andrade, 59 rojo fenol, 59 medio tioglicolato, 65, 71 método de esterilización, 62 FLN (medio fluorescencia-lactosa-nitrato), 428 fluorescencia-desnitrificación (FN), 335, 428 FN (medio para fluorescencia-desnitrificación), 428 gelatina para aerobios con bajo contenido de peptona, 168 agar de Chapman Stone, 167 en placa, 168 para Staphylococcus, 168 BCYE (carbón y extracto de levadura tamponado), 168 diluida, 168 Kohn, 161 Lombard-Dowell, 168 metronidazol cadmio, 168 nutriente, 163 peptona y levadura, 168 tioglicolato, 164 glucosa-suero, picos de flauta de agar, 199 gonococo cisterna (GCC), 322 medio para la identificación de (GCID), 315, 317, 322 hemoglobina (Hb), 315 hidróxido de sodio, 59 indicadores de pH azul de bromotimol, 684c fucsina acida, 684c púrpura de bromocresol (BCP), 117, 118, 684c rojo cresol, 117 fenol, 684c neutro, 684c indol nitrato, 428 nitrito, 213, 215 IsoVitaleX, 316, 322, 405 kanamicina-bilis-esculina (KEB), 8, 16 leche tornasolada, 279 lisina descarboxilasa de Falkow, 118, 126 omitina-manitol (LOM), 428 Lombard-Dowell (LD), 428 medios de Clark y Lubs, 302 modificado, 415 con difosfato de fenolftaleína (PDP), 370 de Edwards y Ewing, 310 con fenilalanina-malonato, 365 con leche y azul de metileno, 298 para movilidad nitrato, 309, 429 sulfuro, 310, 429 con nitrato para especies delNeisseria, 334 con fluorescencia lactosa (FLN), 336 para la reducción de nitrato o nitrito, 335 selectivo para botulismo (BSM), 271, 272

de transporte, 321 movilidad, 306, 309 con sales de tetrazolio, 307, 309 movilidad indol lisina (MIL), 213, 309, 429 omitina (MIO), 213, 309, 429 sulfuro-indol (SIM), 213, 310, 429 MR/VP, 302, 415, 429 nitrato, 327 discos/comprimidos de, 335 de potasio, 327 nitrito, tiras reactivas para la prueba de, 332 OF, 356 de Hugh y Leifson, 356, 360 optoquina, discos, 340 prueba de ácido sulfhídrico, 194 agar con bilis y esculina (BEA), 194c, 197 * con desoxicolato, 194c, 195, 203 entérico Hektoen, 194c, 196, 203 con hierro de Kligler (KIA), 194c, 195, 203 con lisina y hierro (LIA), 194c, 196, 203 movilidad-sulfuro-indol (SIM), 195c, 196, 203 con peptona y hierro, 194c, 196 Salmonella-Shigella, 194c, 197 con sulfuro de bismuto, 194c, 203 citrato, 194c, 197 con tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS), 195c, 197 con triple azúcares y hierro (TSI), 195, 195c, 203 con xilosa, lisina y desoxicolato (XLD), 195c, 197, 204 cuadro de, 194c tiras reactivas de acetato de plomo (PbAc), 194c, 199, 202, 204 de ureasa agar con urea de Christensen, 399, 402, 408 caldo U-9, 402, 403, 408 con urea para micobacterias, 404 R (rápida), 401, 402, 408 de Stuart, 398, 401, 407 comprimidos para la prueba de ureasa, 406 discos de urea, 404, 406 fenilalanina, 406 prueba con tiras reactivas CLO, 406 con urea tamponado, exento de azida, 405 rojo de metilo-Voges Proskauer, 302, 415, 429 sales de tetrazolio, 307, 310 sangre de oveja, 315 semisólido selectivo para movilidad (SSM), 309 solución de caldo-cisteína, 256 de cicloserina, 270, 271 de lecitina, 256 salina balanceada, 406 de Elrod y Braun (modificada con hidratos de carbo no), 315,317

Indice 1 - General VPl, 64 de vitamina K y hemina, 65 Staph OF, 356, 360c tioglicolato, 65, 71 gelatina, 164 verde de metilo y fosfato, 373 yema de huevo, 256, 271 Membranas del eritrocito, 36 Meritec GC, prueba de, 320 Meticilina, 239, 243 Metionina, 192 Micro-ID, sistema de múltiples pruebas, 432, 434 Microbiología molecular, 428, 439 Microorganismos ácido alcohol resistentes, 534c MicroScan, sistema de múltiples pruebas, 432, 436, 437 Minitek sistema de disco, 317, 322 de múltiples pruebas, 430, 432, 437 Movilidad, prueba para, 306 combinación de medios, 309 gota pendiente, 309 interpretación, 309 medio(s) para movilidad indol Usina (MIL), 429 omitina (MIO), 429 nitrato, 429 sulfuro, 429 OF, 359 para la prueba de movilidad (semisólidos), 306 semisólido selectivo para movilidad (SSM), 309 objetivo, 306 precauciones, 310

N NaCl, tolerancia al, 18 Nagler, pmeba de, 254 Neisseria-Kwik, 318 Neisstrip, 319 Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), 422 Ninhidrina, 184, 189 Nitrato y nitrito, pruebas de reducción de, 326 bioquímica, 327 para especies de M ycobacterium , 332, 337 de N eisseria , 334 interpretación, 331 medios caldo TB para la reducción de nitrato, 333 fluorescencia-desnitrificación (FN), 335 medio con nitrato para especies de Neisseria, 334 nitrato de potasio, 327 tiras reactivas para nitrito, 332 método del disco para anaerobios, 334 objetivo, 326 precauciones, 336 pruebas rápidas, 335 discos/comprimidos, 335 prueba de la mancha, 335 reactivos, 328 Nitrocefina (cefalosporina cromogénica), 244, 248

835

Nomenclatura, cambios en bacterias gramnegativas, 584 grampositivas, 455 Enterobacteriaceae, 674 Nucleasa, enzimas, 132 Nucleótido, 129

O ONPG (o-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido), 151, 154 Optoquina, prueba del disco, 339 bioquímica, 339 interpretación, 341 objetivo, 339 precauciones, 341 procedimiento, 339 Omitina descarboxilasa, prueba de bioquímica, 114 cromatografía gaseosa, 124 descarboxilasa de Mpller, 117 objetivo, 113 prueba rápida, 124 Oxacilina, 239, 243 Oxidación de ácido succiínico, 291 citocromo oxidasas, 345 de fenilalanina, 362 fermentación, prueba de, 354 bioquímica, 355 interpretación, 332 fermentación, 355 oxidación, 356 interpretación de la prueba de dos tubos, 359 medios, 356 objetivo, 354 precauciones, 360 procedimiento, estándar de dos tubos, 357 gluconato, 172 de hidratos de carbonos por Neisseria, 312 procedimiento, 373 pmeba de O/F, 354 reducción, indicador azul de metileno, 297 tornasol, 276 Oxidasa, pmeba de, 344 bioquímica, 345 interpretación, 350 objetivo, 344 procedimientos discos, 348 pmeba en hisopos, 348 soluciones de reactivos, 348 tiras impregnadas con, 351 reactivos, 346 Oxígeno (0 2), requerimiento diferenciación de bacilos grampositivos, 531c de cocos grampositivos, 560c

P P-nitrofenil-beta-D-galactósido (PNPG), 151, 157, 159

836

índice 1 - General

PACE (ensayo con sonda con incremento de la quimioluminiscencia), 436 PACE-2NG, sonda, 320 PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida), 429, 434 Paracaseína, 277 Pared celular, 26, 238, 284 Patógenos del tracto urinario, equipos de múltiples pruebas para la detección, 431 Penicilinas, 238,402, 403 Pentosa, derivación (shunt) de la, 56, 58, 312, 355 Pepsina, 277 Peptidasas, 286 Peptidoglucano, 26, 238, 284 Peptona ácido sulfhídrico, producción a partir de, 193, 195 composición de aminoácidos, 286 en medios KIA/TSI, 227, 228, 229 prueba del rojo de metilo, efecto en, 304 Peptonización, 276, 281 Peroxidasa, prueba de bioquímica, 74 interpretación, 81 objetivo, 73 prueba para células enteras, 81, 82, 87 Peróxido de hidrógeno (H20 2), 74, 297, 345 pH, indicadores. Véase R eactivos pH, indicadores Phadebact GC OMNI, prueba, 320, 323 Piocianina, 146 Piranosa, 386 Piridoxal, fosfato de, 118, 126 Pirimidinas, 130 Pirrol, estructura, 210 Pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), prueba de hidrólisis, 3. 407-410 enzima/sustrato, 381 interpretaciones, 383 objetivo, 380 precauciones, 383 pruebas del disco y de la mancha, 382 rápidas, 382 reactivo DMACA, 381 Plasma, coagulación, 99 Plásmidos, 237, 243 Polisacáridos, 55, 385. Véase también H idratos de carbono

Porfirinas, 376 Porfirina-ácido 8-aminolevulínico (ALA), prueba de, 376 bioquímica, 376 interpretaciones, 378 objetivo, 376 precauciones, 378 procedimientos, 377 Premier, sistema de múltiples pruebas, 430, 432 Productos finales, detección, 394 Proteasas, 106 Proteínas, catabolismo por las gelatinasas, 161 Proteinasas, 161 Protoporfirina, 75, 376, 422 Protótrofo, 320 Protrombina, 99, 100, 106 Puentes hidrógeno, 131 Pininas, 130 ' Púrpura de bromocresol (BCP), 117, 118, 684c

Putrescina, 114, 124 PYR, prueba. Véase PirrylidoniI-beta-naftilamida(PYR), prueba de hidrólisis

Q Quimotripsina, 277 Quinona, 211, 350, 369

R Reacción en cadena de la ligasa, 436, 439 de la polimerasa, 429, 436, 438 Reactivos. Véase también M edio(s) acetato de uranio, 187 ácido acético, 328 clorhídrico, 138, 334 sulfanflico, 329, 337 alcohol amílico, 209 isoamílico, 209 alfa naftilamina, 329, 336 naftol, 415, 419, 420 almidón, solución, 247 de Andrade, 59, 60, 69, 70, 684c azida sódica, 11 azul de metileno,71 de toluidina O, 136, 146 de Barritt, 415, 419 de Benedict, 174, 394 beta galactosidasa, 318 naftilamina, 318, 381 naftol, 318 bilis esculina rápida (RBE), 13 buffer fosfato, 155, 245, 246, 287 M/15,78 cinc, 330, 337 Clinitest, comprimidos, 174, 394 clorhidrato de dimetil-p-fenilenediamina, 347, 349, 352 de p-aminodimetilanilina, 347 cloruro férrico, 179, 189, 364 de mercurio, 166 Coblentz, 415 creatina, 416 desoxicolato de sodio, 27 dihidroclorhidrato de N-(l-naftil)etilenediamina, 334 de p-fenilenediamina, 85 de tetrametil-p-fenilenediamina, 346, 347, 348, 349 discos de oxidasa, 347, 348 dopamina, 85 de Ehrlich para indol, 209, 214 etanol, 394, 415 fibrinógeno, 101 gamma-glutamil aminopeptidasa, 318 Gram, yodo de, 246, 391 Hemo-De, 214

Indice 1 - General heparina, 101 hidróxido de potasio, 415, 417, 419, 420 de sodio, 27, 119, 372 hidroxiprolil aminopeptidasa, 319 indofenol oxidasa, 347 indoxil butirato, 319 de Kovac para indol, 209, 214 para oxidasa, 346, 347, 350, 351, 352 lisostafina, solución, 287 de Lugol, yodo, 391, 395 MAD (agar metacromático-difusión)| 141 N,N-dimetil-a-naftilamina, 329, 337 naranja de acridina, 141 de Nessler, reactivo, 120, 329 ninhidrina, 122, 184, 189 nitrocefina (cefalosporina cromogénica), 244 de O’Meara, 416 o-dianisidina, 81 o-nitrofenil beta-D-galactopiranósido (ONPG), 155, 157 oxalato de dimetil-;;-aminod¡mctilanili ra, 347, 349 de p-aminodimetilanilina, 347 oxidación-reducción, indicador, 65, 66 oxidasa de Gordon y McLeod, 347 p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA), 209, 211 p-Dimetilaminocinamaldchído (DMACA), 264, 381 p-nitrofenil-beta-D-galactósido (PNPG), 157 p-nitrofenilfosfato (PNP), 374 PADAC (piridina-2-azo-dimetilanilina-cefalospoiina), 245, 248 penicilina G potásica, 402 peróxido de hidrógeno, 74, 86 pH, indicadores azolitmina, 279, 282 azul de bromotimol (BTB), 69, 69c, 293, 315, 356, 366, 684c cloruro férrico, 294 fucsina ácida, 684c para medios con hidratos de carbono, 69 púrpura de bromocresol (BCP), 69, 69c, 117, 118, 357, 684c rojo de metilo, 302, 303 neutro, 684c tornasol, 276, 278, 280 plasma, 101 prueba del ácido 8-aminolevulmico (ALA), 377 resazurina, solución, 65 rodamina B, 187 rojo fenol, 59,69, 230, 247, 313, 398, 399,402, 684c fenolftaleína, 369 sulfanilimida, 334 sulfato de amonio férrico, 364 superoxol (H20 2 al 30% ), 86 taurocolato de sodio, 27 Taxo X, V y XV, tiras reactivas y discos, 422 tolueno, 155 Tween 80, 78, 87 vapores de amoníaco, 372 verde de metilo, 138, 146 Voges-Proskauer, 415 de Wurster, 349

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xileno, 214 yodo de Gram, 391 de Lugol, 391, 395 Reducción del azul de metileno, 297 pruebas de nitrato y nitrito, 327 renina, 276, 277 Ribotipificación, 431 RIM-H (Método de identificación rápido), sistemas de múltiples pruebas, 433 Rojo cresol, 117 fenol, 59, 69, 684c de metilo, prueba del, 301 bioquímica, 302 interpretaciones, 304 medios, 302 microtécnica rápida, 304 objetivo, 301 precauciones, 304 reactivo, 303 neutro, 684c

S Sacaropina, 122 Sacarosa y medios KIA y TSI, 226, 230, 234 Sales biliares, 25 Salmonella-Shigella, agar, 682c Schiff, base, 264, 381 Shandon Hemo-De, 214 Sinergismo, 34 Sistema de múltiples pruebas, 427 Accuprobe, 430, 435 API, 429, 430, 438 BactiCard, 431, 435 BBL, 430, 431, 436 criterio global, 427 Enterotube, 432 IDS RapidID, 429, 433, 435, 438 Immunocard, 430 para la identificación de anaerobios, 429 de bacilos gramnegativos con requerimientos especiales de cultivo, 433 gram; lositivos, 433 de bacterias gramnegativas, 433 de Bordetella pertussis, 430 de Burkholderia, 430 de Clostridium difficile, 430 de especies de Brucella, 430 de Campylobacter, 430 de Corynebacterium, 430 de Enterococcus, 431 de Haemophilus, 433 de Staphylococcus, 436 de Streptococcus, 438 de Vibrio, 438 de la familia Enterobacteriaceae, 431 de rrancisella tularensis, 433 de H elicobacter pylori, 434

838

índice 1 - General

Sistema de múltiples pruebas (cont.) de Lactococcus y Leuconostoc, 434 de N eisseria y M oraxella catarrhalis, 435 de Ureaplasma urealyticum, 438 medios de pruebas combinados, 428 Micro-ID, 432, 434 MicroScan, 430, 436, 437 Minitek, 430, 432, 437 Premier, 430, 432 RIM-H (Método de identificación rápida), 433 Vitek, 430, 432, 433, 435, 437 Sulbactam, 244 Sulfametoxazol, 270, 271 Sulfametoxazol-trimetoprima, 4 Sulfuro-tndol-movilidad, medio, 429 Superóxido dismutasa (SOD), 74, 77 radical ( » 2), 74, 77 Superoxol, 78

T Taurina, 25 Tazobactam, 244 Tecnología chip de genes (Gene chip technology), 439 Termonucleasa, 104 pruebas para ADA (naranja de acridina-desoxirribonucleato-agar), cobertura con, 141, 147 bioquímica, 129 hemocultivos, 140 MAD (agar metacromático-difusión) técnica en microportaobjeto, 141, 147 objetivo, 129 STN (prueba de termonucleasa simplificada), 141 Tintina, 130 Tinción por FA e identificación de Neisseria gonorrhoeae, 320, 323 Tiosulfato reductasa, 192, 193 Transducción, 243 Transferencia por conjugación, 237 Transformación, 319 Transpeptidación, 286 Transposón, 237 Trehalosa-manitol caldo, 429 fosfato, agar (TMPA), 429 Triglicéridos, 268, 269 Trimetoprima, 5, 270, 271, 309, 405 Trombina, 99, 100, 106 Tromboplastina, 255

u Unión(es) beta-glucosídicas, 130

éster, 269, 318 glucosídicas, 152, 387 peptídica, 178 Urea, 115 Ureasa, prueba de, 397 agar con urea de Christensen, 399, 402, 408 bioquímica, 398 caldo U-9 (medio para la prueba de color de ureasa), 402, 403, 408 con urea para micobacterias, 404 R (rápida), 401, 402, 408 de Stuart, 398, 401, 407 para especies de Haemophilus, 406 para H elicobacter pylori, 405 interpretación, 401 objetivo, 397 precauciones, 407 procedimientos con radioisótopos, 406 prueba(s) rápidas, 406 CLO striptest, 406 comprimidos para ureasa, 406 discos de urea, 406 fenilalanina (discos PDA), 406 de ureasa con disco, 404

y Vancomicina, 405 Vitek, sistema de múltiples pruebas, 430, 432, 433, 435, 437 Voges-Proskauer, prueba, 411 bioquímica, 411 interpretación, 418 medios, 415 objetivo, 411 precauciones, 419 procedimiento, 416 prueba(s) rápida, 419 alternativas, 418 reactivos, 415, 419

X X y V, factores, 376 bioquímica, 422 interpretación, 423 medios y reactivos, 422 objetivo, 422 precauciones, 423 procedimiento, 422 Xilosa-lisina-descarboxilasa, agar, 682c

Indice 2 - Microorganismos

A Abiotrophia, 453, 466, 569c adiacens, 263c, 380c defectiva , 263c, 380c Acetobacterium , 453 Acidam inococcus fcrm entans, 582, 595, 671c A cidovorax, 344, 354, 581, 595 647-649c delafleldii, 92, 161, 596c, 649 650c, 652c fa cilis, 92, 161, 596c, 660c, 661c temperara, 92, 161, 596c, 649 650c, 652c Acinetobacter, 161, 344, 354, 466, 581, 595, 647-648c,

656c baum anni, 226, 596c, 740-741c calcoaceticus, 226, 373, 596c, 740-741c haemolyticus, 161, 260, 596c johnsonii, 596c ju n ii, 596c

íw op, 221, 226, 331, 596c, 740-741c ureae, 206 A ctinobacillus, 306, 344, 354, 368, 397, 582, 596, 647-

648c capsulatum, 597c, 657c, 659c equuli, 597c, 657c, 659c hominis, 597c. 660c, 663c lignieresi, 591c, 657c, 659c muris, 368, 597c, 660c, 663c

597c, 657c, 659c, 660c, 663c seminis, 368, 397, 597c, 660c 663c

.vuí'v, 597c, 657c, 659c M/cac, 597c, 657c, 659c, 660c, 663c Actinomyces, 33, 151, 453, 466, 532-535c, 537c israelii, 467c meyeri, 467c naeslundii, 168, 467c neuii

subesp. anitratus, 33, 466, 467c ncMii, 33, 466, 467c odontolyticus, 467c viscosus, 168, 467c Acholeplasma, 582, 594. 647 648c, 660c axanthum , 595c equifetale, 595c granularum, 595c hippikon, 595c laidlawii, 267, 270, 595c morum, 595c oculi, 595c parvum , 595c

Achromobacter, 145, 175c Aerococcus, 187,453, 467, 561-564c, 569c urinae, 73, 263c, 301, 380c, 467c viridans, 73, 187, 263c, 265, 301, 380c, 467c Aeromonas, 18, 113, 128. 192, 215, 306, 344, 354,411,

582, 598, 647-648c, 660c alginolyticus, 657c caviae, 8, 598c, 599c, 657c, 658c, 663c cholerae, 657c eucrenophila, 8, 598c, 599c, 657c, 658c, 663c haemolyticus, 656c hydrophilia, 8, 145, 151, 192, 301, 352, 411, 598c, 599c,

657c, 658c, 663c media, 306, 598, 598c, 599c, 657c, 659c, 663c salmonicida, 306, 598, 663c

subesp. achromogenes, 598c, 599c, 657c, 659c masoucida, 192, 301, 411, 598c, 599c, 657c, 659c salmonicida, 598c, 599c, 657c, 659c smithia, 114, 192, 598c, 599c, 657c, 659c schubertii, 598c, 599c, 657c, 658c, 663c sobria, 8, 411, 598c, 599c, 657c, 658c, 663c veronii, 8, 113, 301, 411, 657c, 658c, 663c Afipia, 344, 354, 580, 599, 647-650c, 660c, 661c broomeae, 326, 362, 599c, 661c clevelandensis, 326, 362, 599c, 661c felis, 326, 362, 599c, 652c, 661c Agrobacterium, 344, 354. 580, 600, 647-648c tumefaciens, 600c, 649c. 654c, 656c Agromyces, 454 A lcaligenes , 344, 354, 581, 600, 647-649c faecalis, 54, 161, 172, 226, 280, 326, 359, 373, 649c,

654c, 740-741c subesp. faecalis, 600c, 664c latus, 54, 161, 226, 326, 600c, 649c, 650c, 651c, 664c. 740-741 c piechaudii, 54, 226, 740-741c xylosondans, 54, 226, 740-741c Alicyclobacillus, 452 A lloiococcus otitulis, 263c, 380c, 453, 468, 561-564c, 568 569c Amycolatopsis, 468 Anaerobiospirillum, 583, 601 665c, 670c Anaerorhabdus furcosus, 583, 601c, 601, 665-667c

Aneurinibacillus, 452 Arachnia propionica. Véase Propionibacterium Arcanobactcr, 569c Arcanobacterium, 453, 468, 532-535c, 537c, 545c, 554-

556c, 558c, 561-564c, 576c bem ardiae, 34, 469c

840

Indice 2 - Microorganismos

Arcanobacterium (cont.) haemolyticum, 34, 469c pyogenes, 34, 73, 160, 469c A rcobacter butzlerii, 226 cryaerophila, 217, 226 nitrofigilis, 192, 226 Arsenophonus nasoniae, 92c, 160, 224, 676, 681, 684c,

688c, 712c Arthrobacter, 453, 469, 568c agilis, 288, 347 Atopobium , 453 Aureobacterium , 454, 469, 532-534c, 536c barberi, 470c flavescens, 470c liquefaciens, 470c superdae, 470c terregens, 470c testaceum, 470c

B Bacillus, 73, 133, 145, 177, 187, 206, 254, 260, 306, 385,

412, 419, 452, 470. 532-533c anthracis, 254, 306, 470, 471-472c, 538c cereus, 254, 471-472c, 538c circulans, 471-472c, 538c coagulans, 471-472c, 538c

esquema de diferenciación, 538c firm us, 471-472c, 538c licheniformis, 3, 254, 471-472c, 538c megaterium, 471-472c, 538c mycoides, 254, 306, 470 pum ilis, 385, 471-472c, 538c sphaericus, 385, 471-472c, 538c stearothermiphilus, 470, 471-472c, 538c subtilis, 142, 393, 471-472c, 538c

Bacterias gramnegativas, 580. Véase también Enterobacteriaceae; géneros específicos

cambios de nomenclatura. 584 descripciones y cuadros de géneros, 592-646c características diferenciales, esquemas de, 592-594c esquemas de diferenciación bacilos, aerobios y anaerobios facultativos diferenciación inicial, 647c MacConkey ausencia de crecimiento, 660-663c crecimiento en, 648-647 bacilos, microaerófilos y anaerobios, 665-670c cocos anaerobios, 671c cocos, aerobios y anaerobios facultativos, 664c grampositivas, 451. Véase también géneros específicos clasificación, 451 descripción y cuadros de géneros, 466 esquemas de diferenciación, 530-577c bacilos, aerobios o anaerobios facultativos Bacillus, 538c Corynebacterium, 539-543c Listeria, 544c reacción de catalasa, 532-537c bacilos, anaerobios^ p C lo stn d ’um, 546-553c diferenciación inicial, 545c

reacción de catalasa, 554-559c cocos, aerobios y anaerobios facultativos, 560c Enterococcus, 570-571c reacción de catalasa, 561-569c Staphylococcus, 565-567c Streptococcus, 572-575c cocos, anaerobios, 576-577c Peptostreptococcus, 577c por la forma, 530c por requerimiento de oxígeno, 531c, 560c nomenclatura, 455 Bacteroides, 14, 236, 273, 344, 428, 583, 601. 665-670c caccae, 602c, 667-668c capillosus, 602c, 667-668c cellulosolvens, 602c, 667-669c coagulans, 602c, 665c distasonis, 14, 344, 602c, 667c eggerthii, 20, 344, 602c, 667c forsythus, 602c, 665c fragilis, 8, 14, 20, 67, 87, 165, 236, 244, 393, 602c, 667c galacturonicus, 602 helcogenes, 602c, 667-668c melaninogenicus, 67 ovatus, 14, 603c, 667c, 667-668c polypragmatus, 602, 603c, 665-666c, 670c putredinis, 603c, 665c pyogenes, 603c, 667-669c splanchnicus, 20, 603c, 667-668c suis, 603c, 667-668c tectum, 603c, 667-668c thetaiotaomicron, 14, 17, 602, 603c, 667qp667-668c uniformis, 14, 603c, 667-663c ureolyticus, 344, 601, 602, 603c, 665c vulgatus, 14, 20, 67, 603c, 667-669c xylanolyticus, 602, 603c, 665-666c, 670c Bartonella, 326, 354, 397, 580, 603, 647c, 660c, 661c bacillifonnis, 344, 603, 604c clarrifgeiae, 603 elizabethae, 344, 604c felis, 326, 344, 397, 603 henselae, 344, 603, 604c quintana, 344, 603, 604, 604c vinsonii, 344, 603, 604c Beneckea, 187 Bifidobacterium, 454, 473, 532-535c, 537c, 545c, 556c,

576c Bilophila wadsworthia, 14 Bordetella, 344, 581, 604, 647-649c avium, 306, 326, 397, 605c, 649c, 654c bronchiseptica, 145, 306, 326, 397, 605c, 649c, 650c, 652c parapertussis, 306, 326, 344, 397, 605c, 656c pertussis, 430, 604, 605c, 660c, 661c Brevibacillus, 452, 473 Brevibacterium, 453, 473, 532-536c, 561-562c, 568c casei, 177, 474c epidermidis, 177, 474c iodinum, 111, 474c linens, 111, 474c Brevundimonas, 344, 354, 604, 647-648c diminuta, 385, 605c, 649c, 654c paucim obilis, 129 vesicularis, 129, 385, 605c, 660c, 661c Brochothrix, 453, 474, 532-535c, 561-564c campestris, 54, 411, 475c

índice 2 - Microorganismos thermosphacta, 54, 411, 475c Brucella, 199, 202, 204, 344, 400, 580, 605, 647c melitensis, 354, 606c, 660c, 661-662c

sistemas de múltiples pruebas, 430 suis, 337 B udinera, 676 Burkholderia, 430, 581, 606, 647-648c cepacia, 113, 114, 151, 260, 344, 606, 606c, 649c, 650c,

651c, 652c, 654c gladioli, 113, 114, 344, 606c, 656c mallei, 113, 344, 606c, 649c, 653c, 656c, 660c, 661c pseudom allei, 48, 113, 114, 344, 606, 606c, 649c, 650c,

651c Buttiauxella, 92c, 676 agrestis, 223, 301, 684c, 688c Butyrivibrio, 452,475, 545c, 556-557c, 582, 607, 665-

666c, 670c crossotus, 54, 475c, 607c fibrisolvens, 54, 475c, 607c

c Calo} amator, 452 Calymmtobacterium, 677

Cambios en la nomenclatura bacterias grampositivas, 455 gramnegativas, 584 Enterobacteriaceae, 674 Campylobacter, 128, 177, 186, 217, 219, 309, 344, 354, 582, 607 CLO (microorganismos tipo Campylobacter), 217 coli, 73, 128, 143, 177, 183, 187, 192, 217, 608c, 665c concisus, 73, 192, 608c, 665c curvas, 607 fennelliae, 217 fetus, 73, 665c subesp. fetu s, 608c, 665c veneralis, 608c, 665c hyointestinalis, 73, 192, 608c, 665c jeju n i, 73, 128, 143, 183, 187, 217, 220,405 subesp. doylei, 177, 608c, 665c jejuni, 177, 608c, 665c lari, 128, 143, 177, 187, 217 mucosalis, 73, 192, 608c, 665c rectus, 607 sistema de múltiples pruebas para, 430 spurorum, 73 subesp. bubulus, 192, 608c, 665c sputorum, 192, 608c, 665c upsaliensis, 217, 608c Capnocytophaga, 354, 583, 607, 647c, 660c canimorsus, 114, 151, 161, 326, 344, 608, 608c, 660c cynodegmi, 114, 15^1M16!, 326, 344, 608, 608c, 660c gingivalis, 114, 151, 161, 326, 344, 608, 608c, 660c ochracea, 114, 151, 161, 326, 344, 608, 608c, 660c sputigena, 114, 151, 161, 326, 344, 608, 608c, 660c upsaliensis, 665c Cardiobacterium hominis, 206, 215, 345, 354, 581, 609c, 609, 647c, 660c Cam obacterium , 453

841

Caseobacter. Véase C.orynebacterium polym orphus Cedecea, 8, 83, 92c, 224, 291, 677 davisae, 223, 224, 291, 684c, 688c, 699c, 701c, 706-

707c, 708c, 712c, 722-728c especie 3, 684c, 688c, 702-703c, 712c, 722-726c, 729-730c 5, 684c, 689c, 702-703c, 706-707c, 708c, 712c, 722726c, 729-730c lapageri, 223, 225, 291, 684c, 688c, 702-703c, 712c, 722-726c, 729-730c neteri, 223, 224, 291, 684c, 688c, 702-703c, 704-705c, 712c, 722-726c, 729-730c Cellulomonas, 454, 475, 561-564c, 568c, 576c cellulans, 160 turbata, 160 Centipeda periodontii, 583, 609, 665-666c, 670c Chromobacterium violaceum, 151, 345, 354, 581, 610c, 610, 647-648c Chryseobacterium indologenes, 385 merengóse; ■icum, 385 Chryseomonas tuteóla, 8, 129, 151, 354, 581, 610, 611c,

647-648c, 656c Citrobacter, 83, 92c, 113, 151, 204, 223, 301, 360, 402,

677 amalonaticus, 206, 225, 291, 684c, 689c, 706-707c,

713c, 722-726c amalonaticus biogrupol, 684c, 689c, 706-707c, 713c,

722-726c freundii, 19, 121, 175, 192, 201, 206, 224, 225, 226,

291, 408, 634c, 689c, 702-703c, 706-707c, 709c, 711c, 713c, 722-726c, 729-730c, 736c, 738c koseri, 19, 206, 225, 291, 684c, 689c, 699c, 713c, 722724c Clasificación bacterias grampositivas, 451 gramnegativas, 580 Enterobacteriaceae, 676 Clavibacter, 454 Clostridium, 33, 44, 58, 73, 160, 168, 213, 237, 254, 257, 267, 385, 428, 452, 476, 545c, 561-564c, 569c, 576c aminovalericum, 259c argentinense, 259c, 270, 276c, 476c, 478c, 546c, 549c baratii, 160, 254, 259c, 276c, 385, 476c, 477,478c, 480c, 482c, 546-547c, 550-55le biferm entans, 67, 254, 259c, 276c, 393, 476c, 477, 478c, 546c, 548c bijerinckii, 260c, 276c botulinum, 260c, 267, 270, 276c, 476c, 478c, 479c, 546c, 548c butyricum, 276c, 278, 280, 385, 476c, 478c, 546-547c cadaveris, 259c, 276c, 480c, 482c, 550c, 552c cam is, 73, 260c, 276c, 476,480c, 482c, 532c, 537c, 550c, 552c celatum, 260c, 276c, 476c, 478c, 480c, 482c, 546 547c, 550-551c, 553c chauvoei, 260c, 276c, 476c, 478c, 546-547c clostridioforme, 260c, 276c, 476c, 477, 478c, 546-547c, 548c, 54^c cochlearium, 67, 260c, 267, 276c, 480c, 482c, 550c, 553c d ificile, 259c, 261, 276c, 476c, 477, 478c, 546c, 548c sistemas de múltiples pruebas, 430

842

índice 2 - Microorganismos

Clostridium (cont.) fa lla x, 260c, 276c, 385, 477c, 478c, 546c, 548c ghoni, 254, 259c, 267, 276c glycolicum, 259c, 276c, 477i', 479c, 546c, 548c, 549c haemolyticum, 254, 259c, 276c, 477c, 479c, 546c, 548c hastiforme, 259c, 276c, 480c, 482c, 550c, 553c histolyticum, 78,279c,294c,5 13c,515c,517c,576c,581c,59 0c,593c indolis, 260c, 276c, 480c, 482c, 550-551c, 553c innocuum, 260c, 276c, 481c, 482c, 550c, 553c leptum, 260c, 267, 276c, 481c, 482c, 550-552c, 553c limosum, 254, 259c, 276c malenominatum, 259c, 276c, 477c, 479c, 481c, 482c,

546c, 548c, 549c, 550c, 552c, 553c novyi, 254, 259c, 267, 276c, 477c, 546c, 548c oroticum, 260c, 276c paraputrijicum , 260c, 276c, 481c, 482c, 550-551c perfringens, 33,44, 67, 165, 211, 254, 259c, 272, 276c, 278, 280, 385, 393, 477c, 479c, 546-547c putrefaciens, 259c, 276c, 481c, 482c, 550c, 552c putrificum , 259c, 276c, 477c, 479c, 481c, 546-547c, 550c ramosum, 260c, 276c, 477, 481c, 482c, 550-551c reacciones en leche tornasolada, 276c en medios con yema de huevo, 259-260c sartagoforum, 260c, 276c septicum, 145, 259c, 260c, 276c, 477c, 479c, 546-547c sordellii, 211, 254, 260c, 276c, 477c, 479c, 546c, 548c sphenoides , 260, 276c, 385, 477c, 479c, 546-547c, 548c spiroforme, 260c, 276c sporogenes, 259c, 260c, 267, 272, 276c, 308, 477c, 479c, 546c, 548c subterminale. 260c, 276c, 477c, 479c, 546c, 549c symbiosum , 259c, 260c, 276c, 477c, 479c, 546-547c, 548c, 549c tertium, 73, 260c, 276c, 476, 481c, 482c, 532c, 537c, 550-551c tetani, 165, 260c, 276c, 481c, 482c, 550c, 553c Comámonos, 345, 354, 581, 611, 647-649c, 651c, 652c acidovorans, 54, 214 terrigena, 54, 611c, 649c, 650c testosteroni, 54, 611c, 649c, 650c, 654c Copm coccus, 452, 483, 576c catus, 483c comes, 483c eutactus, 483c Corynebacterium, 33, 45, 73, 98, 151, 187, 192, 267, 306, 368, 385,437,454,483, 532-536c, 561 -564c, 568c accolens, 483, 484c, 539-540c afermentans, 539c, 541c subesp. afermentans, 33, 483,484c lipophilum, 483 amycolatum, 483, 484c, 539c, 541c, 542c aquaticum, 306, 483, 485c, 539c asperum, 483 auris, 33, 483 bovis, 33, 151, 483, 484c, 539c, 541c callunaestriatum, 539c, 541-543c callunae, 483, 484c coylae,35,522 cystitidis, 483, 484c, 539c, 541-543c diphtheriae, 133, 145

subesp. b e lfm tii, 483, 484c, 539c, 541c, 542c gravis, 368, 385, 483, 484c, 539-540c intermedins, 483, 484c, 539-540c mitis, 483, 484c, 539-540c

esquemas de diferenciación, 539-543c flavescens, 483, 484c, 539c, 541c, 542c glucuronolyticum, 33, 483 glutamicum, 484c, 539-540c jeikeium , 483, 485c, 539c, 541c kutscheri, 485c, 539c, 541 543c macginleyi, 483 matruchotii, 306, 483, 485c minutissimum, 485c, 539c, 541c, 542c mycetoides, 485c, 539c, 541c, 542c pilosum , 485c, 539-540c pseudodiphtheriae, 485c, 539-540c pseudotuberculosis, 45, 160, 267, 483, 485c, 539c,

541c renale, 48, 485c, 539c, 541c

sistemas de múltiples pruebas, 430 striatum, 33, 160, 483, 485c, 539c, 541c, 542c ulcerans, 45, 267, 483 urealyticum, 483 vitarumen, 485c, 539-540c xerosis, 485c, 539-540c Cryptococcus, 17, 18, 21, 398 neoformans, 8, 17, 21 Curtobacterium, 454

D Deinococcus, 451, 486, 561-564c proteolyticus, 151, 486c radiodurans, 151, 486c radiophilus, 151,486c rudiopugnans, 151, 486c D erm abacter hominus, 454, 486, 532-535c, 561-564c D erm acoccus nishinomiyaenis, 347, 454 Dietzia, 454

E Edwardsiella, 83, 92, 92c, 113, 226, 291, 677 hoshinae, 224, 291, 301, 306, 684c, 689c, 713c ictaluri, 225, 301, 306, 684c, 689c, 713c tarda, 192, 224, 226, 230c, 306, 685c, 736c, 738c,

739c tarda biogrupo 1, 301, 306, 685c, 689c, 699-700c, 713c,

722c, 733-734c Eikenella corrodens, 206, 214, 345, 354, 393, 424, 581,

611, 612c, 647c, 660c, 661c Enterobacter, 19, 58, 83, 84, 92c, 113, 128, 206, 234, 291,

293c, 304, 306, 362, 397, 399, 400, 402,411,414, 415,419, 677 aerogenes, 19, 113, 120c, 211, 223, 225, 294, 301, 303, 316c, 412, 419, 685c, 689, 706-707c, 713c amnigenus, 223, 224 biogrupo 1, 684c, 689c, 706-707c, 713c, 722-724c 2, 684c, 689c, 706-707c, 708c, 713c, 722-726c asburiae, 223,224, 291, 306, 397, 684c, 689c, 706-707c, 708c, 713c, 722-726c cancerogenus, 225, 684c, 713c, 722-724c

índice 2 - Microorganismos

843

cloacae, 19, 120, 120c, 211, 223, 291, 301. 397, 418,

coli, 19, 58, 67, 83, 87, 92, 97, 113, 124, 145, 155, 165,

684c, 689c, 706-707c dissolvens, 223, 224, 306, 397, 684c, 690c, 706-707c, 713c gergoviae, 113, 223, 225, 397, 684c, 690c, 699c, 714c, 722c, 733-734c hormaechae, 225, 306, 397, 684c, 690c, 714c, 722-726c intermedius, 223, 684c, 690c nimipressuralis, 223, 684c, 690c sakazakii , 223,291, 685c, 690c, 706-707c Enterobacteriaceae, 8, 12, 19, 83, 84. 172, 187, 344, 647648c. Véase también género específicos cambios en la nomenclatura, 674 características generales, 681 clasificación, 676 cuadros de reacciones bioquímicas, 688-697c, 709-710c, 712-721c, 736-737c esquemas de diferenciación, 699-708c, 711c, 722-735c, 738-739c medios para el aislamiento y la identificación, 682-684c de pruebas combinadas para, 428 reacciones en citrato de Simmons, 92c en KIA y TSI, 223, 684-686c sistemas de múltiples pruebas, 431 taxonomía, 673 Enterococcus, 8, 18, 73, 87, 108, 177, 187. 188, 263c, 275, 282, 296, 380c, 453, 487, 569c avium, 296, 488c, 570-571c casseliflavus, 296, 488c, 570-571c

175, 201, 206, 211, 217, 221, 223, 225, 230, 280, 291, 293c, 294, 301, 303, 304, 306, 308, 331, 350, 358, 365, 393, 401, 411, 412, 414, 415, 418, 419, 683c, 684c, 691c, 699-700c, 704-705c inactiva, 684c, 691c, 699-700c, 701c, 704-705c, 714c, 722-732c fergusonii, 54, 206, 225, 291, 684c, 714c, 722c, 733734c hermana, 206, 223, 225, 684c, 691c, 706-707c, 708c, 715c, 722-726c vulneris, 206, 223, 225, 291, 684c, 691c, 702-703c, 704705c, 715c, 722c, 729-734c

cecorum,316,529c,531c,614-615c columbae,529c,531c,614-615c dispar, 296, 489c, 570-57le durans, 296, 489c, 570-571c

esquemas de diferenciación, 570-571c faecalis, 17, 18, 87, 188c, 201, 236, 243, 250, 265, 280, 296, 298, 341, 382, 488c, 570-571c faecalis, variante, 570-57le faecium , 296, 488c flavescens, 296, 489c, 570-571c gallinarum , 296, 489c, 570-571c hirae, 296, 489c, 570-571c malodoratus, 296, 488c, 570-571 c mundtii, 296, 489c, 570-57le pseudoavium , 296, 488c, 570-571c rajfinosus, 296, 488c, 570-571c saccharolyticus, 296, 489c, 570-571c sistemas de múltiples pruebas, 431 solitarius, 296, 489c, 570-571c sulfureus, 296, 489c, 570-571e Erwinia, 291, 677 amylovora, 160, 690c, 714c cacticida, 291 mallotivira, 714c persicinus, 291, 691c psidii, T i l e tracheiphila, l i l e Erysipelothrix, 73, 452, 490 rhusiopathiae, 8, 98, 192, 226, 437, 485c, 490, 532c,

537c tonsillarum, 490 Escherichia, 54, 83, 84, 92, 92c, 221, 291, 678 blattae, 206, 225, 291, 685c, 714c

Eubacterium aerofaciens, 492c, 556c, 558-559e biforme, 492c, 556c, 558-559c brachy, 492c, 556c, 558c combesii, 161, 492c, 556-559c contortum, 492c, 556c, 558-559c cylindroides, 492c, 556c, 558-559c dolichum, 492c, 556-559c eligens, 492c form icigenerans, 492c, 556c, 558-559c hadrum, 492c, 556c, 558-559c hallii, 493c, 556c, 558-559c lentum, 87, 490,493c, 554c, 556-558c limosum, 493c, 556c, 558-559c moniliforme, 493c, 556-559c nitritogenes, 493c, 556c, 558c nodatum, 490, 493c, 556c, 558-559c ramulus, 493c, 556c, 558-559c rectale, 493c, 556-559c saburreum, 493c, 556c, 558c siraeum, 493c, 556-559c

tenwe, 493c, 556-558c timidum, 493c, 556-559c tortuosum, 493c, 556c, 558-559c ventriosum, 493c, 556c, 558-559c Ewingella americana, 92c, 223, 225, 301, 678, 685c, 691c, 704-705c, 715c, 722-726c, 729-732c Exiguobacterium, 452, 491, 561-564c

F Falcivibño, 454, 494, 545c, 556-557c granáis, 54, 494e vagin*lis, 54, 494c Filifactor, 452 Flavimonas oryzihabitans, 8, 129, 151, 354, 581, 612c,

612, 647-648c, 656c Flavobacterium, 345, 354, 583, 612, 647-649c aquatile, 54, 613c, 649c, 655c branchiophilum, 54, 613c, 649c, 655c Francisella, 581, 613, 647c, 660c tularensis, 433, 613 Frateuria, 451 Fusobactcrium, 8, 14, 20, 237, 267, 428, 584, 614, 665-

669c alocis, 615c, 667-669e gonidaformans, 615c, 667c mortiferum, 8, 16, 20, 615c, 667-668c naviforme, 615c, 667c necrogenes, 8, 615c, 667-668c necrophorum, 261, 615c, 667c

844

índice 2 - Microorganismos

Fusobacterium (cont.) nucleatum , 433, 615c, 667c perfoetens, 615c, 667-669c periodonticum , 615c, 667-669c prausnitzii, 615c, 667c russii, 615c, 667-669c simiae, 615c, 667-669c suici , 615c, 667-669c ulcerans, 615c, 667-669c varium,668c, 725-726c

G Gardnerella vagin*lis, 177, 354, 434, 454, 494, 495c,

532c, 537c, 583, 614, 615c, 647-648c, 660c Gemella, 187, 453, 495, 569c, 583, 616, 664c haemolysans, 263c, 326, 380c, 495c, 616c morbillorum, 326, 380c, 495c, 616c Globicatella sanguis, 263c, 380c, 453, 495, 569c Gordonia, 454, 496, 532-534c, 561-564c, 568c

Grupo entérico “63”, 719c, 722c, 733-734c “64”, 695c, 702-703c “68”, 695c, 702-703c, 719c, 722-726c, 729-730c

H Haemophilus, 25, 31, 54, 114,206, 326, 344, 354, 368,

376, 378, 398, 406,422, 423, 582, 616, 647-648c, 660c actinomycetemcomitans, 423c, 617c, 659c, 663c aegyptius, 25 aphrophilus, 344, 423c, 616, 617c, 663c ducreyi, 54, 423c, 616, 617c, 663c haemoglobinophilus, 368, 423, 423c, 617c, 663c haemolyticus, 398, 406, 617c, 663c influenzae, 25, 206, 236, 243, 248, 249, 351, 378, 398,

406, 423, 423c, 424, 433, 434, 616, 617c, 663c biogrupo aegyptius, 398, 406 tipo b, 434 paracuniculus, 114, 206, 398, 423c, 617c, 663c paragallinarum, 344, 423c, 617c, 663c parahaemolyticus, 378, 398, 406, 423c, 617c, 663c parainfluenzae, 206, 236, 398, 406, 423, 423c, 424, 433, 617c, 663c paraphrophaem olyticus, 398, 406, 617c, 663c paraphrophilus, 617c, 663c parasuis, 344, 423c, 617c, 663c segnis, 344, 423c, 617c, 663c sistemas de multiples pruebas, 433, 434 Hafnia, 83, 92c, 206, 678 alvei, 19, 92, 113, 145, 225, 291, 411, 415, 419, 685c, 715c, 722c, 733-734c alvei biogmpol, 113,225,291,685c, 715c, 722c, 733-734c Helcococcus kunzii, 263c, 380c, 496, 569c Helicobacter, 345, 354, 582, 618, 665-666c cinaedi, 217, 326, 398, 618c, 665-666c fennelliae, 217, 326, 618c, 665c, 670c mustelae, 217, 326, 618c, 665-666c pylori, 143, 217, 326,405, 407, 434, 618c, 665-666c, 670c

Jonesia denitrificans, 454, 496, 497c, 532-535c, 561-

564c

K Kingella, 73, 206, 214, 354, 581, 619, 647c, 660c denitrificans, 54, 73, 128, 326, 345, 619c, 660c kingae, 54, 326, 345, 619c, 660c Klebsiella, 19, 58, 83, 84, 92c, 113, 128, 206, 214, 234,

291, 293c, 301, 304, 306, 397, 401,412, 414, 415,- . 419, 678 om ithinolytica, 206, 223, 397, 685c, 691c, 697c, 702703c oxytoca, 206, 223, 301, 397, 411, 685c, 691c, 697c, 702-703c planticola, 223, 397,411, 685c, 691c, 697c, 702-703c pneum oniae, 19, 20, 22 subesp. ozaenae, 113, 151, 223, 225, 291, 411, 685c, 691c, 697c, 702-703c, 715c, 722-724c, 733-734c pneum oniae, 120, 120c, 139, 151, 175, 211, 221, 223, 294, 301, 397, 401, 408, 411 685c, 691c, 697c, 702-703c, 704-705c rhinoscleromatis, 113, 151, 224, 225, 411, 685c, 691c, 697c, 702-703c, 704-705c, 715c, 722-724c terrigena, 223, 301, 411, 685c, 691c, 697c, 702-703c, 706-707c Kluyvera, 8, 83, 92c, 223, 291, 301, 678 ascorbata, 685c, 692c, 706-707c cryocrescens, 225, 685c, 692c, 699-700c, 706-707c, 708c, 715c, 722c, 722-726c, 733-734c Kocuria rosea, 288, 453 Kurthia, 73, 452, 497, 532-534c, 536c, 561 -562c gibsonii, 368, 497c sibirica , 368, 497c zopfii, 368,497c Kytococcus sedentarias, 288, 454

L Lactobacillus, 73, 452, 497, 532c, 537c, 545c, 554-556c,

558-559c, 561-564c, 569c, 576c acidophilus, 280, 498 r casei, 498c plantarum , 498c Lactococcus, 113, 187, 263c, 380c, 434,453,498, 569c garviae, 113, 499c lactis, 188c

subesp. cremoris, 499c holdniae, 499c hordniae, 113 lactis, 113, 499c piscium , 499c plantarum , 499c raffinolactis, 499c Lactosphaera, 453 Leclerica adecarboxylata, 8, 92c, 224, 291, 301, 678,

685c, 692c, 702-703c Legionella, 73, 81, 82, 83c, 87, 168, 177, 237, 306, 354,

J Janthinobacierium lividum, 345, 581, 618, 619c, 647-

648c, 660c

581, 619, 647c, 660c, 661c bozemanii, 79, 83c, 237 cincinnatiensis, 237 dumoffii, 83c, 88,620

Indice 2 - Microorganismos feelei, 168, 177, 237 gorm anii, 83c longbeachae , 83c, 237 m aceachcm ii, 237 micdadei, 83c, 168, 237, 620 nautarum, 168 oakridgensis, 83c, 306 pneum ophila, 73. 83c 88, 177 subesp. pneum ophila, 79, 81, 620 wadsworthii, 83c Leminorella, 192, 226, 678 grimontii, 92. 151, 301, 685c, 736c, 738c richardii, 92, 151, 301, 373, 685c, 736c, 738c Leptospira biflexa, 73, 81 interrogans, 73, 81 Leptotrichia buccalis, 584, 620c, 620, 665-668c Leucobacter, 453 Leuconostoc, 8, 18 187. 263c, 380c, 434, 452,499, 532c

537c, 569c cam osum , 500c citreum, 275. 500c gelidum, 500c lactis, 275. 500c mesenteroides, 275

845

laevaniformis, 192, 326, 502c M icrococcus, 73, 160, 284, 347, 354, 411,436, 453, 502,

561-562c, 568c luteus, 288, 359, 502c

Mac, 502c M itsuokella multiacidus, 582, 622c, 622, 665-668c M obiluncus, 385, 453, 503, 545c, 556-557c, 583, 622,

665-666c curtisii, 48

subesp. curtisii, 114, 177. 326, 503c, 623c, 665c, 670c holmesii, 114, 177, 326, 503c, 623c, 665-666c mulieris, 48, 114, 177, 326, 503c, 623c, 670c M oellerella wisconsensis, 92c, 224, 678, 685c, 692c, 702-

703c, 704-705C M oorellaospora, 452 M oraxella, 73, 129, 344, 345, 354, 581, 623, 647-649c,

660c, 661c atlan’ae, 326, 624c, 649c, 655c bovis, 73, 326, 623, 624c, 661c catarrhalis, 73, 128, 129, 137, 217 221 236, 243,

248, 249, 316c, 319, 319c, 326. 434, 624c, 664c

subesp. cremoris, 500c dextranicum, 500c mesenteroides, 500c pseudomesenteroides, 275, 500c Listeria, 8, 18, 33, 49, 54, 98, 187, 301, 411, 453, 500.

532-536c 561 564c 568-569c esquemas de diferenciación, 544c grayi, 54, 177 501c, 544c innocua, 43, 177, 501c, 544c ivanovii, 34. 43, 49, 177, 500, 501c, 544c monocytogenes, 33, 41, 43, 48, 49, 73, 160, 177, 192, 306, 310, 411, 437, 485c, 500, 501c, 544c seeligeri, 33, 42, 43, 48. 501c, 544c welshimeri, 42, 43, 501c, 544c

M M egamonas hypermegas. 354, 583, 621, 665-668c M egasphaera, 582 621 cerevisiae, 621 c elsdenii. 621 c hypermegas, 671c M elissococcus, 453 M ethylobacterium, 345, 354, 385, 581, 621, 647-649c,

660c, 661c extorquens, 622c fujisawaense, 622c mesophilicum, 622c organophilum, 622c radiotolerans, 622c rhodesiarium, 622c rhodium, 622c zatmanii, 622c M icrobacterium, 454, 501. 532-536c, 545c arborescens, 34, 192, 326, 502, 502c, 554-555c imperiale, 192, 326, 501, 502c, 554-555c lacticum, 192. 326, 502c laevaniformans, 554-555c

caviae, 217, 327c cuniculi, 327c lacunata, 624c, 661c lincolnii, 326, 624c, 661c nonliquefaciens, 624c, 661c osloensis, 326, 624c, 649c. 653c, 655c, 661c

ovi'i, 217, 327c. 624c, 649c, 653c, 664c Morganella, 92c, 397, 399, 679 rnorganii, 19, 54, 92, 113, 225, 234, 373, 401, 407

biogrupo 1, 120c, 225, 267. 362, 397, 402, 685c, 715c, 722c, 735c biogrupo 2, 121, 192, 225, 267, 362, 397, 402, 685c, 715c, 736c, 738c M om coccus cerebrosus, 345, 581, 624, 625c, 664c M ycobacterium, 79, 80, 151, 157, 187, 326, 398, 404, 454, 503, 532-534c africanum, 333c asiaticum, 82c, 333c avium, 79, 82c, 333c, 334 ¿ovis, 79, 82c, 404 celatum, 333c cepas de bacilos de Calmette-Giierin (BCG), 157 chelonae, 82c, 333c complejo intracellulare-avium, 404 flavescens, 82c, 333c fortuitum , 82c, 157, 326, 332, 333c, 404 gastri, 80, 82c, 333c genavense, 333c gordonae, 82c, 333c haemophilum, 82c, 333c kansasii, 79, 81, 82c, 326, 332, 333c, 404 leprae, 503 malmoense, 82c, 333c marinum, 82c, 333c, 404 nonchromogenicum, 82c p a t atuberculosis, 503 phlei, 82c reacciones de catalasa, 82c reducción de nitrato, 332, 333c scrofulaceum, 82c, 157, 404 shmoidei, 333c simiae, 82c, 333c

846

índice 2 - Microorganismos

M ycobacterium (cont.) smegm*tis, 82c szulgai, 82c, 326, 332, 333c terrae , 82c, 333c thermoresistible, 333c triviale, 82c, 333c tuberculosis, 79, 80, 82c, 87, 157, 326, 332, 333, 333c,

Ochrobactrum, 345, 580, 626, 647-648c anthropi, 354, 626, 627c, 649c, 650c, 652c, 654c Oenococcus, 452 Oerskovia. Véase Cellulomonas Oligella, 345, 354, 581, 627, 647-649c ureolytica, 397, 627, 627c, 649c, 650c, 652c, 653c, 654c,

334, 337, 404 ulcerans, 82c, 333c vaccae, 82c xenopi, 82c, 333c M ycoplasma, 624, 647-648c hominis, 267, 270, 409 mycoides, 267, 270 órale, 368 pneum oniae, 403 salivarium, 368 urealyticum, 397

ureihralis, 351, 397, 627c, 649c, 655c Oxalophagus, 453 Oxobacter, 452

655c, 660c, 661c

N Neisseria, 54, 73, 128, 137, 144, 151, 312, 326, 344, 345,

351, 581, 625 canis, 326, 327c, 626c, 664c cinerea, 434, 626c, 664c denitrificans, 626c, 664c elongata, 625, 626c, 664c

subesp. elongata, 73 glytolytica, 73 nitroreducens, 73 flavescens, 664c gonorrhoeae, 73, 84, 236, 243, 248, 249, 312, 316c, 317,

318, 319c, 326, 434, 625, 626c, 664c iguanae, 321c lactamica, 54, 73, 151, 155, 221, 312, 316c, 317, 319,

319c, 435, 625, 626c, 664c macacae, 626c, 664c meningitidis, 73, 84, 155, 312, 316c, 317, 318, 319c, 435,

625, 626c, 664c mwcora, 73, 326, 335c, 350, 625, 626c, 664c polysaccharea, 326, 626c, 664c pruebas de utilización de hidratos de carbono, 312 sicca, 335c, 626c, 664c sistemas de múltiples pruebas, 434 subflava, 626c, 664c biovar fla va , 335c perflava, 358 subflava, 335c weaveri, 327c Nesterenkonia halobia, 347, 453 Nocardia, 151,161,168,187,454,504,532-533c, 561-562c, 568c asteroides, 160, 168, 504c brasiliensis, 160, 168, 504c farcinia, 160c, 504c nova, 160, 504c otitidiscaviarum, 160, 504c transvalensis, 160, 504c Nocardioides, 454 Nocardiopsis, 151, 454

O Obesumbacterium proteus, 92c, 225, 679, 685c, 715c

Paenibacillus, 452, 504 alvei, 206, 505c macerans, 206, 505c polym yxa, 206, 505c Pantoea, 92c, 206, 679 agglomerans, 19, 54, 113, 160, 206, 224, 225, 291, 326,

362, 429, 685c, 692c, 699c, 701c, 702-703c, 704705c, 706-707c, 708c, 715c, 722c, 722-726c, 729730c, 735c anamatis, 692c dispersa, 54, 224, 225, 291, 692c, 715c Pasteurella, 326, 345, 354, 368, 397, 582, 627, 647-649c, 660c, 661c aerogenes, 397, 628c, 649c, 653c anatis, 628c, 649c, 653c avium, 628c, 661c bettyae, 627, 628c caballi, 627, 628c, 661c canis, 628c, 661c dagmatis, 206, 397, 628c, 661c subesp. séptica, 206 gallinarum , 628c, 661c haemolytica, 47, 206 langaa, 628c, 661c lym phangitidis, 326, 397, 628, 629c mairii, 397, 629c, 649c, 653c, 661c multocida, 47, 206, 211,649c, 653c, 661c subesp. gallicida, 206, 629c multocida, 206, 629c séptica, 629c pestis, 145 pneum otropica, 206, 397, 629c, 649c, 653c, 661c stomatis, 629c, 661c testudinis, 368, 629c, 649c, 653c, 661c trehalose, 685c,707c,71 le volantium, 629c, 661c Pastearía, 453 Pediococcus, 8, 18, 73, 114, 187, 263c, 380c, 452, 505, 569c acidilactici, 73, 114, 506c damnosus, 506c dextrinicus, 506c inopinatus, 506c párvulas, 506c pentosaceus, 73, 114, 506c urinaeequi, 506c Peptococcus niger, 87, 452, 507, 576c Peptostreptococcus, 54, 98, 206, 326, 397, 507, 576c, 582, 630, 671c anaerobias, 54, 507, 508c, 577c, 630, 630c

Indice 2 - Microorganismos asaccharolyticus, 54, 206, 507, 508c, 577c, 630,

630c esquemas de diferenciación, 577c hvdrogenalis, 54, 507 508c 577c, 630c indolicus, 54, 98. 206 326, 508c, 577c, 630c lacrimalis, 54, 507, 508c, 577c, 630c lactolyticus, 54, 397, 507, 508c, 577c, 630c m agnas , 54, 508c, 577c, 630c micros, 54, 508c, 577c, 630c prevotii, 54, 326, 397, 508c, 577c, 630c productus, 507 tetradius, 54, 397, 508c, 577c, 630c vagin*lis, 54, 507, 508c, 577c, 630c Peptostreptocococcus . 452 Photorhabdus luminescens, 160, 679, 718c Plesiomonas shigelloides 92c, 128, 151, 224, 306, 344, 679, 685c, 699 700c Porphymmonas, 583 665 668c asaccharolyticus, 206, 631 endodontalis, 206 gingivalis, 206 Pragia fontium , 151, 192, 225, 679, 685c, 716c, 736c Prevotella, 73, 244, 385, 583, 631, 665-668c bivia, 632c, 667-669c corporis, 206, 632c, 667-669c denticola, 206 disiens, 632c, 667-669c heparinolytica, 161 632c 667c intermedia, 206, 385 632c 667-669c /evil, 206 loescheii, 206. 632c, 667-668c melaninogenicus, 168, 206, 236, 244, 632c, 667-668c, 667-669c oralis, 236, 244, 632c, 667-668c m , 632c, 667-668c oulora, 73, 161, 385. 632c, 667c Propionibacterium, 33 48 87 161, 206, 282, 454. 508, 532-535c, 537c 545c, 561 564c, 569c, 576c acidopm pionici, 509c 554c, 556c, 558c acnés, 33, 161, 206, 267 275, 282, 508, 509c, 554c, 556c, 558c avidium, 161, 267, 275, 282, 509c, 554-555c freundenreichii, 509c, 554-555c gnm ulosum , 33, 267, 275. 282, 508, 509c, 554 555c jensenii, 509c, 554-555c, 558-559c lymphophilum, 509c, 554-556c, 558-559c propionicus, 267, 509c 554c, 556c, 558c thoenii, 509c, 554-555c Propioniferax, 454 Propionigenium, 584, 631 665 668c Proteus, 83. 84, 92, 92c. 113 121, 124, 192, 203. 204. 206, 362, 373, 397. 399, 400, 407, 679, 682c formas L, 408 inconstans, 19, 54, 206, 224, 225, 226, 267, 397. 686c, 693c, 702-703c, 716c, 722c, 735c mirabilis, 19, 54, 113, 145. 155, 160, 192, 224, 226, 397. 401, 402, 419, 685c, 709c, 711c, 736c, 738c myxofaciens, 54, 160, 224, 225, 226, 267, 397, 402, * 685c, 693c, 716c penneri, 54, 160, 192, 224, 225, 226, 267. 397, 402, 685c, 693c, 702 703c, 709c, 711c, 716c, 722c, 735c. 736c, 738c rettgeri, 19, 54, 92, 206 224, 225, 226, 234, 397, 402. 407. Véase también Providencia rettgeri

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stuartii, 401, 402, 407. Véase también Providencia stu artii vulgaris, 19, 54, 83, 120c, 121 145, 160, 165, 192, 201

206, 215, 224, 225, 226, 229, 267, 280, 358, 365, 397, 401, 402, 405, 685 709c 71 le, 736c, 738c Providencia, 54, 83, 84, 92. 92c, 113, 121, 215, 225, 267, 362, 397, 679 heimbachae, 397, 686c, 693c, 716c rettgeri, 685c, 693c, 702-703c, 716c, 722c, 735c. Véase también Proteus rettgeri rustigianii, 224, 397, 685c, 693c, 702-703c, 716c, 722c, 735c stuartii, 19, 217, 221, 224. 373, 397, 399, 685c, 693c, 702-703c, 717c, 722c, 735c. Véase también Proteus stuartii Pseudomonas, 113, 145. 151 187. 267, 337, 344, 351,

354, 385, 581. 632, 647 649c aeruginosa, 20, 84, 133, 142, 145, 172, 175, 211, 217,

226, 230, 260, 267, 273, 280, 331, 350, 359, 373, 405. 632, 634c, 649c. 650c, 651c, 740-741c alcaligenes, 634c, 649c, 654c aureofaciens, 172 cepacia, 113, 175, 260 chlororaphis, 172, 634c, 649c, 650c, 651c, 654c cichorii, 634c, 649c, 650c. 652c, 654c fluorescens, 160, 168. 172 260. 634-635c, 649c, 650c, 651c gelidicola, 635c, 649c 650c 651c. 654c maltnphilia, 151, 351 mendocina, 635c, 649c, 650c, 652c pseudoalcaligenes, 113, 635c, 649c, 650c, 651c, 652c putida, 160, 172, 635c, 649c, 650c, 652c, 654c saccharophila, 385, 635c, 649c, 650c, 651c, 654c stutzeri, 385, 635c, 649c, 650c, 652c syringae, 344, 635c, 656c viridiflava, 344, 635c. 656c Pseudonocardia, 454 Pseudoramibacter, 452 Psychrobacter, 345, 581, 633 immobilis, 634c

R R ahnella aquatilis, 92c, 224, 291, 362, 679, 686c, 693c,

704-705c Ralstonia, 345, 354, 581, 633, 647-649c pickettii, 635c. 649c, 650c, 652c, 654c, 660c, 661c Raihayibacter, 454 Rhodococcus, 454, 510, 532-533c 561-562c, 568c equi, 34, 42 Rochalimaea. Véase Bartonella Roseomonas, 345, 354, 385, 636 647-649c cervicalis, 636c, 649c, 654c fauriae, 636c, 649c, 650c

genomospecies, 636c, 649c, 650c, 652c, 653c, 655c gilardii, 636c, 649c, 654c, 656c Rothia dentocariosa, 453, 510c, 510, 532-535c, 561 564c Rubrobacter, 453 Ruminococcus, 452

s Saccharobacter, 679 Saccharothrix, 454

848

índice 2 - Microorganismos

Salmonella, 19, 83, 84, 92, 92c, 113, 151, 192, 202, 203,

221, 224, 225, 291, 337, 680, 682c bongori, 151, 686c, 737c, 738c choleraesuis , 204, 291 serovar choleraesuis, 225, 686c, 717c, 722c, 733-734c, 738c gallinarum, 113, 125, 204, 686c, 737c, 738c, 739c paratyphi A, 204, 225, 686c, 717c, 722-728c, 737c, 738c pullorum , 204, 686c, 737c, 738c, 739c typhi, 686c, 738c, 739c subesp. arizonae, 121, 151, 155, 201, 224, 291, 360, 686c, 709c, 711c, T i l e , 738c, 739c choleraesuis, 686c 737c, 738c, 739c diazonae, 151, 224, 291 686c, 709c, 711c, 738c, 739c houtenae, l i l e , 738c indica, 709c, 711c, 737c, 738c, 739c salamae, 291, 686c, l i l e , 738c, 739c enteritidis, 680 indica, 224 pullorum , 202, 235 npfti, 113, 120c, 203, 233, 682c, l i l e typhimurium, 120c, 201 Sarcina, 452, 510, 576c maxima, 54, 511c ventriculii, 54, 511c Selenomonas, 161, 192, 582, 636, 665-666c, 670c acidominovorans, 161, 637c, 665-666c artemidis, 637c, 665-666c dianae, 637c, 665-666c flueggei, 637c, 665-666c ¡acticifex, 637c, 665-666c noxia, 637c, 665-666c ocidaminococcus, 665-666c ruminatum, 192, 637c, 665-666c sputigena, 637c, 665-666c Serrada, 19, 83, 84, 92, 92c, 128, 134, 145, 160, 206, 267, 291, 326, 412, 680 producción de DNasa, 134, 145 entom ophila, 224, 225, 686c, 693c, 717 ficaria, 224, 225, 686c, 693c, 702-703c, 704-705c, 717c, 722-726c, 729-730c fo n d eó la , 128, 134, 224, 267, 291, 686c, 693c, 699c, 701c, 706-707c grimesii, 224, 225, 686c, 694c, 706-707c, 717c, 722c, 733-734c marcescens, 133, 134, 139, 142, 224, 225, 686c, 694c, 706-707c, 717c, 722c, 733-734c odorífera, 224 biogrupo 1, 686c, 694c, 699c, 701c, 706-707c, 717c, 722c, 733-734c 2, 686c, 694c, 702-703c, 704-705c plym uthica, 224, 225, 686c, 694c, 702-703c, 704-705c, 717c, 722-726c, 729-732c proteamaculans, 92, 224, 225, 694c, 706-707c, 717c, 722c, 733-734c subesp. proteamaculans, 128, 165, 686c rubidaea, 224, 291, 686c, 694c, 702-703c, 704-705c Shewanella, 345, 354, 582, 637, 647-649c, 650c, 651c, 652c benthica, 226 hanedai, 226 putrefaciens, 20, 129, 192, 226

Shigella, 83, 84, 92c, 113, 151, 221, 225, 301, 680, 682c,

685c boydii, l i l e , 722-726c, 729-732c dysenteriae, l i l e , 722-726c, 729-732c

/Zrrneri, 201, 230, 717c, 722-726c, 729-732c sormei, 19, 113, 151, 718c, 722-728c Skermania, 454 Sphingobacterium multivorum 326 spiritivorum, 128, 326 thalpophilum, 326 Sphingomonas, 345, 354, 580, 638, 647c, 660c, 661c parapaucimobilis, 192, 638c, 661c paucim obilis, 8, 128, 192, 638c, 661c Sphinx multivorum, 128 Sporohalobacter, 452 Staphylococcus, 54, 73, 85, 98, 167, 168, 187, 261, 284,

347, 354, 368, 374, 375, 381, 411, 419,453, 511, 561564c, 569c arlettae, 54, 514c, 516c «ureas, 87, 105, 217, 436, 437 subesp. anaerobius, 73, 98, 98c, 511, 512-513c áureas, 34, 54, 79, 98, 98c, 108, 109, 128, 129, 133, 136, 139, 140, 141, 144,147, 160, 165,168, 236, 248, 249, 254, 261, 267, 270, 272, 284, 286, 288, 308, 359, 368, 372, 374, 403, 412, 511, 512-513c auricularis, 514c, 516c beta-lactamasa, 243, 249 capitis, 289 subesp capitis, 514c, 516c ureolyticus, 514c, 516c caprae, 514c, 516c cam osus, 147, 518c, 520c caseolyticus, 347, 511, 518c, 520c chromogens, 518c, 520c cohnii, 286 subesp. cohnii, 514c, 516c urealyticum, 514c, 516c delphini, 98c, 518c, 520c epidermidis, 128, 129, 133, 136, 139, 140, 144, 147, 160, 168, 272, 288, 289, 372, 374, 429, 436, 437, 511, 512-513c equorum, 518c, 520c felis, 518c, 520c gallinarum , 518c, 520c haemolyticus, 286, 289, 381, 511, 512-513c hominis, 286, 289, 372, 437, 515c, 517c hyieus, 98c, 109, 374, 519c, 521c intermedius, 98, 98c, 109, 374, 381, 519c, 521c kloosii, 519c, 521c lentus, 347, 51.1 ^519c, 521c lugdunensis, 98, 98c, 381, 437, 511, 512 513c lutrae, 511 muscae, 519c, 521c pasteuri, 515c, 517c pisciferm entans, 519c, 521c producción de DNasa, 133, 144 saccharolyticus, 73, 511, 515c, 517c saprophyticus, 248, 286, 288, 354, 372, 374, 429,436, 437 subesp. saprophyticus, 511, 512-513c schleiferi, 374, 381

Indice 2 - Microorganismos 849 subesp. coagulans, 98, 98c, 512-513c, 515c, 517c schleiferi, 98, 98c, 437, 512-513c, 515c, 517c sciuri, 347, 511, 519c, 521c sim ulans , 147, 286, 515c, 517c

sistemas de múltiples pruebas, 436 vitulus, 347, 511, 519c, 521c warneri, 289, 515c, 517c xylose, 54, 286, 375, 515c, 517c Stenotrophom*onas, 354, 581, 638, 647-648c maltophila, 122, 129, 151, 639c, 656c Stomatococcus mucilaginosus, 160, 436, 453, 522c, 522, 561-564c, 569c Streptobacillus moniliformis, 584, 639c, 647c, 660c Streptococcus, 8, 25, 47, 67, 73, 74, 85, 87, 145, 177, 187, 263c, 385, 453, 522, 569c acidominimus, 188, 188c, 526c, 574c, 575c agalactiae, 6, 33, 41, 177, 183, 187, 188, 188c, 383, 524c, 526c, 572c, 574c alactolvticus, 526c, 574c avium, 299 bovis, 22, 188c, 275, 299, 383, 385, 411, 526c, 575c canis, 524c, 572c constellatus, 18 cricetus, 7, 526c, 575c downei, 7, 526c, 575c dysgalactiae

subesp.

sistemas de múltiples pruebas, 438 sobrinas, 527c, 575c suis, 525c, 527c, 572c, 574-575c thermophilus, 527c, 575c

ufeerá, 18, 188, 188c, 527c, 575c vestibularis, 398, 527c, 575c viridans, 339, 341, 398, 411 Streptomyces, 151, 161, 168, 187, 454 Succinivibrio dextrinosolvens, 354, 582, 640c, 640, 665c,

665 666c, 670c Succinomonas amylolytica, 583, 665-668c Suttonella indologenes, 206, 214, 215, 345, 354, 581, 640,

641c, 647c, 660c Syntrophospora, 452

T Tatumella ptyseos, 92c, 224, 225, 362, 680, 681, 686c,

695c, 704-705c, 718c, 722c, 735c Taylorella equigenitalis, 345, 354, 581, 641c, 641, 665c Terrabacter, 454 Tetragenacoccus, 263c, 380c, 453 Thermoanae obacter, 452 Tissierella, 582, 641, 665-666c Trabulsiella, 680 Tsukamurella, 454, 523, 532-534c, 537c, 561-563c, 568-

569c Turicella otitidis, 33,454, 528c, 528, 561-563c, 568c

dysgalactiae, 188, 188c, 526c, 575c equisimilis, 524c, 572c, 572-573c equinas, 275, 299, 526c, 575c

ei?¡«, 524c, 572-573c subesp. e

TERCERA EDICIÓN Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica - PDFCOFFEE.COM (2024)

References